BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ Sphingomonas paucimobilis
ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm
TS. Trần Thị Mai

Phản biện 1: PGS. TS. Trần Đình Mấn
Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn La Anh
Phản biện 3: PGS. TS. Dương Văn Hợp

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường
họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Vào hồi ….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:


Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S.
paucimobilis lựa chọn; Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan
của chủng S. paucimobilis lựa chọn; Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo
quản, chế biến thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu
1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao: Đánh giá khả năng sinh tổng hợp
gellan của chủng S. paucimobilis GL4; So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng
S. paucimobilis GL4 và S. paucimobilis GL12.
2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn: Tối ưu hóa điều kiện sinh
tổng hợp gellan trên bình tam giác; Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên
men 10 lít; Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột; Nghiên

1


cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm; Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng
S. paucimobilis lựa chọn.
3. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men của chủng S. paucimobilis: Xác định
điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl; Xác định điều kiện tách chiết
và sấy kết tủa gellan khử acyl; Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl; Đề
xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl.
4. Đánh giá chất lượng các chế phẩm: Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S.
paucimobilis; Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl.
5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl: Ứng dụng chế phẩm gellan
trong tạo màng bao bảo quản chuối; Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất
thạch.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1. Về khoa học: Luận án là một nghiên cứu có hệ thống từ lựa chọn chủng giống, đến sinh
tổng hợp, thu hồi và khai thác khả năng ứng dụng gellan, cũng như chuyển hóa gellan thành

1.1. Thông tin chung về gellan và gellan khử acyl bao gồm 04 tiểu mục: 1.1.1. Cấu tạo;
1.1.2. Tính chất; 1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel và mục
1.1.4. Sphingomonas paucimobilis: giới thiệu chung về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa,
cơ chế sinh tổng hợp gellan và động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan.
1.2. Tình hình nghiên cứu thu nhận gellan và gellan khử acyl bao gồm 03 tiểu mục:
1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp gellan, phần này đề cập đến các vấn đề về
giống, tuổi giống, tỷ lệ giống, thành phần môi trường, nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí cho
quá trình lên men; 1.2.2. Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men; 1.2.3. Chuyển hóa
gellan thành gellan khử acyl.
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng gellan và gellan khử acyl bao gồm 03 tiểu mục:
1.3.1. Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây; 1.3.2. Ứng dụng trong chế biến thực
phẩm; 1.3.3. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác.
1.4. Vấn đề cần nghiên cứu của luận án mục này điểm qua những kết quả nghiên cứu đã
có trước để đưa ra những định hướng và nội dung nghiên cứu cụ thể cho luận án.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Hai chủng S. paucimobilis GL4 và GL12 nhận được từ bộ sưu tập giống của Bộ môn
Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch-Viện Cơ điện NN và Công nghệ STH. Chủng
S. paucimobilis GL12 đã được kiểm nghiệm về độ an toàn chung và khả năng gây tan huyết
đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho ứng dụng trong chế biến thực phẩm.
- Chuối tiêu được trồng tại Đông tảo, Khoái Châu, Hưng Yên vụ 2017.
2.2. Phƣơng pháp phân tích
Xác định hàm lượng gellan và gellan khử acyl theo (Horace G., 1993). Phân tích cấu
trúc gellan và gellan khử acyl theo phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân MNR (Fialho
A. M., 1999). Xác định khối lượng phân tử của gellan theo Gong Y., (2009) và Masuelli A.
M., (2014) thông qua việc xác định độ nhớt thực của dung dịch. Xác định mức độ deacyl hóa
của gellan khử acyl qua phân tích phổ IR theo BaxterA., (1992). Xác định độ bền gel của
gellan khử acyl bằng máy phân tích cấu trúc Texture Analyzer TA.XT2 (Anh) theo Mao R.,
(2000). Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của gellan như khả năng tạo gel (Bajaj B.I.,

- Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl: xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan
khử acyl theo Nampoothiri M. K., (2003); xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử
acyl; xác định điều kiện sấy và bảo quản chế phẩm gellan khử acyl.
Mức độ deacyl hóa của mẫu được tính theo công thức sau:
ĐĐA = 100 -

xa

Trong đó: h1720 và h3400 là chiều cao các đỉnh phổ tại bước sóng 1720 và 3400 cm-1 đặc trưng
cho các nhóm carbonyl và nhóm - OH trong phân tử gellan và a là hệ số thực nghiệm.

4


- Nghiên cứu ứng dụng gellan tạo màng bao trong bảo quản chuối: xác định công thức
dung dịch tạo màng gellan theo Rojas G. M. A., (2007); xác định một số đặc tính của dung
dịch tạo màng gellan như xác định hàm lượng chất khô, thời gian khô của màng, thời hạn sử
dụng dung dịch tạo màng, độ bám dính của màng, tính thẩm thấu hơi nước của màng, mức độ
ngăn cản trao đổi khí được tiến hành theo Nguyễn Duy Lâm (2011).
- Nghiên cứu ứng dụng gellan khử acyl trong chế biến thạch dứa: xác định hàm lượng
gellan khử acyl thích hợp cho công thức thạch; đánh giá cảm quan và độ ổn định của sản phẩm).

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao

Từ kết quả ở bảng 3.1. rút ra, trong điều kiện khảo sát chủng S. paucimobilis GL12 có
khả năng sinh tổng hợp gellan cao hơn chủng S. paucimobilis GL4. Hơn thế chủng
S.paucimobilis GL12 đã được đánh giá là chủng an toàn, bước đầu đảm bảo cho các sản
phẩm của chúng được ứng dụng trong chế biến thực phẩm (Nguyễn Thị Hồng Hà., 2015).
Do vậy, chủng S. paucimobilis GL12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo của luận án.


28,7

3.2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12
3.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan
3.2.1.1. Ảnh hưởng của nitơ
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy khi bổ sung nguồn nitơ là trypton, hàm lượng gellan đạt
cao nhất là 22,7 g/l. Tuy nhiên, với nguồn nitơ là bột đậu tương cũng cho sản lượng sinh tổng
hợp gellan khá cao đạt 21,9 g/l. Điều này có thể do bột đậu tương có hàm lượng protein cao
(khoảng 40%) và chứa nhiều tryptophan là một axit amin cũng được chứng minh như một
tiền tố làm tăng khả năng sinh tổng hợp gellan (Hyuck J., 2003). Bajaj B. I., (2006) khi bổ
sung tryptophan ở nồng độ 0,05% vào môi trường lên men đã tăng được sản lượng gellan lên
tới 39,5 g/l.

5


Bảng 3.2. Ảnh hưởng các nguồn nit đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12

Nguồn nitơ (%)

Hàm lƣợng gellan (g/l)

Pepton (0,6)

19,6b ± 0,61

Trypton (0,6)

22,7a± 0,40

20
15
10
5
0
1.50

1.75

Nồng độ bột đậu tƣơng (%)

Hình 3.1. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tư ng đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12

3.2.1.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin
Các thí nghiệm được thử nghiệm với 4 loại axit amin với tỷ lệ bổ sung 0,05 %. Kết quả
thử nghiệm đã xác định được L-threonine là axit amin thích hợp nhất cho sinh tổng hợp gellan
(đạt 24,3 g/l với liều bổ sung 0,05%). Việc bổ sung L-threonine được cho là làm tăng sự biểu
hiện của một số enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp gellan do vậy dẫn đến làm
tăng sản lượng gellan (Nampoothiri M. K., 2003).
Nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan thu
được ở hình 3.2. đã khẳng định lại khả năng sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất khi môi
trường được bổ sung L-threonine 0,05%.

6


Axit amin

Hàm lƣợng gellan
30

24.3

24.5

0.05

0.07

20
15
10
5
0
0.01

0.03

Tỷ lệ L- threonine (%)

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các axit amin

Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine

3.2.1.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2
Động học phát triển của chủng S. paucimobilis GL12 cho thấy chủng sinh trưởng mạnh
nhất từ giờ thứ 6 đến 24 giờ. Theo thời gian lên men, với việc tăng sinh khối, đồng thời
lượng gellan được tích lũy quanh tế bào cũng tăng lên, kéo theo giảm hiệu quả cấp oxy cho
tế bào. Để khắc phục hiệu ứng này, tiến hành các thử nghiệm bổ sung thêm H2O2 vào dịch
lên men dựa trên sự chuyển hóa H2O2 thành O2. Tuy nhiên, nồng độ H2O2 quá mức lại là một
trong những tác nhân gây tổn thương tế bào vi sinh vật, dẫn đến việc ức chế sự phát triển của


Hàm lƣợng gellan
(g/l)

ĐC

0, 0, 0, 0

3,95 ± 0,36bc

20,1 ± 0,96b

CĐ1

4, 3, 2, 2

3,97 ± 0,26c

20,1 ± 0,148b

CĐ2

3, 4, 2, 2

4,12 ± 0,18ab

21,7 ± 0,84b

CĐ3


Chế độ

4

35

2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

3

30

2

25
20
15

1



Thời gian (giờ)

Hình 3.3. Động học quá trình sinh trưởng và tích lũy gellan của chủng S. paucimobilis GL12
(Mũi tên chỉ các thời điểm bổ sung H2O2 tương ứng với nồng độ 2, 2, 3, 4 mM)

8


3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác
Dựa trên cơ sở đã khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp
gellan từ S. paucimobilis GL12, đã xác định được mức độ tác động đơn lẻ của các yếu tố tới
sự sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12. Tuy nhiên, trong môi trường lên men các vi
sinh vật sẽ phải chịu tác động đồng thời của các yếu tố đó, đặc biệt ba yếu tố có giá trị ảnh
hưởng dương và lớn là glucose, bột đậu tương và L-threonine. Nhằm xác định được giá trị tối
ưu của các yếu tố này, phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box–Behnken đã được sử dụng
và đưa ra được phương trình hồi qui biểu diễn ảnh hưởng của ba yếu tố trên tới khả năng sinh
tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12 như sau:
Hàm lượng gellan (Y) = + 32,2 + 2,02X1 + 0,71X2 + 1,18X3 + 1,5X1X2 – 0,89X1X3 +
1,39X2X3 – 3,05X12 – 3,05 X22 – 1,12X32
với X1, X2 và X3 là các yếu tố glucose, bột đậu tương và L-threonine tương ứng
Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng
S. paucimobilis GL12. Kết quả tìm được giá trị hàm lượng gellan cao nhất theo lý thuyết đạt
từ 31,0 đến 32,96 g/l khi tổ hợp 3 yếu tố là nồng độ glucose: 3,6 %; bột đậu tương: 2,1 %; Lthreonine 0,06 %.
Tiến hành lên men thực nghiệm với các điều kiện vừa tìm được ở trên, kết quả hàm
lượng gellan thu được đạt (32,80 ± 0.85 g/l) nằm trong khoảng tin cậy trung bình 95% của
khoảng giá trị dự đoán theo lý thuyết. Những kết quả này xác nhận, kết quả lý thuyết và thực
nghiệm chênh trong giới hạn cho phép.
Dưới điều kiện tối ưu, chủng S. paucimobilis ATCC 31.461 sinh tổng hợp gellan với
hàm lượng 32,7 g/l sau 48 giờ lên men (Nampoothiri M. K., 2003). Cũng với chủng trên,

10
5
225

250

275

2

23

1.5

1

1
0.5
0

300

Thời gian (giờ)

Tốc độ khuấy(vòng/phút)

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy

4



* Xác định thời gian thu hồi gellan: Đồ thị biểu thị sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp
gellan của chủng vi khuẩn S. paucimobilis GL12 trong quá trình sinh tổng hợp gellan trên
bình lên men sục khí 10 lít với tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph và tốc độ khuấy 275 vòng/phút
được thể hiện ở hình 3.5. Kết quả phân tích cho thấy, đường cong sinh trường của chủng
nghiên cứu ở qui mô này cũng tương tự như ở qui mô bình tam giác, lượng sinh khối đạt cực
đại sau khoảng 30 giờ lên men. Gellan cũng được tích lũy ngay từ pha logarit, tăng dần theo
thời gian và đạt cực đại ở pha cân bằng (33,1 g/l ở 58 giờ). Mặc dù hàm lượng gellan thu
nhận ở quy mô bình sục khí không khác nhiều so với quy mô phòng thí nghiệm (32,8 g/l ở
66 giờ), nhưng thời gian thu nhận gellan đã rút ngắn được tới 8 giờ. Điều này có thể là do ở
hệ thống bình lên men việc kiểm soát tốc độ cấp khí tốt hơn cho quá trình tăng trưởng và duy
trì của vi khuẩn. Hơn nữa, lượng H2O2 bổ sung theo bậc vào môi trường lúc này có thế lại
đóng vai trò như một tác nhân gây sốc nhẹ để cảm ứng cho vi khuẩn tăng tiết nhanh gellan ra
bên ngoài bề mặt để bảo vệ chúng.
3.2.4. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men
3.2.4.1. Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối
Do đặc tính của chủng S. paucimobilis khi sinh trưởng phát triển sẽ tiết ra gellan bám
xung quanh tế bào để bảo vệ chúng khỏi các tác động bên ngoài. Do vậy, để tách gellan khỏi
sinh khối, dịch lên men cần được xử lý trước khi ly tâm.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào vi khuẩn

Nhiệt độ dịch lên men
(oC)
Không xử lý nhiệt (ĐC)
75
85
90
95
100


thử nghiệm kết tủa gellan với các dung môi ethanol, acetone và isopropyl alcohol theo tỉ lệ
dịch:dung môi là 1:3 (v/v). Kết quả ở hình 3.6A. cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan từ các
dung môi thử nghiệm là khá cao (trên 91%) và khác nhau không đáng kể, có lẽ vì gellan là
một polyme anion nên chúng kết tủa tốt với các dung môi phân cực. Tuy nhiên xét về hiệu
quả kinh tế và tính an toàn, ethanol sẽ là dung môi được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp
của luận án. West T. P., (2003) cũng đã chọn ethanol là dung môi để thu hồi gellan và nhận

30.9

30.6

30

80
60

25
91.5

94.2

20

93.3

15

40

10


76.2

25

62.5
30.7
25

30.9

20
15

20.5

10
5
2/1

Isopropyl
alcohol

94.2

1/1

Hàm lƣợng gellan (g/l)

30

tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/3 cho hiệu suất thu hồi đạt 94,2%. Ở tỷ lệ 1/2, hiệu suất thu
hồi gellan có thấp hơn nhưng không nhiều so với tỉ lệ 1/3 (hiệu suất đạt 93,6%). Khi giảm
lượng cồn xuống (ở các tỷ lệ 1/1 và 2/2) hiệu suất thu hồi gellan cũng bị giảm xuống nhiều
(tương đương 76,2% và 62,5%).

11


Từ các nhận xét trên, tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/2 sẽ được lựa chọn nhằm giúp tiết
kiệm đáng kể lượng ethanol tiêu hao mà vẫn đảm bảo được hiệu suất thu hồi gellan khá cao.
3.2.4.3. Loại màu khỏi kết tủa gellan
Do đặc tính của các chủng Sphingomonas sp trong quá trình sinh trưởng và phát triển
cũng thường tiết ra môi trường các sắc tố carotenoid màu vàng nên kéo theo các kết tủa gellan
cũng bị sậm màu nếu các sắc tố này không được loại ra trước đó (Xuechang W., 2011).
Dựa trên khả năng hòa tan của các carotenoid vào các dung môi hữu cơ, lặp lại các lần
kết tủa gellan với các dung môi này sẽ làm tăng được độ sáng màu cho kết tủa.
Trong phần này, tiến hành thí nghiệm với 500 ml dịch lên men sau khi đã tách sinh khối.
Ethanol 95o được sử dụng làm dung môi để kết tủa gellan với 4 lần kết tủa lặp lại. Kết quả
đánh giá hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu qua các lần kết tủa được cho ở bảng
3.6. Từ kết quả phân tích này và quan sát sự cải thiện độ trắng của kết tủa gellan (hình 3.7),
kết tủa lặp lại 3 lần sẽ được lựa chọn.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu

Số lần kết tủa

Lƣợng gellan

Hiệu suất thu Lƣợng carotenoid

Khả năng loại


91,7

0,0846

91,0

3

14,70

89,6

0,0867

93,2

4

14,61

89,1

0,0868

93,3

Dịch gellan sau lên men

Kết tủa lần 1

Kết tủa gellan + loại màu

89,6

Sấy

85,9

Toàn bộ quá trình

76,9

3.2.5. Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan
Trong quá trình sản xuất và phân phối hàng hóa, bao bì có chức năng bảo vệ sản phẩm
trong môi trường kín, ngăn cản độ ẩm không khí, tránh ánh sáng, tránh tác động của các lực
bên ngoài, giữ cho tính chất của sản phẩm được ổn định trong một thời gian nhất định. Vì
chế phẩm gellan có đặc tính hòa tan được trong nước, dễ bị hút ẩm nên việc lựa chọn loại bao
bì thích hợp để bảo quản chế phẩm là rất cần thiết. Sau khi khảo sát đặc tính của một số loại bao
bì 1 lớp và nhiều lớp (màng kép), độ ẩm của gellan bảo quản trong các loại màng này hầu như
không thay đổi so với khi mới đóng gói. Ở loại màng ghép thì màng có lá nhôm tránh ẩm tốt
nhất, điều đó đã chứng minh vai trò của lớp lá nhôm mỏng trong vật liệu tạo màng, có được
kết quả này là do ngoài các tính chất về độ bền hóa học, bền nhiệt độ, bền cơ học, màng
nhôm còn có một số tính chất mà các vật liệu khác không có được là tính chống khí, độ ẩm
và ánh sáng rất tốt. Xét về mặt kinh tế thì các loại màng ghép càng nhiều lớp giá càng đắt.
Do vậy, để phù hợp cho việc đóng gói sản phẩm được an toàn, đồng thời có hiệu quả kinh tế,
màng Al/PE được lựa chọn cho bảo quản sản phẩm gellan. Sau 06 tháng bảo quản gellan
đựng trong màng này vẫn có độ ẩm 6,51%.

13


Nghiền và bao gói

Chế phẩm gellan

Hình 3.8. Qui trình công nghệ thu nhận gellan từ S. paucimobilis GL12 trên hệ thống bình lên men 10 lít

3.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl
3.3.1. Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl
3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan
Để khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl của gellan, các thí nghiệm được tiến
hành trong môi trường kiềm ở một số giá trị pH khác nhau 8, 9, 10, và 11 với thời gian xử lý 8

14


phút. Các mẫu gellan khử acyl sẽ được đưa đi phân tích đánh giá mức độ deacyl bằng phương
pháp phổ hồng ngoại IR.
Trên các phổ hồng ngoại nhận được ở hình 3.9 đều xuất hiện các pic ở vùng 3400 và
1726 cm-1. Trong đó, pic ở khoảng 3400 cm-1 là dao động hóa trị đặc trưng cho các nhóm chức
OH- của chuỗi polysaccharide. Và pic xuất hiện ở khoảng 1726 cm-1 là dao động hóa trị đặc
trưng của các nhóm chức acyl, cường độ của các pic phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít của
các nhóm này.
Với các mẫu gellan chuẩn và gellan thu được từ S. paucimobilis GL12, phổ IR của chúng
xuất hiện đầy đủ hai pic hấp thụ ở 3400 và 1726 cm-1 với cường độ khá mạnh (hình 3.9a và
3.9b). Với phổ IR của các mẫu gellan khử acyl, cũng xuất hiện pic ở hai băng sóng này, tuy
nhiên cường độ pic ở khoảng 1726 cm-1 đều bị giảm và có sự khác nhau theo mỗi điều kiện
khử acyl (hình 3.9c và 3.9d). Khi tăng độ kiềm của phản ứng đồng nghĩa với việc tăng mức độ
deacyl, do đó khi xử lý ở pH 10 nhận thấy độ lớn của pic ở vùng 1726 cm-1 có giá trị nhỏ hơn
so với khi xử lý ở pH 9.
100


1725.63cm-1

1616.93cm-1

3421.13cm-1

3500

3000

1027.02cm-1

2500

2000

1750

1500

1250

1000

750

500450

cm-1

86
1611.42cm-1

1231.53

84
82
3399.48cm-1

80
79
4000

3500

3000

1032.28cm-1

2500

2000

1500

1000

500450

cm-1


10

82

Gel chắc, giòn

11

84

Gel chắc, giòn

Đặc tính gel
Gel mềm

Thực nghiệm cho thấy, khả năng deacyl phụ thuộc nhiều vào pH xử lý. Khi xử lý ở pH
8 (nhiệt độ 80°C, trong 8 phút), mức độ deacyl gần như không đáng kể, sản phẩm thu được
từ phản ứng này cho gel có các tính chất gần với gellan (gel mềm, đàn hồi). Khi tăng mức độ
kiềm lên đạt pH 9, thu được sản phẩm có độ deacyl ở khoảng 65%, tạo gel nhão, yếu. Xử lý
ở pH 10, sản phẩm nhận được có độ deacyl 82%, cho gel chắc, giòn. Khi tăng đến pH 11
mức độ deacyl cải thiện không đáng kể (đạt 84%). Như vậy, việc thay đổi pH có thể nhận
được các sản phẩm có độ deacyl khác nhau và với mỗi sản phẩm nhận được có thể sử dụng
để tạo gel có tính chất khác nhau từ mềm, đàn hồi tới cứng và giòn. Đặc tính khác nhau của
gel nhận được từ các sản phẩm gellan khử acyl có thể được giải thích do sự thay thế nhóm
acyl đã làm giảm liên kết hydro nội phân tử, làm giảm cấu trúc xoắn cuộn của gellan dẫn đến
khả năng hút ẩm giảm, tăng độ cứng và độ giòn cho gel.
3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl
Nhằm tìm ra thời gian thích hợp cho phản ứng deacyl, tiến hành khảo sát thời gian
deacyl ở điều kiện môi trường kiềm có pH 10, ở nhiệt độ 80 oC, độ deacyl hóa của sản phẩm

80

96
816.43

60

94

897.53
611.80cm-1

60

92
1723.50

%T

Độ deacyl-ĐĐA (%)

100

40

90

1297.00

2926.72cm-1

4000

Thời gian phản ứng (phút)

1155.83

3388.20cm-1

3500

3000

1038.89cm-1

2500

2000

1750

1500

1250

1000

750

500450


89.3

89.9

35
30

71.9
25

58.2
29.3
23.58

29.48

20
15

19.09
10
5
2/1

1/1

Hàm lượng gellan khử acyl (g/l)
Hiệu suất thu hồi gellan khử acyl (%)

Hàm lƣợng gellan khử acyl (g/l)

3.3.3. Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl
Kế thừa các kết quả nghiên cứu về phương pháp sấy đối lưu cho gellan ở phần trên,
trong phần này, kết tủa gellan khử acyl cũng được sấy theo phương pháp này với chế độ sấy
như sau: sấy ở nhiệt độ 80oC, tốc độ thổi khí 1 m/s, độ dày khối sấy là 5cm. Sau 24 giờ thu
được sản phẩm đem đi nghiền thành bột, đóng gói kín. Kết quả phân tích ở bảng 3.9. cho
thấy, hiệu suất thu hồi của quá trình sấy đạt 85,6 % cho sản phẩm có độ ẩm 6,45%, chế phẩm
phẩm có dạng bột mịn, màu trắng sáng, mùi thơm nhẹ.
Từ những kết quả trên, có thể tóm tắt hiệu suất quá trình thu hồi chế phẩm gellan khử
acyl dạng bột từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12, khi đó hiệu suất tổng đạt
76%, chế phẩm có độ ẩm đạt 6,5%, độ deacyl 86% (Bảng 3.10).
Bảng 3.9. Xác định hiệu xuất sấy thu hồi gellan khử acyl

Lần sấy

Lƣợng gellan

Hiệu suất

Độ ẩm

khử acyl (g)

thu hồi (%)

(%)

Ban đầu

200,0


171,2

85,6

6,45

Bảng 3.10. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan khử acyl từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12

Hiệu suất (%)

Các công đoạn
Dịch nổi

100

Khử acyl + kết tủa

89,3

Sấy

85,6

Toàn bộ quá trình

76,0

Từ những kết quả thu được ở này, qui trình khử acyl được đề xuất theo hình 3.14:

18

3.4. Đánh giá chất lƣợng thuộc tính chế phẩm
3.4.1. Đánh giá chất lƣợng gellan
3.4.1.1. Xác định cấu trúc gellan của chủng S. paucimobilis GL12
Cấu trúc phân tử gellan được xác định theo phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân
NMR. Theo đó, phổ một chiều NMR của mẫu gellan chuẩn được xác định sau đó làm cơ sở
để so sánh với số liệu phổ NMR của mẫu thí nghiệm.
Kết quả so sánh phổ một chiều - 1H của gellan chuẩn (TN0) và gellan thu được từ
chủng S. paucimobilis GL12 (TN2) trên hình 3.15. cho thấy sự tương đồng về các tín hiệu
cộng hưởng từ proton ở tất cả các vị trí như vị trí nhóm metyl (CH 3) của đường rhamnose,
gốc acetate, các proton anomer của các đơn vị đường. Trong đó, quan sát dễ dàng nhất là tín
hiệu của các nhóm methyl trong gốc acetate và trong đơn vị đường rhamnose. Sự tương
đồng về tỷ lệ tích phân giữa tín hiệu của nhóm methyl trong gốc acetate và nhóm methyl
trong đơn vị đường rhamnose (tỉ lệ khoảng 1:2.1) cũng cho phép dự đoán hàm lượng acetate
của gellan nhận được từ chủng S. paucimobilis GL12 là giống với gellan chuẩn.
19


A. Phổ 1H – NMR của gellan chuẩn

B. Phổ 1H – NMR của gellan từ S. paucimobilis GL12

Hình 3.15. So sánh phổ proton của gellan chuẩn (TN0) và gellan từ S. paucimobilis GL12 (TN2)

3.4.1.2. Xác định khối lượng phân tử gellan
Theo phương pháp của Gong Y., (2009) và Masuelli A. M., (2014), muốn xác định
được khối lượng phân tử gellan thì cần tính độ nhớt rút gọn của gellan, từ đó xây dựng được
mối tương quan giữa độ nhớt rút gọn và nồng độ của dung dịch mẫu, từ đây đưa giá trị x = 0
sẽ tìm được độ nhớt đặc trưng của gellan. Thông qua phương trình Mark-Howink sẽ tính ra
được khối lượng phân tử gellan.
Từ thực nghiệm ở hình 3.16. cho thấy, chế phẩm gellan được sinh tổng hợp từ


0.06

Nồng độ dung dịch gellan (C %)

Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn mối tư ng quan giữa độ nhớt rút gọn và nồng độ gellan

20


3.4.1.3. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan
Để đánh giá chất lượng chế phẩm, tiến hành đánh giá chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và
vi sinh vật, theo kết quả phân tích sản phẩm tại khoa Hóa Học - Trường đại học Khoa Học
Tự Nhiên, Bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm và Bộ môn
Nghiên cứu Công nghệ sinh học STH - Viện cơ điện NN và CNSTH thu được, chế phẩm bột
gellan được đóng trong túi Al/PE với trọng lượng 50g/túi. Chế phẩm có thể bảo quản tại nhiệt
độ phòng, tránh ánh sáng trực tiếp. Chế phẩm gellan có độ ẩm 6,64 %; Độ nhớt của dung dịch
1% ở 25oC là 2837 Cp. Nhiệt độ bắt đầu tạo gel ≥ 750C, gel mềm và đàn hồi, khả năng tạo gel
với ion Ca+2 và ion Na+ là 100% hạt gel tạo ra bền vững. So sánh kết quả chỉ tiêu lý hóa,
phân tích kim loại nặng và vi sinh vật thì chế phẩm gellan thu nhận từ S. paucimobilis GL12
đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép của gellan thương mại công bố (Bajaj B.I., 2007).
Từ những kết quả phân tích trên cho thấy, sản phẩm gellan thu từ S. paucimobilis GL12
có cấu trúc, khối lượng phân tử và các đặc tính hóa lý gần tương tự với các chế phẩm gellan
công bố trên thị trường. Kết quả này cũng cho thấy, mặc dù có một số thay đổi về thành
phần môi trường lên men và điều kiện cấp oxi so với những điều kiện tìm ra trước của đề tài
(Nguyễn Thị Hồng Hà., 2005) nhưng chế phẩm gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 vẫn
mang những đặc tính tương tự.
3.4.2. Đánh giá chất lƣợng gellan khử acyl
3.4.2.1. Xác định cấu trúc gellan khử acyl
Cấu trúc của gellan khử acyl được thu nhận từ chủng S. paucimobilis GL12 được xác đinh

ngày, tăng gấp 2 lần so với đối chứng. Tỷ lệ hao hụt của chuối sau 18 ngày bảo quản là 5,34
%; độ cứng của quả đạt 2,84 kg/ cm2; độ sáng vỏ quả là 56,22. Chuối được bảo quản bằng
màng bao gellan có màu vàng đẹp, vỏ bóng tươi, ruột quả cứng, vị ngọt, thơm ngon. Phiếu
đánh giá cảm quan đều kết luận chuối bảo quản có hình thức quả đẹp, vị ngon, đạt yêu cầu bán
ra thị trường đạt 100%.

A. Chuối được phủ màng
gellan

CT1 CT2 CT3 CT4
CT3
CT4
B. Theo dõi chuối thí
nghiệm

C. Mẫu đối chứng
(Sau 9 ngày)

D. Mẫu chuối được bảo
quản màng gellan theo
CT3(sau 18 ngày)

Hình 3.18. Một số hình ảnh bảo quản chuối từ màng bao gellan (nhiệt độ bảo quản 22oC)

3.5.2. Ứng dụng gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa
Do có khả năng tạo được dạng gel cứng, giòn và bền trong môi trường có pH thấp (dưới 4)
nên trong phần này chế phẩm gellan khử acyl được sử dụng để bổ sung vào công thức thạch dứa
thay thế cho chất tạo gel agar. Thử nghiệm đã tìm được tỷ lệ bổ sung gellan khử acyl thích hợp là
0,6%, thời gian tạo gel diễn ra nhanh chóng, thạch thu được có độ trong suốt, độ giòn cao, khối
thạch chắc, không chảy nước, giữ được mùi vị đặc trưng. Sau 03 tháng bảo quản, thạch vẫn giữ được

17.8

Thời gian tạo gel nhanh, tạo khối chắc, không chảy nƣớc,
thạch trong suốt, giữ đƣợc mùi vị đặc trƣng

0,65

15.7

Tạo gel nhanh, thạch hơi đục, giòn, có mùi vị đặc trưng

0,70

10,6

Tạo gel nhanh chóng, thạch đục, cứng, nhưng vẫn giữ được
mùi vị đặc trưng

A.Thạch dứa bổ sung 1,4% agar

B. Thạch dứa bổ sung 0,6% gellan

Hình 3.19. Hình ảnh mẫu thạch dứa thu được khi sử dụng agar (A) và khi sử dụng gellan (B)

23