MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Xuất phát từ nhu nâng cao giá trị kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi
trƣờng do phế liệu ngành ngành chế biến tôm mang lại, cần tạo ra các
sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu tôm. Một trong những sản
phẩm đƣợc tạo ra từ chitin phế liệu tôm là N- acetylglucosamine (hay
NAG), có tiềm năng chữa bệnh nhƣ viêm khớp, viêm dạ dày,... Ngoài
ra NAG còn có đặc tính chống ung thƣ và đƣợc dùng trong chữa trị
bệnh tự miễn dịch. So với phƣơng pháp sản xuất NAG từ chitin bằng
phƣơng pháp hóa học thì sản xuất NAG bằng chitinase từ vi sinh vật
có nhiều ƣu điểm nhƣ thân thiện môi trƣờng, tạo sản phẩm tự nhiên
không chứa các dƣ lƣợng chất hóa học. Các nghiên cứu về thu nhận
NAG từ chitin bằng chitinase từ vi sinh vật còn khiêm tốn và chƣa
đầy đủ, đặc biệt là quá trình tinh sạch NAG. Do đó chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Nacetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum
20B định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”
2. Mục tiêu nghiên cứu:
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ
Penicillium oxalicum 20B.
- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm
chitinase kỹ thuật.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật.
- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase
kỹ thuật nhận đƣợc.
- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hƣớng tới ứng dụng
vào thực phẩm chức năng.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
* Ý nghĩa khoa học: Là công trình nghiên cứu có hệ thống về điều
kiện lên men sinh tổng hợp, thu nhận chế phẩm enzym chitinase có

1.1.1. Các đặc tính của N- acetylglucosamine
1.1.2. Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng
1.1.3. Các phƣơng pháp sản xuất N- acetylglucosamine
1.1.3.1. Phƣơng pháp hóa học
1.1.3.2. Phƣơng pháp chuyển hóa sinh học
1.1.3.3. Phƣơng pháp enzym
1.2. CHITIN
1.2.1. Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin
1.2.2. Nguồn thu nhận chitin
1.3. CHITINASE
1.3.1. Hệ chitinase
1.3.2. Đặc tính sinh hóa
1.3.3. Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG
1.3.4. Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG
1.3.4.1. Các giải pháp tiền xử lý chitin
1.3.4.2. Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase
1.4. SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT
1.4.1. Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase
1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.4. Ảnh hƣởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase
2


1.4.5. Ảnh hƣởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.7. Ảnh hƣởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.8. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc và cƣờng độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase
1.5. PHƢƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT
1.5.1. Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym

2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng sinh tổng hợp chitinase
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật
2.3.3. Khảo sát đặc tính cơ bản của chế phẩm chitinase kỹ thuật
2.3.4. Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật
3


2.3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu thủy phân chitin
2.3.5.1. Phƣơng pháp tiền xử lý chitin
2.3.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân
2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận N-Acetylglucosamine tinh sạch
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P. OXALICUM 20B
3.1.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men
3.1.1.1. Ảnh hƣởng của dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase
Dạng chitin ảnh hƣởng không nhiều đến hoạt tính chitinase thể hiện trên kết quả
Hình 3.1. Trong quá trình lên men, hoạt độ chitinase nhận đƣợc với cả 03
dạng chitin chỉ dao động từ 0,062 U/ml tới 0,065 U/ml và đạt cao nhất ở
thời điểm 120 h. Do đó, chitin dạng thô đƣợc lựa chọn làm chất cảm ứng nhằm
giảm công sức, hóa chất và năng lƣợng.
3.1.1.2. Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase
0.062

0.065

Hoạt độ chitinase (U/ml)

Hoạt độ chitinase (U/ml)



0.043

Chitin thô

Chitin nghiền Chitin dạng gel
(600μm - 2mm)

1

Hình 3.1. Ảnh hưởng dạng chitin tới hoạt
tính chitinase tại các thời điểm lên men

4

6

Nồng độ chitin thô (g/l)
72 h

72 h 96 h 120 h 144 h

2

96 h

120 h

144 h


3.1.2.1. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng lên men tới sinh tổng hợp chitinase
P.oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở pH 5, hoạt độ
enzym nhận đƣợc 0,064 U/ml chitinase tại thời gian 120 h lên men.
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase

Hình 3.5. Ảnh hưởng pH môi trường tới khả năng
sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men

Hình 3.6. Ảnh hưởng tốc độ lắc khả năng sinh
tổng hợp hitinase trong quá trình lên men

Nghiên cứu ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp enzym từ P.
oxalicum 20B đƣợc thực hiện với các thông số nhƣ thí nghiệm trên, nhƣng tốc
độ lắc đƣợc thay đổi từ 100 v/p - 180 v/p. Định kỳ lấy dịch lên men để xác định
hoạt độ chitinase cho kết quả Hình 3.6. Khảo sát tốc độ lắc từ 100 v/p tới 180
v/p cho thấy hoạt độ chitinase đạt cao nhất 0,074 U/ml tại lắc 160 v/p. Do vậy
sinh tổng hợp chitinase tốt nhất đạt 0,074 U/ml ở môi trƣờng lên men thích hợp chứa
5


4 g/l cảm ứng chitin thô, 10 g/l cao nấm men và pH 5; lắc với tốc độ 160 v/p.
3.1.3. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase
Nghiên cứu đƣợc tiến hành với các điều kiện thích hợp nhất đã lựa chọn.
Trong quá trình lên men, pH giảm dần từ pH 6,67 xuống pH 5,50 và
giữ ổn định tới khi kết thúc lên men. Sinh khối tăng nhanh chóng đạt cực
đại sau 48 h (0,75 g/l), rồi giảm liên tục tới cuối quá trình lên men. Hoạt
tính chitinase tăng lên đáng kể tại pha sinh trƣởng cân bằng và đạt cao
nhất khi cuối pha cân bằng. Hoạt tính chitinase bắt đầu tăng sau lên men
24 h và đạt cực đại 0,074 U/ml tại 120 h, sau đó giảm nhanh và còn
0,051U/ml tại 144 h lên men (Hình 3.7).

10 g/l CNM và thời gian lên men 120 h đƣợc lựa chọn để sinh tổng hợp enzym
từ P. oxalicum 20B cho nghiên cứu tiếp theo.
3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ
PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi
Dịch nổi chứa chitinase nhận đƣợc sau lên men trong điều kiện tối ƣu
đƣợc loại tạp chất và cô đặc. Do ảnh hƣởng lớn của độ nhớt nên mức
cô đặc cao nhất có thể là cô đặc 4 lần. Hoạt tính chitinase, NAHase,
endochitinase của các phân đoạn enzym nhận đƣợc thể hiện ở Bảng
3.2. Tỷ lệ cô đặc tăng, hoạt tính chitinase, NAHase và endochitinase
ở các phân đoạn trên màng đều tăng. Ngoài ra, khi tỷ lệ cô đặc tăng
từ 2 đến 4 lần thì tỷ lệ H/E ở các phân đoạn trên màng cao hơn hẳn từ
0,141 đến 0,170 và cao hơn so với tỷ lệ H/E trong dịch nổi enzym là
0,129. Và tại tỷ lệ cô đặc 4 lần thì tỷ lệ H/E của enzym trong phân
đoạn trên màng lớn gấp 17 lần so với tỷ lệ H/E của enzym trong phân
đoạn dƣới màng.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hoạt
tính và tỷ lệ chitinase, NAHase và endochitinase
(endo) trong các phân đoạn khi lọc màng

Bảng 3.3. Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu
suất thu nhận chitinase, NAHase và
endochitinase trong chế phẩm khi lọc màng

Hiệu suất thu hồi (HSTH) enzym khi cô đặc bằng hệ thống lọc dòng ngang
QuixStandTM màng lọc MWCO 10kDa thể hiện Bảng 3.3. Mức độ cô đặc càng
cao, HSTH enzym trên màng càng giảm. Trong đó giảm mạnh nhất là
endochitinase chỉ còn 61,66%, tiếp theo là chitinase còn 76,39% và giảm ít nhất là
NAHase còn 81,27% sau khi cô đặc 4 lần. Sự giảm HSTH do một phần enzym đi
qua màng lọc, thể hiện ở mức độ tăng HSTH của chitinase ở dịch qua màng. Tuy


Bảng 3.4. Cơ cấu NAHase và endochitinase
(endo) trong các phân đoạn enzym (cùng
chung hoạt độ chitinase 0,037 U/ml) từ các
phân đoạn enzym

Hình 3.10. Sắc ký đồ sản phẩm thủy
phân gel chitin 10% bởi phân đoạn
cô đặc 4 lần trên màng và dưới màng
(cùng hoạt độ 0,0024 U/ml chitinase)
ở điều kiện pH 5 và nhiệt độ 35oC

Mô tả Hình 3.10: 1, 2, 3, 4: sản phẩm thủy phân bởi phân đoạn trên
màng cô đặc 4 lần trong thời gian lần lượt 24 h; 12 h; 6 h; 3 h;
5: Chất chuẩn NAG; 6, 7, 8, 9: sản phẩm thủy phân bởi phân đoạn
qua màng cô đặc 4 lần trong lần lượt 3 h; 6 h; 12 h; 24 h.
8


3.2.3. Lựa chọn điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật
Bảo quản ở nhiệt độ 4oC, thời gian từ 30 đến 120 ngày, hoạt tính
chitinase ổn định nhất (hoạt tính chitinase còn lại khoảng 85% đến
82,5%) khi bảo quản bởi NaCl 3%, tiếp đến 0,1% Benzoat natri, kém
ổn định ở các giải pháp glycerol 20%, hỗn hợp glycerol 20% với
NaCl 3% hay mannitol 1 M với NaCl 3%. Do đó chế độ NaCl 3% ở
4oC dùng để bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật là hợp lý hơn cả.
3.2.4. Xác định đặc tính sinh học của chế phẩm chitinase kỹ thuật
Chế phẩm chitinase kỹ thuật có hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, 2,152 U/ml
HAHase và 12,695 U/ml endochitinase nhận đƣợc sau khi cô đặc 4 lần trên
màng đƣợc đem đi xác định đặc tính.


pH tối ƣu cho xúc tác của chitinase, endochitinase, NAHase lần lƣợt là pH 5, pH
4, trong khoảng pH 5 - pH 6. Chitinase có khoảng giá trị pH thích hợp trong
vùng axit (pH 5 - pH 6) (Hình 3.12 A). Endochitinase thể hiện rõ hơn là một
enzym axit (pH 4 - pH 5) (Hình 3.12 C). Khác với 02 loại enzym trên NAHase
tƣơng đối bền với sự thay đổi của pH (Hình 3.12 E).
3.3. ỨNGDỤNGCHẾ PHẨM CHITINASEKỸTHUẬT THỦYPHÂNCHITIN
3.3.1. Khảo sát lựa chọn chitin phế liệu thủy sản
10


Đường khử (mg/ml)

Khảo sát chitin (từ tôm mũ ni, sú và mai mực) thì chitin tôm mũ ni cho hiệu suất
thủy phân cao hơn cả. Nên chitin mũ ni đƣợc chọn để nghiên cứu tiếp theo
3.3.2. Lựa chọn phƣơng pháp tiền xử lý chitin tôm mũ ni
3.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ nghiền đến khả năng thủy phân chitin
Chitin tôm mũ ni đƣợc nghiền máy nghiền bi, và đƣợc phân loại theo kích
thƣớc các phân tử bằng hệ rây (kích thƣớc lỗ rây từ 63 µm đến 600
µm), sau đó xác định trọng lƣợng và hàm lƣợng chitin trong từng phân
đoạn. Ảnh hƣởng của mức độ nghiền tới khả năng thủy phân chitin cho
thấy lƣợng đƣờng khử nhận đƣợc tăng tỷ lệ thuận với mức độ nghiền
(Hình 3.13). Nhƣ vậy mức độ nghiền bi càng cao, càng giúp giảm kích
thƣớc và làm giảm độ kết tinh chitin trong nguyên liệu tạo điều kiện
cho enzym tiếp xúc mạnh với cơ chất. Do đó nghiền bi chitin cho kích
thƣớc càng bé thì hiệu quả thủy phân chitin càng cao.
3.3.2.2. Ảnh hƣởng xử lý phối hợp nghiền bi và siêu âm tới khả năng
thủy phân chitin
Các phân đoạn bột chitin tôm mũ ni sau khi nghiền bi đƣợc đƣa vào
siêu âm trong thời gian 60 phút, tiếp theo bổ sung chế phẩm enzym

âm có tác dụng đáng kể trong việc phá liên kết sâu hơn vào bên trong
nguyên liệu tạo nên các phần tử có kích thƣớc nhỏ hơn so với trƣớc khi siêu
âm (Hình 3.16 D). Thực hiện siêu âm gián đoạn các phân đoạn bột nghiền có
kích thƣớc khác nhau và enzym đƣợc bổ sung vào trƣớc hoặc sau khi siêu âm.
Khi siêu âm có mặt cả enzym sẽ giúp enzym đi vào sâu hơn bên trong nguyên
liệu, tăng khả năng tiếp xúc giữa enzym và chitin đẩy nhanh quá trình thủy
11


phân, rút ngắn thời gian thủy phân hơn so với phƣơng pháp chỉ siêu âm
nguyên liệu mà không có mặt enzym (Hình 3.15).
3.3.2.3. Ảnh hƣởngcác giải pháp xử lýchitintớicơ cấu sản phẩmnhận đƣợc sau thủyphân
Cơ cấu sản phẩm nhận đƣợc sau thủy phân 120 h thể hiện Bảng 3.5.
Kết quả Bảng 3.5 cho thấy xử lý chitin tôm mũ ni kích thƣớc càng bé
và kết hợp SA gián đoạn nhiều lần cho lƣợng NAG cao nhất
Bảng 3.5. Hàm lượng (NAG)I
trong dịch thủy phân 120 h

Đường khử (mg/ml)

1.800

1.500
1.200
0.900

0.600
0.300
0.000


MN < 63 μm) với tỷ lệ 1/1 (v/v). Định lƣợng NAGi bằng phƣơng
pháp HPLC cho thấy (NAG)2, (NAG)3 đều không tồn tại trong tất
cả các dịch thủy phân. HSTP ra NAG thể hiện Bảng 3.6.
Chitin tôm MN dạng gel dễ bị thủy phân bởi chitinase tạo NAG hơn MN
< 63 µm. Nên HSTP NAG đối với chitin tôm MN dạng gel lớn hơn
nhiều so với chitin MN < 63 μm trong thời gian ngắn (6 h). Tuy nhiên
khoảng cách này giảm khi kéo dài thời gian thủy phân (24 h). Điều này
đƣợc minh chứng bởi phân tích nhiệt vi sai và FTIR trên Hình 3.17.
Bảng 3.6. NAG tạo
thành

Hình 3.17. A. Các đường cong phân tích nhiệt vi sai
(DSC).MN < 63 μm (M3_DSC), (M5_DSC); B. Phổ FTIR
MN < 63 μm (M3_FTIR) và gel chitin MN (M5_FTIR

3.3.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin
3.3.3.1. Ảnh hƣởng nhiệt độ
HSTP tƣơng đối chitin ra NAG tăng mạnh gần 36h thủy phân, sau đó hầu nhƣ
không tăng nữa ở các nhiệt độ 35oC và 40oC và đạt giá trị lớn nhất 83% và 88%.
Nhiệt độ thấp hơn 30oC, tốc độ thủy phân chậm hơn và đạt giá trị cao nhất sau
13


36 h là 73%. Nhƣng sự thủy phân chitin ở 45ºC dừng rất sớm (chỉ sau 24 h) và
HSTP tƣơng đối nhận đƣợc rất thấp 63% (Hình 3.18 A). Do vậy, nhiệt độ tối ƣu
cho thủy phân chitin đƣợc xem là 40ºC. Sản phẩm phân giải chính là NAG
(Hình 3.18 B).

Hình 3.18. (A) Ảnh hưởng nhiệt độ lên NAG tạo thành khi pH 5. Quá trình thủy phân
được thực hiện ở 450C (), 300C (), 350C (), 400C (). (B). Sắc ký bản mỏng của

Sự đình trệ thủy phân có thể do sự khuếch tán kém vì nồng độ chitin cao
đã gây rất nhớt. Nồng độ chitin càng cao thì nồng độ đƣờng khử tạo thành
càng lớn, tuy nhiên có giới hạn. Do đó 416 mg/ml là nồng độ gel chitin
cao nhất có thể đạt đƣợc lựa chọn. Nồng độ chitin cao cần kéo dài thêm
thời gian ủ thì mới thủy phân hết chitin, nhƣng thời gian ủ kéo dài đã gây
bất lợi do dịch thủy phân chứa NAG dễ nhiễm tạp.
3.3.3.4. Ảnh hƣởng nồng độ enzym
Nồng độ enzym tăng làm tăng tốc độ phản ứng enzym và do vậy tăng
tốc độ thủy phân (độ dốc đƣờng cong tăng lên trên Hình 3.25. HSTP
ra NAG 88,5% và 89,7% đã đạt đƣợc lần lƣợt trong 96 h và 144 h
thủy phân khi tỷ lệ E/S 0,054 mU mg-1.
15


Thủy phân dịch 40% gel chitin bởi chế phẩm kỹ thuật 22,405 mU/ml
chitinase thành dịch NAG với HSTP tƣơng đối 89,7% phải mất khoảng thời
gian 144 h (Hình 3.21).

Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ enzym lên
thủy phân gel chitin. Quá trình thủy phân thực
hiện khi phối trộn dịch enzym kỹ thuật có hoạt
độ chitinase khác nhau và cơ chất 40% gel
chitin với tỷ lệ 1/1 (v/v) ở pH 5, 400C

Hình 3.22. Ảnh hưởng nồng độ
enzym tới khả năng thủy phân cơ
chất 40% gel chitin lên NAG tạo
thành trong 24h ở pH 5, 400C, tỷ lệ
dịch enzym/ dich gel chitin là 1/1 (v/v)


NAG chỉ khoảng 2%. Tuy nhiên nồng độ cô đặc dịch thủy phân tăng
dẫn tới hàm lƣợng NAG trong hạt kết tinh lần 1 là gấp đôi khi mức
độ cô đặc dịch thủy phân tăng từ 11,2 đến 15,7 lần (Hình 3.23).
3.4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô đặc tới quá trình kết tủa cồn
Xác đinh NAG bằng phƣơng pháp HPLC. Từ nghiên cứu mục 3.4.1,
dịch thủy phân cô đặc sau kết tinh loại tạp chất có nồng độ chất khô
hòa tan Bx = 29,3% (tƣơng ứng mức độ cô đặc dịch là 15,71) đƣợc
lựa chọn để thực hiện kết tủa bằng EtOH với tỷ lệ EtOH/Dịch thủy
phân lần lƣợt 7/1; 8/1; 9/1; 10/1; 11/1, cho kết tủa đƣợc sấy khô và
xác định độ ẩm, ta có lƣợng tạp chất kết tủa bởi EtOH loại bỏ thể
hiện Hình 3.24.

Hình 3.23. Ảnh hưởng mức độ cô đặc dịch
thủy phân tới lượng tinh thể kết

Hình 3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ EtOH/
Dịch thủy phân cô đặc tới NAG thất thoát
vào kết tủa và cặn kết tủa bởi EtOH.

Khi tăng tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc từ 7/1 đến 9/1, khối lƣợng kết
tủa bởi EtOH tăng mạnh từ 77,5 mg/ml đến 95,2 mg/ml và sau đó chỉ tăng
nhẹ tới 96,3 mg/ml với tỷ lệ EtOH tăng thêm tới 11. Kết tủa này chứa chủ
17


yếu tạp chất vì % NAG trong kết tủa khoảng từ 3% đến 11%. Tăng tỷ lệ
EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc dẫn tới NAG trong kết tủa tăng. Điều này
có thể đƣợc giải thích vì NAG kém tan trong EtOH. Lƣợng NAG trong
kết tủa bởi EtOH tăng lên chậm từ 2,8% đến 3,9% khi tỷ lệ EtOH/ Dịch
thủy phân cô đặc từ 7/1 đến 9/1, nhƣng lại tăng mạnh từ 8,4% đến 11,3%

thu hồi
phẩm
đặc
lần 1
bởi EtOH
tinh
NAG
NAG
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
0
0
0
1,0
0,812
1,48
6,50
81,99
85,25
6,7
0,947
1,53
8,22
80,36
88,45
7,9
1,090


B

C

Hình 3.25. Sắc ký đồ HPLC:
A. (NAG)i chuẩn với i =1-3; B. Dịch thủy phân gel chitin 40% với Bx = 2,2%;
C. Chế phẩm NAG kết tinh từ dịch thủy phân Bx = 29,3%. Ký hiệu 3NAG là mẫu
chuẩn của đường triacetyl-chitotriose ((NAG)3), mẫu 2NAG là mẫu chuẩn của
diacetyl-chitobiose ((NAG)2), mẫu NAG là mẫu chuẩn của N-acetyl-D- glucosamine
(NAG)

Kết quả sắc kí Hình 3.25 cho thấy đều xuất hiện pic ở phút 7,28 là
H2SO4 (pha động); dịch thủy phân ban đầu có chứa NAG và không
chứa các (NAG)i (với i là 2 hoặc 3). Ngoài ra còn có các pic xuất
hiện ở phút 8,755 và 16,088 (Hình 3.25 B) là các tạp chất đã đƣợc
loại bỏ ở sản phẩm tinh sạch (Hình 3.25 C). Quá trình tinh sạch thu
nhận chế phẩm NAG thể hiện trên Hình 3.25 và Bảng 3.19 ta đƣợc
chế phẩm NAG tinh thể (độ ẩm 2,54%, độ tinh sạch 93,25%) với
hiệu suất thu hồi từ dịch sau thủy phân là 74,47% tƣơng ứng với
hiệu suất thu hồi từ chitin là 63,6%.
19


Bên cạnh đó, mối tƣơng quan giữa lƣợng NAG thất thoát vào kết tủa
bởi EtOH và NAG thất thoát vào dịch không kết tinh khi tỷ lệ EtOH/
Dịch thủy phân cô đặc tăng đƣợc thể hiện trên Hình 3.26.
Kết quả cho thấy tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc tăng từ 7/1 đến
9/1 đã làm lƣợng NAG thất thoát vào dịch không kết tinh giảm từ
19,06% xuống 6,09%. Tuy nhiên lƣợng NAG thất thoát vào kết tủa



Hình 3.27. Sơ đồ quy trình sản xuất NAG

3.4.4.2. Ứng dụng qui trình sản xuất NAG với qui mô 5 lit dịch thủy phân
5 lit dịch thủy phân ban đầu đƣợc loại cặn nhờ ly tâm 6000 v/p trong 10 phút.
Sau đó đi qua hệ thống lọc dòng ngang chỉ thu 4,750 lít dịch qua màng. Dịch
lọc qua màng đƣợc tiến hành cô đặc bởi hệ thống cô quay chân không ở nhiệt
độ 60oC, vận tốc quay 30 v/p, áp suất 68 - 72 mbar cho tới khi mức độ cô đặc
đạt 15,71 lần. Dịch thủy phân cô đặc đƣợc kết tinh lần 1 ở 4oC trong 24 h, loại
tạp chất kết tinh lần 1 và thu dịch nổi. Tiếp theo bổ sung EtOH 99o vào dung
dịch nổi với tỷ lệ EtOH/ dịch nổi là 9/1 ở 4oC trong 24 h để loại cặn kết tủa,
thu dung dịch trong. Sau đó dung dịch trong này đƣợc loại EtOH bởi hệ thống
cô quay chân không ở nhiệt độ 55oC, vận tốc quay 30 v/p, áp suất 75 - 80
mbar, rồi thực hiện kết tinh lần 2 thu tinh thể NAG ở 4oC trong 24 h và phần
dịch không kết tinh đƣợc. Các tinh thể NAG (kết tinh lần 2) đƣợc rửa bằng 50
ml EtOH 99° và sấy 60oC thu nhận sản phẩm NAG.
21


NAG trong dịch không kết tinh, NAG trong cặn kết tủa bởi EtOH và NAG
trong sản phẩm tinh sạch đƣợc xác định theo phƣơng pháp HPLC ta có kết
quả Hình 3.28; độ tinh sạch NAG và HSTH NAG thể hiện Bảng 3.8.

Hình 3.28. Kết quả phân tích HPLC trong mẫu chứa NAG
A. Mẫu hỗn hợp chất chuẩn 1NAG, 2NAG, 3NAG; B. Mẫu sản phẩm sau tinh sạch;
C. Mẫu kết tủa EtOH; D. Mẫu dịch không kết tinh.
Bảng 3.8. Kết quả tinh sạch chế phẩm NAG
Bảng 3.9. Đặc điểm của
sản phẩm NAG

(M6_FTIR) và NAG hãng Sigma (M7_FTIR). Hình dạng của đỉnh
(peak) trong khoảng 4000 - 700 cm-1 của phổ M6_FTIR và phổ
M7_FTIR gần nhƣ giống nhau nên cấu trúc của chúng đƣợc coi nhƣ
tƣơng đƣơng. Kết độ tinh sạch sản phẩm NAG sau tinh sạch 93,28%
là gần với độ tinh sạch 100% của sản phẩm NAG Sigma.
3.5. XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM NAG
Đặc tính chế phẩm NAG đƣợc thể hiện trên kết quả Bảng 3.9
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Với kết quả nghiên cứu của luận án có thể rút ra một số kết luận sau:
1. Điều kiện tối ƣu để lên men sinh tổng hợp chitinase từ Penicillium
oxalicum 20B: nguồn Cacbon là chitin mũ ni dạng thô 4,0 g/l; cao
nấm men 10 g/l; pH 5,0; tốc độ lắc 160 vòng/phút; thời gian 120 h.
Hoạt độ dịch lên men thu đƣợc đạt 0,074 U/ml chitinase, 5,058 U/ml
endochitinase và 0,683 U/ml NAHase.
2. Thu nhận chế phẩm enzym kỹ thuật bằng cách cô đặc lọc dòng
ngang 4 lần (màng lọc MWCO 10kDa). Chế phẩm enzym kỹ thuật
nhận đƣợc có hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, 12,695 U/ml
endochitinase và 2,152 U/ml NAHase; không có chitobiosidase, và
nhiệt độ tối ƣu đều ở 40oC; chitinase tối ƣu pH 5, và bền trong
khoảng nhiệt độ 30 - 40oC ở pH 5; endochitinase, NAHase của chế
phẩm tƣơng ứng pH tối ƣu 4 và 6. NAHase bền nhiệt hơn trong
khoảng 30 - 50oC và ít chịu ảnh hƣởng của pH trong khoảng 4 - 7
hơn endochitinase. Và điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ
thuật: NaCl 3% ở 4oC.
3. Điều kiện tối ƣu để thủy phân chitin thu NAG là: 40oC, pH 5, dịch
cơ chất gel chitin nồng độ 416 mg/ml (gel chitin 40%), enzym hoạt
độ 11,600 mU/ml chitinase. Ở điều kiện này, hiệu suất thủy phân
NAG đạt 87,5% sau thời gian 144 h (tỷ lệ dịch chế phẩm enzym và
dịch cơ chất là 1/1 (v/v)).