TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC-ĐIỀU DƯỠNG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH DƯỢC
MÃ SỐ: 52120401

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY
BỆNH TRỨNG CÁ
Probionibacterium acnes CỦA CAO CHIẾT TỪ
CÂY TRỨNG CÁ (Muntingia calabura L.)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. DƯƠNG THỊ BÍCH

SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ
PHƯỢNG HIỆP MSSV:
12D720401113
LỚP: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017


LỜI CẢM ƠN
Qua quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, em đã học hỏi được rất nhiều
kiến thức, kỹ năng và kinh nghiệm quý báu từ quý Thầy, Cô và Bạn bè. Em xin gửi lời
cảm ơn sâu sắc đến:
Cô Ths. Dương Thị Bích - người hướng dẫn đề tài đã tận tình giúp đỡ, đóng
góp ý kiến cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Quý Thầy Cô Bộ môn Vi Sinh-Ký
Sinh đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học
tập và làm việc tại trường.

Sinh viên thực hiện

Lê Phượng Hiệp

ii


TÓM TẮT NỘI DUNG
Kháng sinh tổng hợp được sử dụng trong điều trị bệnh trứng cá hiện nay thường dẫn
đến khả năng đề kháng thuốc. Trong những năm gần đây, cây Trứng cá (Muntingia
calabura L.) được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng
kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hoá cao. Vì vậy với mục tiêu đề tài là đánh giá và
so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes từ các bộ phận cây Trứng cá rất
cần thiết. Lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) được chiết
xuất bằng hệ thống đun hồi lưu với dung môi ethanol 96 % thu được bốn loại cao chiết. Khả
năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Trứng cá được khảo sát bằng phương pháp khuếch
tán trên giếng thạch trên dòng vi khuẩn P. acnes 134N lưu trũ tại phòng thí nghiệm Vi sinh
trường Đại học Tây Đô. Kết quả thí nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tất cả các loại
cao chiết từ bộ phận cây Trứng cá đều có hoạt tính ức chế dòng vi khuẩn
Propionibacterium acnes 134N. Qua so sánh kích thước khoảng vô khuẩn, cao chiết từ lá
Trứng cá có khả năng ức chế dòng vi khuẩn P. acnes 134N cao nhất trong bốn loại cao khảo
sát, ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000
mm; 16,33 ± 2,082 mm. Giá trị MIC của cao chiết từ lá Trứng cá đối với dòng vi khuẩn P.
acnes 134N là 10 mg/ml. Đồng thời tiến hành định tính các hợp chất sinh học trong cao
chiết từ lá Trứng cá, kết quả thu được cao chiết ethanol từ lá Trứng cá có chứa hợp chất
sinh học như flavonoid, saponin, tanin. Từ kết quả đề tài cho thấy, cao chiết ethanol từ lá,
vỏ thân, quả chín và quả non Trứng cá là một nguồn nguyên liệu tự nhiên, tiềm năng cho
những nghiên cứu sâu hơn trong điều trị bệnh trứng cá, đặc biệt là nguyên nguyên liệu từ
lá Trứng cá.
Từ khóa: cây Trứng cá, Propionibacterium acnes, tính kháng khuẩn

2.1.3. Những phương pháp
............................................5

điều

trị

bệnh

cá

trứng
trứng

cá

cá
hiện

nay

2.2. VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES .......................................................9
2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes.................................................9
2.2.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes ...........................10
2.3. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ ...................................................................12
2.3.1 Nguồn gốc cây Trứng cá ......................................................................................12
2.3.2.
Phân
loại
cây

3.3.2. Cỡ mẫu.................................................................................................................21
3.3.3. Phương pháp chọn mẫu
.......................................................................................21
3.3.4. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................22
3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................31
3.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ..........................................................................................31
3.6. VẤN ĐỀ Y ĐỨC....................................................Error! Bookmark not defined.
3.7. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ ......................................................................31
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................32
4.1. KẾT QUẢ ...............................................................................................................32
4.1.1. Chiết cao
..............................................................................................................32
4.1.2. Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Propionibacterium acnes ................................32
4.1.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây
Trứng cá.........................................................................................................................36
4.1.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn
Propionibacterium acnes...............................................................................................38
4.1.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ lá Trứng cá
................40
4.2. THẢO LUẬN .........................................................................................................41
4.2.1. Chiết cao
..............................................................................................................41
4.2.2. Phân lập và định danh vi khuẩn
...........................................................................41
v


4.2.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây
trứng cá
..........................................................................................................................42

..........14
Bảng 3.1: Công thức môi trường TYEG agar ...............................................................21
Bảng 3.2. Định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol cao chiết trứng cá
........30
Bảng 4.1. Kết quả độ ẩm cao cây Trứng cá...................................................................32
Bảng 4.2. Kết quả hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá .................................................32
Bảng 4.3. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của các loại cao ethanol cây trứng cá
bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.
...........................................................36
Bảng 4.4. Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá
đối với vi khuẩn P. acnes. .............................................................................................39
Bảng 4.5. Kết quả định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol của lá Trứng cá
.......................................................................................................................................4
0

vii


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn ........................................................................................5
Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes ..........................................................................................10
Hình 2.3. Cây trứng cá...................................................................................................12
Hình 2.4. Quả non và quả chín cây Trứng cá ................................................................13
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá ......................................23
Hình 3.2. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ
.......................................................................................................................................2
6
Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết .................29
Hình 3.4. Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm

Deoxyribo Nucleic Acid

DPPH

2,2-diphenylpicrylhydrazyl

ED50

Effective dose 50

IC50

Inhibitory concentration

M. calabura

Muntingia calabura L.

MIC

Minimum inhibitory concentration

MBC

Minimum bactericidal concentration

P. acnes

Proipionibacterium acnes


(Leyden, 2003). Tuy nhiên các thuốc này kèm theo các tác dụng phụ như kích ứng da,
lột da, sạm da (Kennedy et al., 1995) và thời gian điều trị kéo dài dẫn đến hiện tượng
kháng thuốc kháng sinh và thuốc trị mụn (Leyden, 2003). Vì vậy việc tiếp cận các liệu
pháp điều trị có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là những dược liệu sử dụng phổ
biến trong dân gian điều trị bệnh trứng cá đang được nhiều nước trên Thế giới và Việt
Nam quan tâm. Mục đích nhằm tìm những thuốc mới có hiệu quả, không gây tác
dụng phụ so với các thuốc có nguồn gốc hóa dược và góp phần tận dụng nguồn dược
liệu có sẵn là rất cần thiết.
Cây Trứng cá hay còn gọi là Mật sâm trong những năm gần đây được các nhà
khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng
viêm và chống oxy hóa cao. Lá, vỏ thân, quả và rễ sử dụng như một phương thuốc
dân gian điều trị sốt, cảm lạnh, bệnh tiêu hoá, thuốc kháng khuẩn ở khu vực Đông
Nam Á. Các nghiên cứu đã chứng minh những hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu có
khả năng kháng vi sinh vật, kháng oxy hoá bao gồm tanin, flavonoid, phenolic
(Chenwitheesuk et al., 2005). Theo các nghiên cứu một số hợp chất phân lập từ cây
Trứng cá như flavonoid, tanin, phenolic (Keneda (1991), Su (2003), Chen (2005))
có khả năng chống các tế bào ung thư và kháng khuẩn. Mặt khác cây Trứng cá là
loại cây ven đường được trồng khá phổ biến tại các nước Nam Mỹ và khu vực Đông
Nam Á (Chin,
1989), dễ thu hái và rẻ tiền là nguồn nguyên liệu sẵn có dễ tìm.
1


Với những lí do trên đề tài “Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng
cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntngia calabura
L.)” đã được thực hiện với mục đích cụ thể sau:
1) Xác định và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của
cao chiết từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)
2) Định tính một số hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết từ Cây Trứng cá cho
hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

đầu đen.
- Bệnh trứng cá trung bình: từ 6 - 20 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn đầu
trắng, mụn đầu đen đồng thời có thêm sẩn, mụn mủ.
- Bệnh trứng cá nặng: từ 21 - 50 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn mủ, nang,
nốt
sẹo.
Theo Tutakne (2003) phân loại bệnh theo bốn cấp độ:
- Cấp 1: mụn trứng cá (comedones, mụn đầu trắng, mụn đầu đen), sẩn (Papules)
- Cấp 2: mụn trứng cá, vài mụn mủ (pustule)
3


- Cấp 3: mụn mủ, nốt sần (nodules), áp xe (abscess)
- Cấp 4: các u nang (cyst), áp xe, sẹo (scar)

4


2.1.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá
Những yếu tố chính gây bệnh trứng cá là nội tiết tố kích thích tiết bã nhờn, sự
sừng hoá (Keratin hoá) bất thường của phễu nang lông, tăng số lượng vi sinh vật
trên da và phản ứng viêm của tế bào chủ. Trong đó sự tăng tiết bã nhờn được coi là
điều kiện cần, phản ứng viêm được xem là yếu tố then chốt, còn vi khuẩn P. acnes
đóng vai trò quan trọng gây ra bệnh trứng cá (Loveckova el al., 2002). Ngoài ra còn
các yếu tố khác như yếu tố di truyền, chế độ dinh dưỡng, môi trường làm việc, khí
hậu, lạm dụng mỹ phẩm cũng có liên qua đến tình trạng bệnh trứng cá (Nguyễn
Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013)
2.1.2.1. Sự tăng sinh tiết bã nhờn
Bã nhờn được sản xuất bởi tuyến nhờn, chúng có ở mọi nơi trên cơ thể đặc
biệt ở trán, cằm và lưng, có rất ít ở tay hoặc chân, không có ở lòng bàn tay và lòng


granulosum, Propionibacterium avidum, Propionibacterium acnes đã được chứng
minh hệ vi sinh vật tham gia vào sự phát triển của bệnh trứng cá, trong đó P. acnes
được xem là tác nhân gây bệnh trứng cá chính (Hamnerius, 1996).
Propionibacterium acnes thuộc chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, khuẩn lạc màu
vàng nhạt hoặc vàng đậm (do khả năng sinh acid propionic) trên môi trường TYEG
5


agar (có bổ sung bromocresol purple), tế bào hình que, dương tính với catalase.
Trong

6


dòng vi khuẩn thuộc giống Propionibacterium thì P. granulosum và P. avidum không
có khả năng sinh tryptophan, trong khi P. acnes cho kết quả dương tính. Đây là một
trong những đặc điểm quan trọng giúp phân lập được các dòng P. acnes (Kishishita et
al., 1980).
2.1.2.4. Phản ứng viêm
Tại các tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase phân giải triglyceride thành các
acid béo tự do và glycerol. Các acid béo tự do khuyếch tán qua thành nang lông,
thu hút bạch cầu trung tính đa nhân, chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi các
enzym thuỷ phân lysosom, gây ra phản ứng viêm ở lớp hạ bì (Weeks et al., 1977;
Pawin et al., 1998)

Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn (Degitiz et al., 2007)
A. Nang tuyến bã nhờn bình thường

B. Nhân mụn

thân cùng với kháng sinh tại chỗ như: tetracyclin: 500mg x 2 lần/ngày; erythromycin
500 mg x 2 lần/ngày; roxithromycin 150 mg x 2 lần/ngày; levofloxacin 500 mg x 2
lần/ngày.
Các loại kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes làm giảm viêm
nhưng tác dụng trong điều trị bị giảm do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn
(Shimonart và Dramaix, 2005). Kháng sinh trong điều trị vi khuẩn mụn trứng cá P.
acnes đã có nhiều tác giả nghiên cứu. Năm 1976, Leyden chưa phát hiện sự kháng
kháng sinh của vi khuẩn P. acnes (Leyden, 1976). Năm 1979, Crawford cùng cộng sự
đã công bố kháng sinh kháng vi khuẩn P. acnes là erythromycin và clindamycin với tỷ
lệ mức 20 % .Tỷ lệ kháng kháng sinh 20 % năm 1978 và lên 68 % năm 1996. Theo
một số điều tra gần đây, các nước Địa Trung Hải có tỷ lệ đề kháng của P. acnes cao
nhất với erythromycin và clindamycin. Ở Tây Ban Nha tỷ lệ kháng với hai loại kháng
sinh này lần lượt là 91 % và 92,4 %. Ở Hy Lạp, tỷ lệ P. acnes đề kháng cả hai loại
erythromycin và clindamycin là 75,3 % và ở Italia là 59,5 % (Ross et al., 2002). Theo
Dreno et al., 2001 công bố tỷ lệ dòng vi khuẩn P. acnes phân lập từ bệnh nhân chủ yếu
là bị tổn thương kèm theo viêm, kháng lại erthromycin 52 %. Những loại kháng sinh
điều trị bệnh trứng như ampicilin, erythromycin, roxithromycin, clindamycin được
khuyến cáo không sử dụng điều trị dài hạn (quá 3 tháng) (Nishijima, 2000). Khả năng
kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn không chỉ lây lan giữa các dòng vi khuẩn trên da
người bệnh mà còn lây truyền qua người thân và những người mà họ tiếp xúc
(Sheafer et al., 2001). Khả năng đề kháng thuốc kháng sinh của P.acnes có liên quan
đến đột biến gen trên 16S và 23S-rRNA, được phân lập ở các nước Nhật Bản, Úc, Hoa
Kỳ và Châu Âu (Ross et al., 2002). Đột biến gen 23-rRNA kháng lại kháng sinh thuộc
nhóm macrolid- lincosamidestreptogramin B, đặc biệt là erythromycin và clindamycin
(Ross et al,. 2002). Tại Việt Nam, khảo sát 87 bệnh nhân tham gia nghiên cứu tạo
phòng khám bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ đề kháng kháng sinh như
sau lindamycin 88,1 %; azthromycin 16,7 %; tetracyclin 0 %, doxycylin 0 %;
minocyclin
0 %; trimethroprim/sulfamethoxazol 95,2 % (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất
Thắng, 2013). Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá, các

tuyến ức và hệ thống tim mạch thai nhi (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Các thuốc
retinoid chống chỉ định cho phụ nữ mang thai và phụ nữ trong độ tuổi sinh sản
(Yentzer et al., 2009).

-

Khô da và niêm mạc, làm da và niêm mạc dễ bị tổn thương và kích ứng, bệnh
nhân cảm giác bỏng rát da trở nên đỏ, bong vẩy

-

Mụn mủ có thể xuất hiện sau khi bôi thuốc 1 đến 2 tuần do thuốc làm tăng
sự thẩm thấu các chất trung gian hoá học gây viêm do P. acnes tiết ra và tạo
điều kiện cho tụ cầu phát triển (Nguyễn Hữu Sáu, 2010).

2.1.3.4. Các phương pháp khác
- Acid azelic có tác dụng giống benzyol peroxid gây ức chế sự tổng hợp tế bào sừng,
có hoạt tính chống lại bệnh trứng cá. Tác dụng không mong muốn là gia tăng sắc tố da
sau viêm (Roebuck, 2006), dễ gây kích ứng da ngứa và có cảm giác bỏng tại chỗ
(Layton, 2006).

10


- Điều trị bằng công nghệ ánh sáng tia laser: sử dụng liệu pháp quang, ánh sáng phổ
rộng. Tia laser cho thấy kết quả giảm mụn trong thời gian ngắn nhưng cần có thêm
nhiều nghiên cứu lâu dài và so sánh liệu pháp cũ (Sakamoto et al., 2010)
- Bên cạnh đó thảo dược được dùng điều trị mụn trứng cá không chỉ có khả năng như
một chất tiêu diệt vi sinh vật mà còn là những chất có khả năng ức chế sản sinh sản
phẩm ngoại bào của P. acnes. Thảo dược dùng điều trị mụn trứng cá cho thấy tác


Vi khuẩn

chấtnhờn

nang lông

P. acnes

Benzoyl peroxid

-

+

+++

+

Retinoid

-

++

+

+

Clindamycin


-

-

++

+

Erythromycin

-

-

++

-

+++

++

++

++

Isotretinoin

Phản ứng viêm


Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes
( Jappe et al., 2002)
(a) Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử; (b) Hình chụp dưới kính hiển vi quang học
P. acnes có nhiều dạng khác nhau. Dựa vào quá trình lên men, sử dụng đường
ribose, erythritol và sorbitol, quan sát được 5 type P. acnes khác nhau. Dựa trên xét
nghiệm huyết thanh và phân tích thành phần đường trên thành tế bào, chia P. acnes
thành hai dạng: type I (đường glactose tham gia cấu tạo thành tế bào) và type II (chỉ
có đường manose trong cấu tạo thành tế bào) (Johnson và Cummins, 1972).
Theo McDowel (2005) P. acnes được chia thành hai type I và II dựa vào khác biệt về
kiểu gen dựa trên biến thể về kiểu gen (reca, hly). Gần đây, một dạng mới được mô
tả là type III trên da người dị ứng.
2.2.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes
P. acnes là một trong những thành phần của hệ vi sinh vật bình thường trên da
(Holdeman et al., 1977). Ở những người bệnh trứng cá, vi khuẩn này phát triển rất
mạnh do sự bít tắc lỗ chân lông tạo môi trường yếm khí, tạo điều kiện thuận lợi cho vi
sinh vật này tăng nhanh mật số. Vi khuẩn P. acnes sản xuất các enzym ngoại bào và
các sản phẩm có hoạt tính sinh học khác được xem là yếu tố quyết định độc lực và
tương tác với hệ miễn dịch gây ra phản ứng viêm tạo nhân mụn (Webster, 1995).
Theo Funke (1997) và Leyden (1998) P. acnes là nhân tố quan trọng gây bệnh
trứng cá đây là chủng vi khuẩn phổ biến nhất trên da bệnh nhân trứng cá. Tại
các tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase để tiêu hoá chất nhờn trong các nang
lông sản sinh ra các acid béo tự do và acid propionic. Vi khuẩn P. acnes tồn tại trên
13