i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ
NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
ĐƢỢC
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: PHẠM HOÀNG THÁI Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI PHẠM HOÀNG THÁI
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2007

iii
LỜI CẢM TẠ

Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ của ba, má và những người
thân trong gia đình đã cho con có được ngày hôm nay.
Chân thành cảm ơn
Ban chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý thầy cô đã
tận tình dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Chân thành biết ơn sâu sắc đến các quý thầy cô
Ts. Nguyễn Ngọc Hải
Ts. Lê Anh Phụng
Cô Nguyễn Thị Kim Loan

và 1/10
5
. Sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy khi tỷ lệ
bào tử vi khuẩn tăng lên thì tăng khả năng làm giảm aflatoxin.
- Nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin có xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis gây chết vịt
ít hơn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin nhưng không xử lý với vi khuẩn.

v
SUMMARY The thesis: “ Isolation of Bacillus subtilis in soil and survey their ability in
inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize.” The thesis
Bacillus subtilis in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize
and in protection of duck frome aflatoxin infection was carried out in Microbiology
and Infections Diseases Department of Freulty of Animal sciences and Veterinary,
Nong Lam University, Ho Chi Minh cty frome 03/2007 to 08/2007.
The results showed:
- Bacillus subtilis could inhibite the aflatoxin production of Aspergillus flavus
on maize in times.
- Bacillus subtilis treatment could reduce the neortility rate, health affect of the
ducks fed with 100 ppb aflatoxin containated maize.

vi

2.1.6. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên………………………......…...…..................6
2.1.7. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis………………………….....……...................7
2.1.7.1. Cấu tạo của bào tử…………………………………………..........….......…..7
2.1.7.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử………………………..........…….......…...8
2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh.................9
2.1.9. Những nghiên cứu về tác dụng đố kháng Aspergillus của Bacillus subtilis...11
2.2. KHÁI QUÁT VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN……...…..........12
2.2.1. Khái niệm về nấm mốc……………………………………….............…….....12
2.2.2. Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin…………….......................................12
2.2.3. Độc tố aflatoxin…………………………………..............................................13
2.2.3.1. Các loại độc tố aflatoxin……………………….............................................13
2.2.3.2. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin…………………….......................................14
2.2.3.3. Những tác hại do aflatoxin gây ra…………………….................................14
2.2.3.4. Các phƣơng pháp phân hủy aflatoxin………………………...………........15
3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH..................................................19
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM................................................................................19
3.1.1. Thời gian ............................................................................................................19
3.1.2. Địa điểm..............................................................................................................19
3.2. ĐỐI TƢỢNG KHẢO SÁT...................................................................................19
3.3. THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM ................................................................19
3.4. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY................................................................................20
3.4.1. Môi trƣờng tự nhiên ..........................................................................................20
3.4.2. Môi trƣờng tổng hợp.........................................................................................20

viii
3.5. NỘI DUNG...........................................................................................................20
3.6. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU...............................................20

3.6.4.3.2. Nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis và bào tử nấm
Aspergillus flavus trên môi trƣờng nguyên liệu bắp..................................................26
3.6.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bào tử nấm mốc /bào tử vi
khuẩn đối với sự sản sinh aflatoxin............................................................................27
3.6.5.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc
Aspergillus flavus..........................................................................................................28
3.6.5.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn
Bacillus subtilis.............................................................................................................28
3.6.5.3. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................28
3.6.6. Thí nghiệm 4: Thử mức độ an toàn của ngƣyên liệu bắp đã nhiễm
aflatoxin sau khi xử lý bằng vi khuẩn Bacillus subtilis (có khả năng ức chế
aflatoxin) trên vịt..........................................................................................................29
3.7. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU……………………………………….....30
3.8. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU....................................................................30
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………………..31
4.1. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS SUBTILIS………...31
4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis……………..…..31
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis sau
nhuộm Gram………………………………………………………………………….32
4.1.3. Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillussubtilis..32

x
4.2.THÍ NGHIỆM 1: KIỂM TRA KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA
CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ KHẢ
NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG
BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC...............................................................35
4.2.1. Kiểm tra khả năng sinh khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc

xii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus sutilis………………………............…. 6
Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào dinh dưỡng của Bacillus subtilis….........8
Bảng 2.3: Số lượng của Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cấy
(CFU/ml)........................................................................................................................10
Bảng 2.4: Khả năng ức chế aflatoxin B
1
của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
trong thí nghiệm của Norio Kimura………………………….................................…..12
Bảng 2.5: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin……………............…13
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm nghiệm 2............................................................................27
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 3………………………………………………………….28
Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập được……………...33
Bảng 4.2: So sánh khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của 8 chủng Bacillus subtilis...38
Bảng 4.3: Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin của thí nghiệm 2…………………..39
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm 3……………………………………...………………..41
Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm 4………………………………………...……………..43
Bảng 4.6: So sánh sự khác nhau về bệnh tích đại thể các mẫu gan vịt…………….....45
Bảng 4.7: Kết quả bệnh tích vi thể gan của vịt ở các lô thí nghiệm…………………...46

xiii

Sơ đồ 3.3: Phương pháp xác định số lượng bào tử Bacillus subtilis………………………….26 Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là một trong những nhóm độc chất tự nhiên do
các loài nấm mốc sản xuất ra trong quá trình phát triển trên các cơ chất, đặc biệt là
lương thực, thực phẩm dành cho con người và gia súc. Người ta đã phát hiện khoảng
3000 loại mycotoxin nhưng độc tố quan trọng nhất cho đến hiện nay là aflatoxin do
nấm mốc Aspergillus sản sinh. Aflatoxin không chỉ là độc tố gây nhiễm độc, gây rối
loạn chức năng, gây suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà còn gây chết gia súc,
gia cầm trong trường hợp nhiễm độc hàm lượng lớn. Aflatoxin cũng được chứng minh
là chất độc gây ung thư cho động vật thí nghiệm. Trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm
thích hợp của nước ta, nếu không được bảo quản tốt thì các loại nguyên liệu cũng như
thức ăn gia súc thành phẩm rất dễ bị nhiễm các loại nấm mốc sinh aflatoxin. Một khi
điều đó xảy ra sẽ gây tổn thất rất lớn cho nhà chăn nuôi, ngành chăn nuôi nước nhà và
nguy hiểm hơn là ảnh hưởng gián tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng sản phẩm
chăn nuôi.
Xuất phát từ tình hình thực tế đó, đã có nhiều nghiên cứu khoa học trong và
ngoài nước được tiến hành nhằm giải quyết vấn đề này: như dùng nhiệt độ, ánh sáng,
chất oxy hóa để làm mất hiệu lực của aflatoxin, .... Một trong những xu hướng hiện nay
là áp dụng phương pháp vi sinh vật học. Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, 2

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức
y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh
sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.Việc ứng dụng điều trị phải đợi tới những năm 1949 - 1957
khi Henrry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis.
Từ đó “subtilis therapy “ có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm
đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên
rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, (trích dẫn bởi Lê Văn Hiệp,
2004).
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo đặc điểm phân loại của Bergey (1994), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacterriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis

4

2.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc của đường ruột,
chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất, nước, Phần lớn
chúng tồn tại trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g.
Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm.
Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào
sinh dưỡng vi khuẩn Bacillus subtilis.
2.1.3. Đặc điểm hình thái


Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose,
xylose, arabinose.
Indol (-), nitrate (-), MR-VP (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+),
casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).
Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác
động của hemolysine. 6
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus sutilis
Phản ứng sinh hóa Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh indol -
MR +


Bào tử
Hình 2.2: Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
(
2.1.7.1. Cấu tạo của bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có
nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất
hòa tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một
khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì
vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai phương, 2004).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hóa học và tính chất sinh
lý.

8
Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào dinh dƣỡng của Bacillus subtilis
Đặc tính Tế bào sinh dƣỡng Bào tử
Cấu trúc Tế bào G+, điển hình Vỏ bào tử dày, khó thấm
nước
Thành phần hóa học
Canxi Thấp Cao
Protein Thấp hơn Cao hơn
Hoạt tính enzyme Cao Thấp
Khả năng chịu nhiệt Yếu Cao
Chịu bức xạ Kém Mạnh

làm cho các chất hóa học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào tử .
Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào
mới có sức sống mạnh mẽ hơn (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh
Mỗi loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau,
sinh khuẩn lạc khác nhau.
Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là thay đổi điều
kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế, khi môi trường
nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra
sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh không gian giữa vi khuẩn và nấm. Do vi
khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng
trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm
bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn Lý Kim Hữu,
2005).
Phương thức diệt nấm và các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn Bacillus subtilis
như sau:
- Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác nhân gây
bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh.
- Sau đó, Bacillus tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi là serenade)
để làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn
sự phát triển của chúng. Serenade có thể được bảo quản, sử dụng như một loại thuốc
trừ sâu hóa học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm là
không gây độc đối với cá hồi, ong mật, chim cút, sâu đất và nhiều loài khác. Serenade
gồm 3 nhóm lipopeptid có tên là surfactin, agrastatin và iturin. Ba nhóm này kết hợp
với nhau để làm tăng hoạt tính diệt các mầm bệnh kể cả vi sinh vật gây hại, nấm mốc
và cả bào tử gây bệnh của chúng. 10
Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid. Bản thân


2 4,45.10
10
19,95.10
8
9,55.10
7
<10
6

3 4,45.10
10
17,26.10
8
8,30.10
7
<10
6

4 4,45.10
10
19,95.10
8
13,67.10
7
<10
6

5 4,45.10
10

để ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus, Aspergillus
parasiticus trên đậu phộng (trích dẫn bởi Lâm Thanh Thúy Trân, 1995).
Nguyễn Thị Ngọc Trân năm 1995 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của
chủng Bacillus subtilis AO
1
(do Trung tâm công nghệ sinh học thuộc liên hiệp sản xuất
hóa chất cung cấp) với Aspergillus flavus trên môi trường thạch khoai tây-glucose và
kết quả đạt được rất khả quan.
Ngoài nƣớc
Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của một số chủng
vi khuẩn Bacillus subtilis đã được thực hiện với Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus.
Norio Kimura (1990) đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát
triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên đậu
phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát
triển của nấm mốc và tống hợp aflatoxin.
Khả năng ức chế aflatoxin B
1
của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong thí
nghiệm của Norio Kimura.