ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Kitsamone Sihavong

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN
CỦA VI KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT MỘT SỐ
THỰC VẬT THU THẬP TẠI LÀO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Kitsamone Sihavong

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN
CỦA VI KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT MỘT SỐ
THỰC VẬT THU THẬP TẠI LÀO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.Nguyễn Quang Huy

Hà Nội – 2016

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
Chƣơng 1 ..................................................................................................................... 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 3
1.1.

Vi sinh vật gây bệnh đối với con ngƣời ........................................................ 3

1.1.1.

Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn ................................................................ 3

1.1.2.

Một số vi khuẩn gây bệnh ở người.......................................................... 4

1.2 Khả năng kháng khuẩn của thực vật ................................................................ 10
1.2.1
1.3

Cơ chế kháng khuẩn của thực vật ......................................................... 11

Tình hình nghiên cứu thực vật có khả năng kháng khuẩn ........................... 17

CHƢƠNG 2 .............................................................................................................. 26
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 26
2.1. Nguyên liệu ..................................................................................................... 26
2.1.1. Chủng vi sinh vật ...................................................................................... 26
2.1.2. Mẫu thực vật trong nghiên cứu ................................................................ 26
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 27
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm .................................................................................... 27

Phân tách các thành phần các chất thực vật thứ sinh trong mẫu ........ 33

2.2.8.

Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do DPPH ...................... 33

2.2.9.

Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 34

CHƢƠNG 3. ............................................................................................................. 35
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 35
1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ mẫu thực vật .......................................... 35
2. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết và cao chiết các mẫu
thực vật ............................................................................................................... 36
3.2.1.

Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết các mẫu trong n-Hexan ........... 36

3.2.2.

Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết mẫu thực vật trong Ethanol 80%37

3.2.3.

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết và cao chiết Ethyl acetat39

3.3.

Kết quả định tính các loại hợp chất trong các mẫu thực vật ....................... 42



MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Tên viết tắt
EPEC

:

Enteropathogenic Escherichia coli

ETEC

:

Enterotocigenic Escherichia coli

EIEC

:

Enteroinvasive Escherichia coli

EHEC

:

Enterohaemorrhagic Escherichia coli


TEAF

:

toluen: Ethyl acetat: axeton: axit formic

DPPH

:

Diphenyl picrylhydrazyl

ĐC

:

Đối chứng

ĐCEA

:

Đối chứng Ethyl acetat


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tên thƣờng gọi của các loại cây sử dụng trong nghiên cứu.....................27
Bảng 3.1. Hiệu suất tách chiết các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ các mẫu thực .. 36
Bảng 3.2. Kế quả hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ Croton, trinh nữ, tầm gửi,
cây nhàu .................................................................................................................... 38

Hình 1.17. Cây Muồng đen ....................................................................................... 24
Hình 1.18. Cây Keo dậu ............................................................................................ 26
Hình 1.19. Cây Núc nác ............................................................................................ 23
Hình 2.1. Quy trình thu dịch chiết và cao chiết các mẫu thực vật trong n-Hexan .... 29
Hình 2.2. Quy trình thu dịch chiết và cao chiết các mẫu thực vật trong Ethanol
80%........................................................................................................................... 30
Hình 2.3. Quy trình thu dịch chiết và cao chiết các mẫu thực vật trong ethyl
acetate. ....................................................................................................................... 31
Hình 3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn các mẫu cao n-Hexan thực vật trên
chủng B. subtilis và B. cereus ................................................................................... 38
Hình 3.2. Khả năng kháng B. subtilis của các dịch chiết của Ethyl acetate ............. 41
Hình 3.3. Khả năng kháng B. subtilis của các dịch chiết của etyl acetate ................ 42
Hình 3.4. Khả năng kháng E. coli của các dịch chiết ............................................... 42


Hình 3.5. Khả năng kháng B.cereus của các dịch chiết ............................................ 42
Hình 3.6. Kết quả thử định tính một số chất trong cây Sầu đâu .............................. 44
Hình 3.7. Kết quả định tính một số chất của cây Núc nác ........................................ 45
Hình 3.8. Đƣờng đồ thị chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo quercetin ........... 46
Hình 3.9. Đồ thị đƣờng chuẩn axit gallic .................................................................. 47
Hình.3.10. Hệ số Rf sắc kí bản mỏng các cao chiết cây Sầu đâu ............................ 49
Hình 3.11. Hệ số Rf sắc kí bản mỏng các cao chiết cây Núc nác ............................. 50


MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi đời sống kinh tế xã hội của con ngƣời ngày càng đƣợc nâng
cao vấn đề chăm sóc sức khoẻ con ngƣời ngày càng đƣợc quan tâm chú ý. Các ứng
dụng khoa học hiện đại trong y học đã giúp sàng lọc nhiều loại thuốc đặc trị những
căn bệnh trƣớc kia đƣợc xem là bệnh nan y. Không chỉ dừng lại ở chữa trị, các nhà
khoa học còn đi sâu tìm hiểu nguyên nhân, cơ chế của bệnh để đƣa ra phƣơng pháp



kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh của các chất thứ sinh có trong một số loài
thực vật phổ biến ở Lào, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Đánh giá khả năng ức chế sự
phát triển của vi khuẩn từ dịch chiết một số thực vật thu thập tại Lào” với mục
đích tách chiết và bƣớc đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn dịch
chiết đến khả năng phát triển của một số chủng vi sinh vật gây bệnh.

Luận văn thạc sĩ

2

Kisamone SIHAVONG


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Vi sinh vật gây bệnh đối với con ngƣời
1.1.1.

Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn

Vi khuẩn là các sinh vật đơn bào có hình dạng và hoạt động đơn giản do
chúng chƣa có màng nhân. Vi khuẩn có thể xuất hiện ở khắp mọi nơi, sống trong
mọi khí hậu và vị trí trên trái đất, trong không khí, nƣớc hoặc đất.
Nhiều vi sinh vật gây hại cho sức khỏe, chúng là tác nhân gây nên các bệnh
nhƣ viêm da, viêm màng não hay các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Nhiều loại vi
sinh vật hay vi khuẩn có hại cho con ngƣời nhƣng một số lại có lợi nhƣ các loại vi

1.1.1.2. Tạo độc tố
Độc tố vi khuẩn là những chất của vi khuẩn tạo ra có tác dụng gây độc đối
với cơ thể con ngƣời. Độc tố vi khuẩn có hai loại: nội độc tố và ngoại độc tố [26].
Nội độc tố: là những chất mà vi khuẩn sinh ra nằm bên trong tế bào của
chúng, không đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng. Khi tế bào vi khuẩn vào trong tế bào
vật chủ, nó tạo ra độc tố đƣợc giải phóng ra ngoài và gây độc.
Ngoại độc tố là những độc tố do vi khuẩn tạo ra, chúng đƣợc vi khuẩn tiết ra
ngoài môi trƣờng gây độc cho cơ thể vật chủ.
1.1.1.3. Tạo ra các enzym
Vi khuẩn có khả năng tạo ra các enzym gây hại cho tế bào vật chủ nhƣ:
-

Hemolysine: có tác dụng làm tan tế bào.

-

Streptokinase: làm tan fibrin.

-

Hyluronidase: gây tan mô liên kết giúp vi khuẩn có thể lây lan khắp cơ thể.

-

Steptolysin: làm vỡ màng bạch cầu, chống lại hệ miễn dịch của cơ thể.
Ngoài ra vi khuẩn còn có khả năng tiết một số enzyme đề kháng kháng sinh

nhƣ lactamase, acetylase… [26].
1.1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh ở người
1.1.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)

Kháng nguyên O đƣợc coi nhƣ là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế
bào vi khuẩn và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi
gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết. Ngƣng kết kháng
ngyên O tạo thành những hạt nhỏ khó tan.
Kháng nguyên H (kháng nguyên lông – Hauch) là thành phần lông của vi
khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O. Kháng
nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhƣng có khả năng tạo miễn
dịch mạnh. Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O. Kháng
nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và
cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít đƣợc quan tâm
nghiên cứu, nhƣng có ý nghĩa rất lớn trong xác định tên loài của vi khuẩn [25].
Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ bọc – Capsular), còn đƣợc gọi là kháng
nguyên bề mặt (OMP- Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc
(Capsular). Vai trò kháng nguyên K chƣa đƣợc rõ ràng. Có nhiều ý kiến cho rằng,
nó không có ý nghĩa về mặt độc lực của vi khuẩn [25]. Tuy nhiên, một số ý kiến
khác cho rằng nó có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trƣớc
nhƣng yếu tố phòng vệ của vật chủ. Các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có 2
nhiệm vụ sau:

Luận văn thạc sĩ

5

Kisamone SIHAVONG


-

Hỗ trợ phản ứng ngƣng kết của kháng nguyên O, nên thƣờng ghi liền công
thức serotype của vi khuẩn là Ox:Ky, ví nhƣ 0139:K88, 0149:K88… Tạo ra

6

Kisamone SIHAVONG


Hình 1.1. Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) [33].
1.1.2.2 Vi khuẩn Bacillus cereus (B. cereus)
Bacillus cereus là những vi khuẩn Gram dƣơng và có hoạt tính catalase, sử
dụng khí ô xi làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất
(hình 1.2). Những vi khuẩn này đa số không có hại nhƣng một số có thể gây ra một
số dạng bệnh từ thực phẩm tƣơng tự Staphylococcus, làm hỏng thức ăn đó là B.
subtilis và B. coagulans. Đây là vi khuẩn sinh bào tử kỵ khí tùy tiện, tăng trƣởng
trong khoảng nhiệt độ từ 5-50oC, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm dễ dàng. Vi
khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau, quả…). Vi
khuẩn này tiết ra loại độc tố gây nôn mửa [20].

Hình 1.2. Vi khuẩn Bacillus cereus (B. cereus) [34].
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có
thể gây chết ngƣời.
1.1.2.3. Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus)
Staphylococus aureus là các cầu khuẩn Gram dƣơng, có đƣờng kính khoảng
1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hƣớng và thƣờng tạo thành cụm trông
giống nhƣ chùm nho (hình 1.3). Đây là tụ cầu khuẩn đƣợc các nhà vi khuẩn học
Luận văn thạc sĩ

7

Kisamone SIHAVONG




Bƣớc đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là
sự bám dính của tác nhây gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề mặt này bao
gồm: Da, niêm mạc: khoang miệng, mũi hầu, đƣờng tiết niệu. Các tổ chức sâu hơn
gồm tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô.
S. aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất
polypeptide. Tác nhân gây bệnh nhƣ S. aureus mới có khả năng khởi động các quá
trình sinh hóa đặc hiệu nhƣ: tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và hoạt hóa các
chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ. S. aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số
enzyme nhƣ: hyaluronidase, hemolysin, leukocidin…phá hủy các thành phần tế bào
vật chủ.
Hầu hết các chủng S. aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề
mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. S.
aureus có mặt ở khắp nơi trong thiên nhiên nhƣ: không khí, nƣớc, da, họng, mũi,
tóc hay lông của các loại động vật máu nóng… S. aureus là tác nhân gây nhiều bệnh
nhƣ: mụn nhọt, viêm da, viêm phổi, viêm não, viêm tủy xƣơng, viêm cơ tim, hệ
thần kinh trung ƣơng nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thƣơng hậu phẫu [9].
1.1.2.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis (B. subtilis)
Bacillus subtilis là một vi khuẩn Gram dƣơng, có hình que, thƣờng đƣợc tìm
thấy trong đất (hình 1.4). B. subtilis là một bào tử hình thành vi khuẩn, và các bào
tử mà nó tạo ra cho phép nó chịu đƣợc nhiệt độ cao cũng nhƣ môi trƣờng khô, B.
subtilis là vi khuẩn kị khí tùy tiện. B. subtilis có một roi mà làm cho nhu động
nhanh hơn là vi khuẩn đại diện cho loài Bacillus của họ Bacillaceae. Năm 2004,
dựa trên phân tích 16S rRNA ngƣời ta phân chia loài Bacillus thành nhiều họ và
loài tạo bào tử khác nhau. Những thành viên của loài Bacillus đƣợc đề cập ở đây là
loại vi khuẩn Gram dƣơng, kỵ khí hay kỵ khí tùy tiện, tạo nội bào tử [2]. Vi khuẩn
này thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc của đƣờng ruột, chúng đƣợc phân bố hầu hết
trong tự nhiên nhƣ: cỏ khô, bụi, đất, nƣớc, phần lớn chúng tồn tại trong đất, thông
thƣờng đất trồng trọt chứa khoảng 10-100 triệu CFU/g. Kích thƣớc tế bào 0,50,8µm × 1,5-3µm, thƣờng đứng đơn lẻ hoặc chuỗi ngắn [8]. Khuẩn lạc khô, không
có màu hoặc mà xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có


Luận văn thạc sĩ

10

Kisamone SIHAVONG


bào trong cơ thể. Đồng thời chúng là các hợp chất bảo vệ giúp thực vật chống lại
các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm thực vật từ môi trƣờng xung quanh [3].
Các chất thực vật thứ sinh thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh
vật khác nhau ở một nồng độ nhỏ. Những tính chất này có thể khác nhau tùy thuộc
vào cấu trúc hóa học của các nhóm chất nhƣ alkaloid, tannin, flavonoid, tinh
dầu…[3].
1.2.1 Cơ chế kháng khuẩn của thực vật
Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn. Gồm có
penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm
cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu.
Ức chế chức năng của màng tế bào. Gồm có: colistin, polymycin,
gentamicin, amphoterricin. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân
tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài.
Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với
receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính
xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyl transferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn
cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide [28].
Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA
polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành RNA thông tin. Nhóm quinolone ức
chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi

không no và một nhóm C14 hidroxyl nhƣ strophanthidin, oleandrigenin.
bufadieouolid là steroid C 24, chuỗi bện là vòng lacton 6 cạnh, hai lần không no và
một nhóm hydroxyl C14, hƣớng β hoặc nhóm tƣơng tự nhƣ bufalin, marinobufagin
(hình 1.5) [8].

Bufalin

Marinobufagin
Hình 1.5. Nhóm hợp chất glycoside

1.2.2.3. Nhóm hợp chất phenolics
Hợp chất phenolics là một lớn các hợp chất thực vật thứ sinh đƣợc tạo ra
thông qua các sản phẩm của con đƣờng trao đổi chất trong thực vật, có chứa ít nhất

Luận văn thạc sĩ

12

Kisamone SIHAVONG


một vòng thơm mang một hoặc nhiều nhóm thế hydroxyl, phân bố rộng rãi trong
thực vật và có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên [12]. Hiện nay, trên 8000 chất khác
nhau đã đƣợc nhận biết từ các nguồn khác nhau trong tự nhiên [13]. Các hợp chất
phenolics có thể tồn tại ở dạng carbonhydrate hoặc các dạng khác.
Về cấu trúc hóa học, nhóm các hợp chất phenolics có thể đƣợc phân chia thành
2 nhóm lớn là nhóm phenol đơn giản và nhóm polyphenols. Nhóm phenol đơn giản
gồm 2 nhóm chính là nhóm phenolic acids và nhóm coumarins. Nhóm polyphenols
đƣợc chia thành 2 nhóm chính là nhóm flavonoids và nhóm tannins [11, 22].
 Phân nhóm phenolic acids

phát hiện có hơn 4500 loại flavonoids khác nhau tồn tại trong thực vật đã đƣợc nhận
dạng [31].
Trong thực vật, flavonoids giữ rất nhiều vai trò mang chức năng sinh lý, sinh
thái có ý nghĩa quan trọng điều chỉnh sự phân bố năng lƣợng ánh sáng ở lá cây
(flavonol, anthocyanes), làm tăng hiệu quả quang hợp, bảo vệ cây tránh đƣợc những
bức xạ sóng ngắn, có tính kháng khuẩn, kháng nấm, giúp cây tránh đƣợc bệnh tật...
Trong y học, flavonoids đƣợc sử dụng làm thuốc để chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau
nhƣ: thuốc làm bền thành mạch, thuốc chống oxy hóa, thuốc kháng viêm, chống ung
thƣ... Ngoài ra còn rất nhiều các ứng dụng khác phục vụ cho đời sống con ngƣời [31].
Tùy theo mức độ oxy hóa của mạch 3 carbon, sự có mặt hay không có mặt
của nối đôi giữa C2, C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà flavonoids có thể đƣợc chia
thành nhiều phân nhóm phụ khác nhau.

Cyanidin

Epicatechin

Quercetin

Hình 1.8. Một số hợp chất trong nhóm flavonoid
 Phân nhóm Tannins
Tannins là những hợp chất phenolics rất phổ biến trong thực vật bậc cao.
Horvath (1981) đã đƣa ra khái niệm về tannins là những hợp chất phenolics có
trọng lƣợng phân tử cao, có chứa các nhóm hydroxyl và các nhóm chức khác (nhƣ

Luận văn thạc sĩ

14

Kisamone SIHAVONG


15

Kisamone SIHAVONG


malic...và dạng oxit nitơ. Alkaloids không phổ biến rộng ở tất cả các loài thực vật
mà chỉ tập trung ở một số ít loài, chủ yếu đƣợc tìm thấy trong các loài thực vật có
hoa, nhƣng chỉ có khoảng 20% số loại thực vật có hoa là có thể sản sinh ra
alkaloids. Đa số alkaloids không có mùi, vị đắng, một số ít có vị cay, ở dạng chất
rắn có màu trắng, trừ một vài chất có màu vàng (berberin, palmatin) [30]. Về vai trò
sinh học, các alkaloids bảo vê chống sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh và các
loại côn trùng, sâu bệnh ăn lá. Về y học, alkaloids đƣợc sử dụng rất đa dạng: làm
thuốc gây ức chế, hoặt kích thích hệ thần kinh, dùng làm thuốc điều hòa huyết áp,
chữa loạn nhịp tim, kháng khuẩn, thuốc chống ung thƣ và nhiều tác dụng quan trọng
khác. Ba dạng alkaloids điển hình gồm cafein, morphine và nicotin (hình 1.10).

Cafeine

Morphine

Nicotin

Hình 1.10. Nhóm hợp chất alkaloids
1.2.3. Vai trò của các hợp chất thực vật thứ sinh [29]
Các hợp chất thứ sinh có rất nhiều vai trò quan trọng, mang chức năng sinh
thái đặc biệt, giúp cho thực vật sống sót, phát triển và tồn tại:
- Giúp cơ thể chống lại bệnh tật, ký sinh trùng và các vi sinh vật gây nhiễm bệnh.
- Giúp cơ thể chống lại các yếu tố bất lợi trong quá trình sinh tồn.
- Tạo lợi thế cạnh tranh giữa các loài khác nhau.