BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ CẨM HƯỜNG

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN
PRECORE VÀ BASAL CORE PROMOTER
Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN SIÊU VI B MẠN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ CẨM HƯỜNG

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN
PRECORE VÀ BASAL CORE PROMOTER
Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN SIÊU VI B MẠN

CHUYÊN NGÀNH: TRUYỀN NHIỄM VÀ CÁC BỆNH NHIỆT ĐỚI
Mã số: 62 72 38 02


iv

Danh mục đối chiếu thuật ngữ Anh - Việt

vi

Danh mục các bảng

viii

Danh mục các hình

x

Danh mục các biểu đồ, sơ đồ

xi

MỞ ĐẦU.......................................................................................................

1

Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................

4

1.1. Đặc điểm dịch tễ học nhiễm HBV .........................................................

4


33

2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..........................................................

33

2.5. Cỡ mẫu ...................................................................................................

33

2.6. Tiêu chuẩn chọn bệnh và loại trừ ...........................................................

35

2.7. Biến số nghiên cứu ................................................................................

36

2.8. Định nghĩa biến số chính dùng trong nghiên cứu ...................................

37

2.9. Kỹ thuật đo lường biến số ......................................................................

39

2.10. Thu thập và phân tích số liệu ................................................................

42

3.6. Liên quan giữa đột biến vùng precore và basal core promoter với biến 65
chứng ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) ......................................................
Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................

70

4.1. Về phương pháp nghiên cứu ....................................................................

70

4.2. Về đặc điểm dân số nghiên cứu và đặc điểm nhiễm HBV ....................... 71
4.3. Về đặc điểm đột biến ở vùng precore và basal core promoter của dân số 77
nghiên cứu .......................................................................................................
4.4. Về yếu tố liên quan với đột biến A1762T/G1764A và G1896A.............

81

4.4. Về liên quan giữa đột biến A1762T/G1764A, G1896A và thể bệnh 88
viêm gan B mạn bùng phát ..............................................................................
4.5. Về liên quan giữa đột biến vùng Precore và Basal core promoter với 91
biến chứng Xơ gan ..........................................................................................
4.6. Về liên quan giữa đột biến vùng Precore và Basal core promoter với 96
biến chứng HCC ..............................................................................................
KẾT LUẬN ....................................................................................................

103

KIẾN NGHỊ ...................................................................................................

104


Alanine transaminase

APRI

Aspartate aminotransferase to Platelet Ratio index

ARFI

Acoustic Radiation Force Impulse Imaging

AST

Aspartate transaminase

Anti HBc

anti Hepatitis B core

Anti HBe

anti Hepatitis B e

Anti HBs

anti hepatitis B surface

ARMS - PCR

Amplifications refractory mutation system


deoxy Nucleotide triphosphate

DNMD

Dung nạp miễn dịch

EN

Enhancer

G

Guanin

HBcAg

Hepatitis B core antigen

HBeAg

Hepatitis B e antigen

HBsAg

Hepatitis B virus surface antigen

HBV

Hepatitis B virus

Odd Ratio

ORF

Open reading frame

PC

Precore

PCR

Polymerase chain reaction

pgRNA

pregenomic Ribo Nucleic acid

rcDNA

relaxed circular DeoxyRibo Nucleic acid

RE

Restriction enzyme

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism


Vaccin escape mutant


vi

DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT
Từ viết tắt
APRI

Thuật ngữ tiếng Anh
Aspartate aminotransferase to
Platelet Ratio index

Thuật ngữ tiếng Việt
Chỉ số tỷ số AST trên tiểu cầu

Anti HBc

anti Hepatitis B core

Kháng thể chống kháng nguyên lõi

Anti HBe

anti Hepatitis B e

Kháng thể chống kháng nguyên e

Anti HBs


CTL

Cytotoxic T lymphocyte

Tế bào lympho T gây độc

EN

Enhancer

Tăng cường

HBcAg

Hepatitis B core antigen

Kháng nguyên lõi của HBV

HBeAg

Hepatitis B e antigen

Kháng nguyên HBe

HBsAg

Hepatitis B virus surface
antigen

Kháng nguyên bề mặt HBV


Multiplex ligation-dependent

Kỹ thuật khuếch đại phụ thuộc

probe amplification

mẫu dò

mRNA

Messenger RiboNucleic acid

RNA thông tin

OR

Odd Ratio

Tỉ số chênh

ORF

Open reading frame

Khung đọc mã mở

PCR

Polymerase chain reaction


dụng Enzym cắt giới hạn

RT

Reverse transcriptase

Men sao mã ngược

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

SNP

Single nucleotide
polymorphism

Đột biến một nucleotide

ULN

Upper limit normal

Giới hạn trên so với bình thường

VEM



Bảng 3.5: Tỉ lệ đột biến vùng BCP của dân số nghiên cứu …………………………

52

Bảng 3.6: Tỉ lệ đột biến vùng Precore và vùng Core ……………………………….

53

Bảng 3.7: Phân bố đột biến A1762T/G1764A theo tuổi, giới, đặc điểm nhiễm HBV

57

Bảng 3.8: Các yếu tố liên quan với đột biến với A1762T/G1764A-Phân tích đa biến

58

Bảng 3.9: Phân bố đột biến G1896A theo tuổi, giới, đặc điểm nhiễm HBV ………

59

Bảng 3.10: Các yếu tố liên quan với đột biến Precore – Phân tích đa biến ………….

60

Bảng 3.11: Phân bố thể bệnh viêm gan hoạt tính theo tình trạng đột biến G1896A và

60

A1762T/G1764A ………………………………………………………………


Bảng 3.19: Phân bố đột biến vùng Basal core promoter ở nhóm có và không có HCC

67

Bảng 3.20: Phân bố đột biến vùng Precore, core ở nhóm có và không có HCC ……..

67

Bảng 3.21: Các yếu tố liên quan độc lập với biến chứng HCC – Phân tích đa biến …. 68


x

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Phân bố địa lý của nhiễm HBV trên thế giới ................................

5

Hình 1.2: Phân bố genotype của HBV trên thế giới ......................................

6

Hình 1.3: Diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV mạn ..............................................

10

Hình 1.4: Cấu trúc của HBV .........................................................................



xi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thực hiện …………………………………………………..

44

Sơ đồ 2.2: Mô hình nghiên cứu ……………………………………………...

45

Sơ đồ 3.1: Thu nhận mẫu nghiên cứu ………………………………………

46

Biểu đồ 3.1: Phân bố tuổi theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV ……………….

49

Biểu đồ 3.2: Tải lượng HBV theo giai đoạn nhiễm HBV ………………….

50

Biểu đồ 3.3: Lượng HBsAg theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV …………….

51

Biểu đồ 3.4. Phân bố đột biến T1753V, A1762T/G1764A, G1896A ở các

thế hơn ở vùng phân bố của genotype B và D (93% ở Trung Đông, 52% ở Châu Á
Thái Bình Dương) [48]; đột biến A1762T/G1764A ưu thế hơn ở vùng lưu hành của
genotype C [28].
Cho đến nay, vẫn còn nhiều ý kiến trái chiều về chủng đột biến vùng PC, BCP
là có lợi hay có hại. Đa số tác giả cho rằng khi chủng đột biến trở nên ưu thế trong
quần thể, vai trò kiểm soát miễn dịch của người nhiễm mạn tính đối với HBV không
còn hiệu quả, siêu vi tái hoạt và kích thích miễn dịch như một chủng HBV mới, gây
nên những đợt thải trừ miễn dịch mới làm cho diễn tiến bệnh gan trở nên không ổn
định, diễn biến suy gan và biến chứng [83], [156]. Các nhận định này dựa trên các tỷ
lệ các đột biến vùng PC, BCP thấp được tìm thấy ở người lành mang HBV và cao
hơn ở người có viêm gan hoạt tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC)
[148, 163], [12, 170]. Ngược lại, có tác giả lại cho rằng các đợt viêm gan cấp liên




2

quan với hình thành chủng đột biến tạo nên cơ hội thải trừ HBV hiệu quả hơn, chuyển
huyết thanh HBeAg, thậm chí có thể chuyển huyết thanh HBsAg [159].
Từ năm 2010, đột biến G1896A và A1762T/G1764A được Chu và cộng sự đề
nghị xem là một trong các tiêu chí để phân biệt trạng thái mang HBV không hoạt tính
và viêm gan B mạn tái hoạt [32]; đột biến A1762T/G1764A còn được Kao và cộng
sự đề nghị sử dụng trong thang điểm đánh giá nguy cơ HCC khi quản lý bệnh nhân
nhiễm HBV mạn năm 2014 [70].
Cho đến nay, dữ liệu được công bố về tỷ lệ đột biến khác nhau nhiều giữa các
nghiên cứu có lẽ do sự khác biệt về phân bố nhóm tuổi, genotype, mức độ bệnh lý
gan, giai đoạn diễn biến nhiễm HBV, tải lượng HBV và giai đoạn có biến chứng xơ
gan, HCC. Tại Việt Nam, tỷ lệ G1896A trong nghiên cứu của tác giả Trần Thiện Tuấn
Huy (năm 2004) là 32,8% [60] và của tác giả Dunford L. 8 năm sau đó (năm 2012)


Xác định các yếu tố liên quan đến đột biến A1762T/G1764A và G1896A.

3.

Phân tích liên quan giữa đột biến vùng Precore và vùng Basal core promoter với

thể bệnh viêm gan B mạn bùng phát, biến chứng xơ gan và HCC ở bệnh nhân nhiễm
HBV mạn.




4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC NHIỄM HBV
1.1.1.

Tỷ lệ nhiễm HBV trên thế giới

Nhiễm HBV là một trong các vấn đề sức khoẻ toàn cầu quan trọng. Theo thống
kê của Tổ chức Y tế Thế giới, toàn thế giới có khoảng 2 tỉ người, tương đương với
một phần ba dân số đã từng nhiễm HBV (anti HBc dương), gây khoảng 257 triệu
người nhiễm HBV mạn [154]. Tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính (có dấu ấn HBsAg dương
tính) trong cộng đồng thay đổi từ 2-20% [69, 94]. Về phân bố của nhiễm HBV, thế
giới được chia thành 3 vùng lưu hành. Vùng lưu hành cao có ≥ 8% dân số mang
HBsAg. Vùng lưu hành trung bình có 2-7% dân số và vùng lưu hành thấp có < 2%
dân số mang HBsAg.

Quảng Trị năm 2007, tác giả Le Viet ghi nhận có 11,4% có HBsAg (+), 51,7% anti
HBc (+) [151]. Năm 2012, nhóm nghiên cứu gồm có tác giả Dunford và cộng sự khảo
sát 8654 mẫu máu ở Hà Nội, Hải Phòng, Khánh Hòa và Cần Thơ cũng ghi nhận tỷ lệ
mang HBsAg trong dân số nghiên cứu là 10,7%, tỷ lệ mang HBsAg trong nhóm nguy
cơ thấp (phụ nữ có thai, người nhập ngũ, người bệnh phẫu thuật, người cho máu) là
9,4% và cao hơn ở nhóm IDU là 17,4%, nhóm chạy thận nhân tạo là 14,3% [38].

Hình 1.1: Phân bố địa lý của nhiễm HBV trên thế giới.
“Nguồn: WHO, 2015” [154].
1.1.3.

Phân bố dịch tễ genotype của HBV trên thế giới và Việt Nam

Dựa trên trình tự bộ gen vào mức độ khác biệt về trình tự acid amin của gen S
(> 8% hoặc từ 4-8%), người ta đã xác định 10 genotype (từ A tới J) và phụ type khác
nhau của HBV. Phân bố genotype và phụ type của HBV khác nhau theo vùng địa lý
[36]. Genotype A có tỷ lệ nhiễm cao ở vùng Châu Phi cận Sahara (phụ type A1), Bắc
Âu (phụ type A2), và Tây Phi (phụ type A3), Ấn Độ và một số khu vực ở Nam Mỹ.




6

Genotype B và C thường gặp ở vùng châu Á Thái Bình Dương. Tuy nhiên tỷ lệ
genotype B và C thay đổi khác nhau giữa các nước châu Á [69]. HBV Genotype C
phổ biến hơn genotype B ở Trung Quốc, Nhật và Hàn Quốc, trong khi đó genotype
B chiếm ưu thế tại Đài Loan và Việt Nam.
Genotype D thường gặp ở vùng phía nam châu Âu, vùng Trung Đông và các
vùng tiểu lục địa Ấn Độ. Genotype E và F thường gặp theo thứ tự ở Tây Phi và Nam

bệnh lây truyền qua đường máu và quan hệ tình dục cũng nhận thấy đến 85% nhiễm
genotype B (genotype B4 ưu thế 82,6%, genotype B2 chiếm 2,7%) và gần 15%
genotype C (trong đó C1 (14,6%), C5 (0,5%) [38]. Hầu hết các nghiên cứu trên bệnh
nhân nhiễm HBV Việt Nam đều cho thấy genotype B là nhóm genotype ưu thế, chiếm
≥ 2/3 bệnh nhân.
Gánh nặng bệnh tật do nhiễm HBV
Khoảng 15-40% bệnh nhân nhiễm HBV mạn sẽ phát triển bệnh lý xơ gan, bệnh
gan giai đoạn cuối hay HCC trong suốt đời sống. Trên thế giới nhiễm HBV được ước
tính là nguyên nhân gây ra 30% xơ gan và 53% HCC. Mặc dù nhiễm HBV đã có vắc
xin phòng ngừa hiệu quả > 20 năm và tỷ lệ nhiễm HBV đang có xu hướng giảm dần
nhưng các bệnh lý gan liên quan đến HBV (đặc biệt là xơ gan và HCC) vẫn còn tiếp
tục tăng thêm nhiều thập niên qua và còn tiếp tục là vấn đề sức khoẻ quan trọng cho
đến năm 2025 theo các phân tích dự báo. Theo số liệu tính toán của thế giới, có
khoảng 600.000 người tử vong hàng năm do bệnh lý có liên quan đến HBV, hầu hết
(94%) tử vong do biến chứng của xơ gan mất bù, suy gan và HCC [39].
Tiêm chủng mở rộng phòng ngừa bệnh viêm gan siêu vi B được áp dụng ở Việt
Nam từ 2003 và giúp giảm 90% nhiễm HBV ở trẻ sơ sinh, tuy nhiên theo mô hình




8

toán học thì Việt Nam vẫn phải chịu đựng gánh nặng bệnh tật trong nhiều thập kỷ
nữa. Theo ước tính năm 2005, Việt Nam có khoảng 8,4 triệu người nhiễm HBV mạn
và khoảng 23.300 người tử vong do bệnh lý liên quan đến HBV [150]. Theo mô hình
dự đoán của tác giả Nguyễn Thị Thúy Vân, vào năm 2025 số lượng người nhiễm
HBV sẽ giảm còn 8 triệu người, số bệnh nhân xơ gan là 58.650, HCC là 25.000 và số
ca tử vong có liên quan đến HBV sẽ tăng đến 40.000 [150].
Ở vùng Đông Nam Á, vùng lưu hành cao của chủng HBV genotype B và C.

đột biến G1896A hay A1762T/G1764A vẫn còn nhận được nhiều chú ý và tranh cãi.
Nghiên cứu thực hiện ở bệnh nhân Đài Loan cho thấy genotype B tăng nguy cơ HCC
[20], nghiên cứu phân tích gộp của tác giả Wong (2013) chứng minh nguy cơ HCC
cao hơn ở genotype C so với genotype A và D [155]. Trong khi đó, trong các nghiên
cứu ở bệnh nhân người Nhật hay Trung Quốc thì nguy cơ HCC không liên quan với
genotype B hay C. Những hiểu biết sau khi có ứng dụng sinh học phân tử cho thấy
đột biến kép A1762T/G1764A gây tăng nguy cơ HCC ở những bệnh nhân nhiễm
HBV trên các genotype khác nhau. Bệnh nhân nhiễm HBV mạn có uống rượu tăng
nguy cơ HCC gấp 2 lần. Trong nghiên cứu đoàn hệ REVEAL thực hiện ở Đài Loan
(năm 2007) ở 22.472 người nhiễm HBV mạn, ghi nhận bệnh nhân nhiễm HBV có tỷ
lệ sống còn thấp hơn người không nhiễm, nguy cơ tử vong do nguyên nhân bất kỳ
tăng 1,7 lần, nguy cơ tử vong do HCC tăng 22,4 lần, nguy cơ tử vong do bệnh gan
mạn, xơ gan tăng 5,4 lần so với người không nhiễm HBV [62].
1.2. BỐN GIAI ĐOẠN DIỄN TIẾN TỰ NHIÊN CỦA NHIỄM HBV MẠN
Diễn tiến tự nhiên của viêm gan B mạn có thể được chia thành 4 giai đoạn theo
hoạt tính của miễn dịch với HBV: giai đoạn dung nạp miễn dịch (immune tolerance),
giai đoạn thải trừ miễn dịch (immune clearance); giai đoạn kiểm soát miễn dịch
(immune control); giai đoạn trốn thoát miễn dịch (immune escape) có tái hoạt siêu vi
trở lại hay có thể được thay bằng giai đoạn hồi phục (resolution) [91]. Diễn tiến bệnh
lý gan là hậu quả của quá trình tác động lẫn nhau giữa siêu vi và đáp ứng miễn dịch
của cơ thể chủ với các kháng nguyên của siêu vi B được mã hóa riêng biệt (encoded
antigens) [103], giải thích cho mối liên quan rõ rệt với tổn thương gan và hoạt tính
sao chép của siêu vi [71]. Những yếu tố đã được biết như các đặc điểm siêu vi HBV
như genotype, tải lượng siêu vi, đặc điểm bộ gen (hay đột biến của HBV) hay những
yếu tố của cơ thể chủ như giới tính, việc uống rượu bia, đồng nhiễm siêu vi khác,
mức độ suy giảm miễn dịch, đồng nhiễm siêu vi viêm gan C có liên quan chặt chẽ
với tiến triển và dự hậu của bệnh gan [105]. Tỷ lệ diễn tiến sang xơ gan hàng năm




ủ bệnh của nhiễm HBV cấp, kéo dài 2-4 tuần và nhiều khi không nhận biết được [43].
1.2.2. Giai đoạn thải trừ miễn dịch hay viêm gan B mạn HBeAg dương
Trong giai đoạn thứ hai của nhiễm HBV mạn tính, giai đoạn viêm gan B mạn
HBeAg dương (CHBe(+), Chronic Hepatitis B HBeAg positive) hay giai đoạn miễn
dịch thải trừ siêu vi do gia tăng đáp ứng miễn dịch gây tổn thương gan, biểu hiện là
men gan tăng và biến đổi mô học biểu hiện thành hình ảnh viêm ở nhu mô gan và
giảm tải lượng HBV dần dưới áp lực miễn dịch, với HBV DNA > 2.000 IU/ml, lượng
HBsAg thấp hơn giai đoạn DNMD (4,3 log IU/ml) [74]. Dưới áp lực miễn dịch, chủng
siêu vi đột biến sẽ được chọn lọc dần nhưng chủng hoang dại vẫn còn ưu thế hơn ở
giai đoạn này.
Ở người nhiễm HBV khi tuổi lớn thì giai đoạn này sẽ diễn biến bệnh cảnh viêm
gan siêu vi B cấp có hay không có triệu chứng. Ngược lại ở người nhiễm HBV lúc sơ
sinh sau 2 thập kỷ yên lặng sẽ có biểu hiện thành từng đợt tăng men gan, có lúc > 5
ULN, có biến đổi mô học gan và giảm tải lượng HBV tương tự, nhưng đáp ứng miễn
dịch không đủ mạnh để thải trừ được siêu vi, không gây chuyển đổi được HBeAg sau
nhiều đợt viêm gan. Có < 3% trường hợp có thể diễn biến bệnh cảnh viêm gan bùng
phát đưa đến bệnh gan mất bù. Giai đoạn viêm gan có hoạt tính này có thể kéo dài
nhiều thập kỷ, khoảng 65% bệnh nhân thải trừ được HBeAg và ức chế kéo dài được
HBV. Số còn lại mang HBeAg kéo dài và có thể tiến triển đến xơ gan [45].
Trong trường hợp nhiễm HBV lúc sơ sinh qua lây truyền mẹ con, giai đoạn này
thường xảy ra ở tuổi 20-30 hay có thể nhỏ hơn. Ở trẻ nhỏ, khả năng chuyển đổi huyết
thanh khoảng 2% trong 3 năm đầu. Ở trẻ lớn hơn có thể tăng đến 4-5% trong 3 năm
đầu [103]. Ở người lớn có tăng men gan, chuyển đổi huyết thanh HBeAg tự nhiên có
thể xảy ra nhiều hơn, tỷ lệ 10-15% mỗi năm [43].




12


miễn dịch mất kiểm soát hay giai đoạn trốn thoát miễn dịch. Vì thế, bệnh nhân ở giai