BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ
VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP. TRONG
THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện

: TRẦN THỊ NHỚ

MSSV: 1151110243

Lớp: 11DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

vững chắc cho tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công
trong sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Sinh
Học Nhiệt Đới luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công
việc.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
TP. HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nhớ


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt ............................................................................................v
Danh mục các hình ......................................................................................................vi
Danh mục các bảng ....................................................................................................vii
Danh mục các sơ đồ ................................................................................................. viii
Danh mục các đồ thị .................................................................................................
viii

Chương

1

MỞ

ĐẦU


học

của

protease

vi

sinh

vật

2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease
.............13
2.2.5. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease
.........15
i


Đồ án tốt nghiệp
2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật..........................................................................16
2.3. Trùn quế...............................................................................................................17
2.3.1. Phân loại và đặc điểm của trùn quế .................................................................17
2.3.2. Đặc tính sinh học của trùn quế.........................................................................18

i


Đồ án tốt nghiệp


ii


Đồ án tốt nghiệp

3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học ........................................................36
3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn..................................................................................36
3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease ..............................37
3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease .....37
3.4.4.4. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease .....................................38
3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế ....................38
3.4.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu ..........................................................38
3.4.5.2. Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế .....................39
3.4.5.3. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng
Nitơ tổng số) ...............................................................................................................40
3.4.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson
cải tiến.........................................................................................................................41
3.4.5.5. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin ...................................44
3.4.6. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease....................45
3.4.6.1. Xác định nhiệt độ tối ưu ................................................................................45
3.4.6.2. Xác định pH tối ưu ........................................................................................45
3.4.7. Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế ............................46
3.4.7.1. Khảo sát nồng độ cơ chất ..............................................................................46
3.4.7.2. Khảo sát nồng độ enzyme .............................................................................47
3.4.7.3. Khảo sát thời gian thủy phân ........................................................................47
3.4.8. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm. .............................................................48
3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu..................................................49
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................50
4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp.......................50
4.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm Probiotic ...................50

5.2. Kiến nghị .............................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................80

4


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
OD

Optical density

UI

Unit International

MR

Methyl red

CFU

Colonies Form Unit

TCA

Trichloroacetic acid

EDTA

Hình 4.6. kết quả thử nghiệm methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6 ..............................54
Hình 4.7. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1 .....................55
Hình 4.8. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5 .....................56
Hình 4.9. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6 .....................57

6


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease............................13
Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá .........................................22
Bảng 3.1. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin ...................................................42
Bảng 3.2. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu.....................42
Bảng 3.3. Lập đường chuẩn Albumin .......................................................................44
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v) .................................................46
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%) .......................................................47
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân..........................................................48
Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm .........................51
Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát
.....................................................................................................................................58
Bảng 4.3. Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng ..............59
Bảng 4.4. Kết quả xác định vòng phân giải casein của enzyme protease thu nhận từ
3 chủng sau 48 giờ......................................................................................................59
Bảng 4.5. Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân
....................60
Bảng 4.6. Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt trùn quế bằng enzyme
thương
phẩm và enzyme chế phẩm ........................................................................................70

viii


Đồ án tốt nghiệp

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của
đời sống con người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp,
chăn nuôi, y tế,...và là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình thúc đẩy
sự phát triển của ngành chế biến thức ăn thủy sản. Trong những năm gần đây thủy
sản đã trở thành nền kinh tế mũi nhọn ở nước ta, sản lượng thủy sản ngoài đáp ứng
nhu cầu tiêu thụ trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường các nước Châu Âu, Mỹ,
Nhật Bản, Hàn Quốc...Để tăng năng suất và lợi nhuận người nuôi đã tăng mật độ
giống, sử dụng thuốc hóa học để phòng và trị bệnh đã làm xáo trộn hệ sinh học tự
nhiên, ô nhiễm môi trường và thêm vào đó là ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản.
Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi
trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm
sử dụng một số loại thuốc, mà thay vào đó là các sản phẩm sinh học giúp tăng
cường sức đề kháng bệnh, tăng khả năng hấp thụ dưỡng chất, hay làm sạch môi
trường nước bằng cách bổ sung thêm những vi sinh vật có lợi. Chế phẩm sinh học
hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao
khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột,
ức chế vi sinh vật có hại. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá
trình tiêu hoá (nhờ những hệ enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm chuyển hóa
trong quá trình lên men của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh.
Thêm vào đó, việc ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm
hữu cơ trong thức ăn chăn nuôi cũng là một trong những hướng nghiên cứu chính
nhận được nhiều sự quan tâm của cả các nhà khoa học và người chăn nuôi. Với hàm

Sử dụng các phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương
pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2013 và phần mềm
statgraphics.
1.5. Kết cấu của đồ án
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Mở đầu.
Chương 2: Tổng quan tài liệu.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
Chương 4: Kết quả và thảo luận.
Chương 5: Kết luận và kiến nghị.

2


Đồ án tốt nghiệp

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp.
2.1.1. Phân loại
Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong thời gian dài ở điều kiện bất
lợi, nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn.
Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Fimicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Chi Bacillus là một chi lớn, đa dạng và thuộc họ Bacillaceae. Với một số loài
thường gặp trong tự nhiên như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus

vào nguồn cơ chất khác nhau sẽ sinh enzyme khác nhau như nguồn cơ chất là
cellulose thì sẽ sinh tổng hợp enzyme cellulase,...Nhiều trong số các enzyme ngoại
bào này là enzyme thủy phân của các phân tử hữu cơ lớn, chính vì thế vi khuẩn này
có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như công nghệ sản xuất chất tẩy
rửa, công nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghệ dược phẩm, công nghệ
thuộc da, công nghệ dệt và trong xử lý chất thải.
2.1.3. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào tử
trong những điều kiện nhất định. Bào tử không hình thành trong suốt quá trình hoạt
động tăng trưởng và phân chia tế bào, thường khi gặp điều kiện bất lợi về môi
trường, thiếu
4


Đồ án tốt nghiệp

dinh dưỡng,…thì nội bào tử mới được hình thành. Bào tử có hình oval và có khuynh
hướng phình ra ở một đầu, do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử được
cho là dạng tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào, tồn tại
lâu dài trong điều kiện khắc nghiệt.
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:
 ình thành vách ngăn.
H
Sự tạo tiền bào tử.
Tạo lớp vỏ bào tử.
Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
Sự giải phóng bào tử.

Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử
www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop sv.html




Tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường nước như

phân
hủy các chất thải hữu cơ, giảm chất độc NH3 và H2S, giảm chất dư thừa tích tụ ở đáy
ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi.
 Ức chế các tác nhân gây bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng sinh, cạnh
tranh
dinh dưỡng và môi trường sống.
 Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự
phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (như vi khuẩn Vibrio) giữ cho môi
trường luôn
ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này.
Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh ra các hoạt chất có
hoạt tính sinh học và ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã
nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp. đóng vai trò quan trọng trong việc cải
thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong quá trình chuyển đổi
vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp. làm giảm tích lũy chất hữu cơ và
các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Một số loài của nhóm
6


Đồ án tốt nghiệp
vi khuẩn Bacillus sp. (B. Subtilis, B. Licheniformis, B. Megaterium,…) dùng để
làm

7


thức B37 cao nhất (93,33 ± 1,65%), còn đối chứng thấp nhất (69,52 ± 1,65%) (p

tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác
nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ
phân triệt để và đa dạng.
Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử
dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học.
Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus
cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc:
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein gồm nhiều các
amino acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi
polypeptide có cấu trúc rất phức tạp và chúng phân giải các liên kết peptide tạo các
acid amin đơn giản, dễ hấp thu. Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá,
trứng, đậu tương…

11


Đồ án tốt nghiệp

2.2.2. Phân loại protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)

Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)

Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Serine proteinase

12




Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serine

trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc
tác của enzyme. Các Serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm
tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.


Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm

hoạt
động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cysteine
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.


Aspartic proteinase: hầu hết các Aspartic proteinase thuộc nhóm

pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,
cathepsin, renin. Các Aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung
tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
