TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT
ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia lingua
(Thunb.)Farwell) HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

Phú Thọ, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT
ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia lingua
(Thunb.)Farwell) HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. Triệu Quý Hùng
Trường Đại học Hùng Vương


- i-

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .......................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ vi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do lựa chọn đề tài .................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia ...................................................................... 4
1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ ............................................................... 7
1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Pyrrhosia .......................................... 8
1.4 Sơ lược về lớp chất steroid ..................................................................... 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU............................................................................................................. 13
2.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 13
2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị ...................................................................... 13
2.2.1 Nguyên vật liệu ................................................................................... 13
2.2.2 Thiết bị nghiên cứu.............................................................................. 14
2.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 17
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết ..................................................................... 17
2.3.2 Phương pháp sắc ký ............................................................................. 18
2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng .......................................................... 18
2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột .................................................................... 20
2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc ............................................................ 21



1

H-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân proton

13

C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân carbon 13

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT

IS

Infrared spectroscopy: Phổ hồng ngoại

ESI-MS

ElectroSpray lonization Mass Spectrometry: Phổ khối lượng

s: singlet

d: doublet

t: triplet


Hình 3.1. Ngâm mẫu Thạch vĩ...................................................................... 25
Hình 3.2. Cặn EtOAc Thạch vĩ ..................................................................... 26
Hình 3.3. Kết quả khảo sát TLC cặn chiết EtOAc Thạch vĩ .......................... 27
Hình 3.4. TLC cặn EtOAc Thạch vĩ với hệ dung môi (III) ........................... 27
Hình 3.5. Cột tổng silica gel cặn EtOAc ....................................................... 29
Hình 3.6. Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F7 ............................................ 31


- v-

Hình 3.7. Cột phân đoạn F2.......................................................................... 32
Hình 3.8. Hình ảnh TLC các phân đoạn F2.1÷F2.9 ...................................... 34
Hình 3.9. Cột phân đoạn F2.9 ....................................................................... 35
Hình 3.10. Hình ảnh TLC các phân đoạn F2.9.1÷F2.9.8............................... 36
Hình 3.11. Hình ảnh TLC điều chế phân đoạn 2.9.1 ..................................... 37
Hình 3.12. Hình ảnh TLC hiện màu bằng đèn tử ngoại................................. 37
Hình 3.13. Sơ đồ phân lập dịch chiết EtOAc cây Thạch vĩ .......................... 38
Hình 3.14. Hình ảnh chất PLEA5 và sắc ký TLC ........................................ 38
Hình 3.15. Cấu trúc của hợp chất PLEA5 ..................................................... 39
Hình 3.16. Phổ ESI-MS của PLEA5 ............................................................. 39
Hình 3.17. Phổ IR của PLEA5...................................................................... 40
Hình 3.18. Phổ 1H-NMR của hợp chất PLEA5 ............................................. 41
Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của PLEA5 .......................................................... 42


- vi-

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng.......................... 28
Bảng 3.2. Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng EtOAc ..................... 29


topotecan

của

camptothecin,

alkaloit

được

phân

lập

từ Camptotheca accuminata Decne. (Nyssaceae), hay thuốc chống sốt rét
artemisinin từ Artemisia annua L. (Asteraceae) là những hợp chất minh họa
điển hình. Nhu cầu điều trị các loại bệnh khác nhau, cùng với hiện tượng


-2-

kháng thuốc trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, ung thư, thúc đẩy các nhà
nghiên cứu phát hiện các tác nhân điều trị mới với cơ chế tác dụng mới.
Nguồn sinh vật, đặc biệt là các cây thuốc cổ truyền, vẫn tiếp tục là mối
quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt
tính sinh học, vì tính đa dạng của chúng thường hứa hẹn sự phong phú của
các chất hóa học với cấu trúc mới lạ. Tiềm năng của thực vật bậc cao là nguồn
cung cấp dược phẩm mới nhưng chỉ được khảo sát bước đầu. Trong số các
sinh vật thì chỉ một tỷ lệ phần trăm nhỏ đã được nghiên cứu về mặt hóa học

dịch chiết ethyl acetate cây Thạch vĩ (Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell)
họ Dương xỉ (Polypodiaceae)”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Điều chế cặn dịch chiết EtOAc (ethyl acetate) của cây Thạch vĩ.
- Phân lập chất sạch từ các phân đoạn của dịch chiết EtOAc cây Thạch
vĩ.
- Xác định cấu trúc chất phân lập được bằng các phương pháp phổ cộng
hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng, phổ hồng ngoại.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học:
+ Kết quả của đề tài đóng góp thông tin cho lĩnh vực nghiên cứu hóa học
các hợp chất thiên nhiên về thành phần hóa học của cây Thạch vĩ.
+ Cho biết thành phần hóa học của cây Thạch vĩ.
+ Cung cấp dữ liệu về phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ hồng ngoại, phổ
khối lượng của một số hợp chất thiên nhiên được phân lập từ cây Thạch vĩ.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Bước đầu định hướng cơ sở hóa học trong việc sử dụng cây Thạch vĩ
trong thực tiễn cuộc sống.
+ Góp phần nâng cao kiến thức về kỹ thuật chiết tách, phân lập hợp chất
thiên nhiên, về xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho sinh viên.
+ Đề tài còn là tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành hóa học và cán bộ
nghiên cứu hóa học hữu cơ.


-4-

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia
Về thực vật, chi Pyrrhosia thuộc họ Dương xỉ (Polypodiaceae) ở dạng ổ
túi bào tử tròn hoặc thuôn và xếp thành nhiều hàng, chéo gốc với gân giữa và

Cây thảo sống nhiều năm, cao 10-30 cm, có thân rễ bò dài mang vẩy thon,
mép gợn sóng. Cuống 2-10 cm, mảnh, có đốt ở gốc, phiến hơi đa dạng, tròn
dài, nhỏ hay hẹp thon, dài 8-18 cm, rộng 2-5 cm, dai, gân phụ rõ, mặt trên cây
gần như không lông, mặt dưới có lông hình sao vàng hoe. Ổ túi bào tử phủ
kín mặt dưới, màu đỏ đậm; bào tử xoan, nâu nhạt. Phân bố ở Nhật Bản, Đài
Loan, Nam Trung Quốc và Việt Nam. Ở nước ta, gặp nhiều nơi từ Cao Bằng,
Lạng Sơn, Lào Cai, Phú Thọ, Hà Tây, đến Thừa Thiên-Huế và Lâm Đồng.
Cây phụ sinh trên thân cây và bám trên đá trong rừng ở độ cao 100-1800m.
Có nơi cây mọc thành những đám rất lớn. Người ta đã biết trong lá có
phytosterol, tanin pyrocatechic, những đường khử ôxy, các chất béo và các
chất vô cơ; còn có diplopten, β-sitosterol. Dân gian dùng cây, lá làm thuốc lợi
tiểu chữa bệnh đái buốt, đái dắt, viêm niệu đạo, đái ra máu, đái ra sỏi... nhưng
khi dùng phải bỏ những lông trên lá. Thân rễ còn được dùng chữa bệnh than,
ung nhọt, lở loét, ngộ độc do lưu huỳnh hoặc dùng khô tán bột trộn với dầu
vừng bôi lên đầu cho tóc đen và làm cho tóc mọc nhanh. Ở Trung Quốc, toàn
cây và lá được dùng trị viêm thận thủy lũng, viêm nhiễm đường niệu, viêm
phế quản, viêm bàng quan, suyễn khan, phổi có mủ, khạc ra máu, đái ra máu,
đại tiện ra máu, băng lậu và bế kinh. Thường dùng dạng thuốc sắc. Còn dùng
ngoài chữa ngoại thương xuất huyết.
Pyrrhosia mollis (G. Kunze) Ching – Ráng tai chuột mềm, Thạch vĩ
lông mềm. Cây cao 15-30 cm, thân rễ bò dài, phủ vẩy hình khiên, hai màu
(giữa nâu thẫm, mép vàng nhạt). Lá xanh thẫm và mỏng, mặt lá phủ lông
mềm hình sao. Ổ túi bào tử phân bố khắp mặt dưới phiến lá; bào tử khá lớn,
bề mặt có hạt nhỏ. Phân bố ở Trung Quốc và nhiều nước nhiệt đới châu Á: Ấn
Độ, Mianma, Lào, Việt Nam, Inđônêxia, Philippin. Ở nước ta, có gặp tại Lào
Cai (Sa Pa), Lâm Đồng ( Đà Lạt). Cây mọc chủ yếu trong rừng ẩm và bóng ở
độ cao 200-2300 m trên mặt biển. Toàn cây được dùng làm thuốc. Ở Vân
Nam (Trung Quốc), cây được dùng trị viêm bể thận, viêm bàng quang, sỏi



dưới mang một lớp lông dày màu hơi xám, những lông hình sao có cánh cứng
và dày. Ổ túi bào tử phủ nhận phần cuối cùng của phiến, tạo thành những


-7-

nhóm xiên gồm 2-3 hàng ổ túi. Bào tử hình trái xoan, màu vàng. Loài của Bắc
Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở nước ta, có gặp tại Hà Tây (Ba Vì), Lào
Cai (Sa Pa) và Ninh Bình (Cúc Phương). Cây mọc bám trên cây to, trên đá
trong rừng núi đá ở nới khô ráo. Ở Trung Quốc, lá cây được dùng làm thuốc
trị bệnh lậu và ho do phổi nóng.
Pyrrhosia sheareri (Baker) Ching – Ráng tai chuột Shearer, Thạch vĩ
cụt. Cây thảo sống nhiều năm cao 30- 36 cm, có thân rễ mọc bò, ngắn, mang
nhiều rễ và vẩy thon. Lá đính gần nhau; cuống dài đến 20 cm, trần, nhẵn, có
đốt ở gốc; phiến dài 15- 30 cm, rộng 3-7 cm; gốc lõm một bên, mặt trên có
các lỗ nước (thủy khổng) và vài lông hình sao, mặt dưới đầy lông hình sao
màu gạch. Các ổ túi khít nhau, sau hòa vào nhau. Loài của Nam Trung Quốc
và Bắc Việt Nam. Ở nước ta có gặp tại Lai Châu, Lào Cai, Ninh Bình. Cây
thường mọc trên đá và trên thân cây gỗ trong rừng ẩm vùng núi ở độ cao 5002290 m. Toàn cây được dùng làm thuốc thanh nhiệt, lợi niệu, thông lâm; cũng
dùng như Thạch vĩ để trị bệnh lậu, đái ra máu, sỏi niệu, viêm thận, băng lậu,
lỵ, ho do phổi nóng, viêm khí quản mạn tính, nhọt có mủ vàng …
1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ
Cây Thạch vĩ (Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell.) có dạng cây thảo
sống nhiều năm, cao 10–30 cm, có thân rễ bò dài mang vẩy thon, mép gợn
sóng. Cuống 2–10 cm, mảnh, có đốt ở gốc; phiến hơi đa dạng, tròn dài, nhỏ
hay hẹp thon, dài 8–18 cm, rộng 2–5 cm, dai, gân phụ rõ, mặt trên gần như
không lông, mặt dưới có lông hình sao vàng hoe.

Hình 1.1. Hình ảnh cây Thạch vĩ


Năm 1997, tác giả Kazuo Masuda và cộng sự đã phân lập từ thân và rễ
cây Thạch vĩ Pyrrosia lingua năm hợp chất triterpenoids: 22,28-epoxyhopane
(3); 22,28-epoxyhopan-30-ol (4); hopane-22,30-diol (5); hop-22(29)-en-30-ol
(6); hop-22(29)-en-28-ol (7) [12].

Gần đây, năm 2016 nhóm tác giả Bùi Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Sang
đã bước đầu công bố thành phần hóa học cây Thạch vĩ của Việt Nam. Trong
đó từ các dịch chiết EtOAc, n-Hexane đã phân lập được hỗn hợp β–sitosterol
và stigmasterol (8) [2]; hopane-22-ol (9) [5].


-10-

1.4 Sơ lược về lớp chất steroid
Steroid có cấu tạo gồm 3 vòng 6 cạnh và 1 vòng 5 cạnh tiếp giáp với
nhau. Nhiều steroid có 2 nhóm methyl góc ở vị trí hai vòng tiếp giáp với nhau
[14].

Hình 1.2. Cấu tạo khung steroid
Hai vòng tiếp giáp với nhau theo kiểu của cis-Decalin và trans-Decalin.


-11-

Một trong các steroid được biết đến sớm nhất là cholesterol (10). Hợp
chất này được phân lập lần đầu tiên vào năm 1770 nhưng mãi đến tận những
năm 1920 mới xác định được cấu trúc của nó [14].

Quá trình sinh tổng hợp cholesterol đã được xác định đi từ chất đầu là
một triterpene squalene.



-14-

Hình 2.2. Các dung môi thông dụng được sử dụng phân lập các hợp chất
thiên nhiên
2.2.2 Thiết bị nghiên cứu
Quá trình ngâm chiết được thực hiện trong các bình thủy tinh có dung
tích 5 lít. Sau quá trình ngâm chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cất quay
chân không IKA®RV 10 của Anh.

Hình 2.3. Máy cất quay chân không


-15-

Việc tinh chế các hỗn hợp sản phẩm được thực hiện bằng sắc ký cột siica
gel và sắc ký lớp mỏng. Với sắc ký cột silica gel thì tùy vào lượng mẫu chất ta
sử dụng các cột sắc ký có kích cỡ khác nhau: 1; 2; 2,5; 4; 10. Chất nhồi
cột sắc ký là silica gel 60 (0,063–0,200 mm) (70–230 mesh astm) đều là của
Merck còn sắc ký lớp mỏng sử dụng bình sắc ký lớp mỏng Camag của Đức và
bản mỏng sắc ký tráng silicagel 60 F254 trên tấm nhôm 20 × 20 cm của Đức.

Hình 2.4. Cột sắc ký với kích thước khác nhau

Hình 2.5. Bình sắc ký lớp mỏng Camag


-16-