Bài 5 Cổ khuẩn(Archaea)
Phân loại cổ khuẩn
Mở đầu
Những vi sinh vật có khả năng sinh methane (mêtan), mẫn cảm với
oxygen và có cấu trúc màng tế bào đặc biệt đã được biết đến từ lâu
nhưng mãi đến cuối những năm 1970 chúng mới được nhìn nhận như
đại diện của một dạng sống thứ ba trên trái đất bên cạnh vi khuẩn và
sinh vật nhân thật, đó là cổ khuẩn. Carl R. Woese và cộng sự (1977)
sau khi xem xét trình tự 16S rARN nhận thấy rằng các sinh vật nhân
nguyên thuỷ (Prokaryote) cần được chia thành hai nhóm khác biệt nhau
hoàn toàn là Vi khuẩn (Eubacteria hay Bacteria) và Cổ khuẩn
(Archaeabacteria hay Archaea), và cùng với các Sinh vật nhân thật
(Eukarya) làm thành ba lĩnh giới (Domains) ở sinh vật (Hình 1). Các
nghiên cứu sâu hơn về phả hệ và đặc điểm sinh lý sinh hoá cho thấy
rằng cổ khuẩn được tách ra từ rất sớm trong quá trình tiến hoá, chúng
không gần vi khuẩn nhiều hơn so với sinh vật nhân thật, do vậy tên gọi
Archaea được đề xuất thay cho Archaeabacteria. Hiện nay cả hai tên
gọi Archaea và Archaeabacteria đều được sử dụng trong các tài liệu vi sinh vật, tuy nhiên thuật ngữ
Archaea chính xác hơn vì rõ ràng cổ khuẩn không phải vi khuẩn mà là một nhóm vi sinh vật riêng
biệt.
Hình 1. Ba lĩnh giới của sinh vật: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và Sinh vật nhân thật
(Eukarya).
Cổ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đặc biệt
Cổ khuẩn (Archaea) bắt nguồn từ tiếng La tinh Archaios có nghĩa là cổ, là một nhóm vi sinh vật có
nhiều đặc điểm rất khác biệt (Bảng 1).
Bảng 1. Những đặc điểm khác biệt của cổ khuẩn so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật
Đặc điểm
Vi khuẩn
(Bacteria)
Cổ khuẩn(Archaea)
Sinh vật nhân thật

hợp gồm polysaccharid, glycoprotein hoặc protein. Ví dụ như các loài Methanosarcina (cổ khuẩn
sinh methane) có thành tế bào là một lớp polysaccharid dày cấu tạo từ glucoza, glucuronic acid,
galactosamin và acetat. Các loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan (extreme halophiles) như là Halococcus
có thành tế bào tương tự như Methanosarcina nhưng chứa nhiều hợp chất có nhóm sulfat giống như
chondroitin sulfat ở tổ chức liên kết của động vật. Dạng cấu trúc thành tế bào phổ biến nhất ở cổ
khuẩn là lớp paracrystallin bề mặt (S-layer) gồm protein hay glycoprotein. Cấu trúc này được tìm
thấy ở các đại diện thuộc tất cả các nhóm cổ khuẩn, từ ưa mặn cực đoan (extremely halophilic), ưa
nhiệt cực đoan (extremely thermophilic) và cả các loài sinh methane. Đặc biệt các chi
Methanospirillum và Methanothrix (cổ khuẩn sinh methane) có cấu trúc thành tế bào vô cùng phức
tạp. Các loài thuộc hai chi này mọc thành chuỗi dài gồm nhiều tế bào, ở giữa mỗi cặp tế bào có một
lớp đệm dày và toàn bộ cấu trúc chuỗi đó lại được bọc kín trong một lớp paracrystallin bề mặt.

Thành phần và cấu trúc lipid của màng tế bào là một trong những đặc điểm nổi bật phân biệt
cổ khuẩn và hai nhóm còn lại. Trong khi ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật cầu nối acid béo−glycerol
trong lipid màng tế bào là liên kết este (ester) thì ở cổ khuẩn lại là liên kết ete (ether) (Hình 2). Acid
béo trong este-lipid thường là các phân tử ngắn, mạch thẳng. Trái lại, acid béo trong ete-lipid là các
phân tử mạch dài, phân nhánh, thuộc cả hai dạng phytanyl (C
20
−cacbuahydro tổng hợp từ isopren) và
biphytanyl (C
40
). Do chỉ có ở cổ khuẩn và không bị biến đổi dưới nhiệt độ cao nên isopren-lipid được
lấy làm chất chỉ thị của cổ khuẩn hoá thạch.
Enzyme polymeraza thực hiện quá trình sao mã trên khuôn ADN (DNA-dependent RNA
polymerase) ở ba lĩnh giới sinh vật cũng có nhiều điểm khác nhau. Vi khuẩn chỉ có một loại ARN-
polymeraza có cấu trúc không gian đơn giản, gồm bốn chuỗi polypeptid 2α, 1β, 1β’ và một nhân tố σ
không cố định. Cổ khuẩn có nhiều loại ARN-polymeraza, cấu trúc mỗi loại lại phức tạp hơn nhiều so
với ARN-polymeraza vi khuẩn. ARN-polymeraza của cổ khuẩn sinh methane và các loài ưa mặn
(halophilic) gồm tám chuỗi polypeptid (5 chuỗi dài và 3 chuỗi ngắn). ARN-polymeraza ở cổ khuẩn
ưa nhiệt cao (hyper-thermophilic) lại phức tạp hơn, gồm ít nhất 10 chuỗi peptid. Polymeraza thực

9
Da. Ngoài ra thành phần GC (mol%) của ADN ở cổ khuẩn dao động
trong phạm vi rất lớn, từ 21 đến 68 %, chứng tỏ tính đa dạng của cổ khuẩn. So sánh trình tự đầy đủ
của genom ở cổ khuẩn Methanococcus jannaschi với genom của vi khuẩn và sinh vật nhân thật cho
thấy 56% trong 1738 gen không tương đồng.

Bảng 2. Tính mẫn cảm của đại diện ba lĩnh giới sinh vật đối với các chất ức chế quá trình sinh
tổng hợp protein
Chất kháng sinh Tác dụng ức chế Cổ khuẩn Vi khuẩn Sinh vật nhân
thật
Methano-
bacterium
Sulfo-
lobus
Escheri-
chia coli
Saccharomyces
cerevisae
Cycloheximid Ức chế bước khởi
đầu
− − −
+
Virginiamycin,
pulvomycin
Ức chế bước kéo
dài
+
−
+
−

thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử như ở vi khuẩn đều được tìm thấy ở cổ khuẩn, trong đó
cytochrom−a, −b và −c có ở các loài ưa mặn cực đại, cytochrom−a có ở một số loài ưa nhiệt cao. Mô
phỏng dựa trên chuỗi chuyển điện tử ở phần lớn cổ khuẩn cho thấy chúng thu nạp điện tử từ chất cho
vào chuỗi ở nấc thang NADH, oxygen hoá chất nhận điện tử cuối cùng là O
2
, S
0
hay một số chất
khác, đồng thời tạo ra lực đẩy proton (proton motiv force) để tổng hợp ATP nhờ bộ máy ATPaza khư
trú trong màng tế bào. Hoá dưỡng vô cơ khá phổ biến ở cổ khuẩn, trong đó hydro thường được sử
dụng làm chất cho điện tử.
Tự dưỡng đặc biệt phổ biến ở cổ khuẩn và diễn ra dưới nhiều hình thức khác nhau. Ở cổ khuẩn
sinh methane và cổ khuẩn hoá dưỡng vô cơ ưa nhiệt cao CO
2
được chuyển hoá thành các hợp chất
hữu cơ qua con đường acetyl-CoA, trong đó một số loài có cải biên ở các bước phản ứng khác nhau.
Một số loài cổ khuẩn khác (như Thermoproteus) cố định CO
2
theo chu trình citric acid đảo ngược,
tương tự như ở vi khuẩn lam lưu huỳnh. Mặc dù các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cực đoan đều thực hiện
hình thức dinh dưỡng hữu cơ nhưng nhiều loài vẫn có khả năng cố định CO
2
và thực hiện quá trình
này theo chu trình Calvin, tương tự như ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật.
Khả năng quang hợp có ở một số loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan, tuy nhiên khác với vi khuẩn,
quá trình này được thực hiện hoàn toàn không có sự tham gia của chlorophill hay bacteriochlorophill
mà nhờ một loại protein ở màng tế bào là bacteriorhodopsin kết gắn với phân tử tương tự như
carotenoid có khả năng hấp phụ ánh sáng, xúc tác cho quá trình chuyển proton qua màng nguyên sinh
chất và sử dụng để tổng hợp ATP. Tuy nhiên, bằng hình thức quang hợp này cổ khuẩn ưa mặn cực
đoan chỉ có thể sinh trưởng với tốc độ thấp trong điều kiện kỵ khí, khi môi trường thiếu chất dinh

đầu có nhiệt độ rất cao, khoảng 100 °C trở lên, chứa nhiều ammon và khí methane trong khí quyển,
do vậy những dạng sống đầu tiên phải là các sinh vật yếm khí và ưa nhiệt cao (hyper-thermophiles).
Với các đặc điểm sinh lý như tính ưa nhiệt, sống kỵ khí, sử dụng các chất hữu cơ và vô cơ là nguồn
năng lượng, các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cao có lẽ phù hợp với dạng sống nguyên thuỷ mô phỏng theo
điều kiện của trái đất trong thời kỳ đầu. Trong thực tế, chất chỉ thị mạch isoprene-lipid thành phần
màng tế bào của cổ khuẩn được tìm thấy trong các lớp trầm tích có tuổi là 3,8 tỷ năm. Các nghiên cứu
dựa trên trình tự 16S rARN cho thấy cổ khuẩn, đặc biệt là nhóm cổ khuẩn ưa nhiệt cao, tiến hoá chậm
hơn đáng kể so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật. Tuy nhiên tốc độ tiến hoá chậm của cổ khuẩn so
với hai lĩnh giới còn lại có thể do môi trường sống khắc nghiệt của chúng tạo ra. Cho đến nay câu hỏi
về nguồn gốc sự sống và vai trò của cổ khuẩn trong đó vẫn còn đang tiếp tục được tranh luận.
Hình 3. Một trong những nơi đầu tiên cổ khuẩn được tìm thấy: suối nước nóng trong công viên
Quốc gia Yellowstone (Mỹ).

Phả hệ cổ khuẩn dựa trên trình tự 16S rARN
Dựa trên so sánh trình tự 16S rARN các đại diện cổ khuẩn đã phân lập được chia thành hai nhóm
chính là Euryarchaeota và Crenarchaeota (Hình 4,5). Euryarchaeota là nhóm cổ khuẩn được biết rõ
nhất, bao gồm nhiều loài sinh methane, cổ khuẩn ưa mặn, khử sulfat (Archaeoglobales),
Thermoplasmalates và Thermococcales. Nhóm Crenarchaeota gồm ba lớp Desulfococcales,
Sulfolobales và Thermoproteales. Sau này nhóm cổ khuẩn Korarchaeota được đề xuất thêm (Hình 6),
tuy nhiên chỉ dựa trên các trình tự 16S rADN có được từ các mẫu ADN tách trực tiếp từ môi trường
chứ chưa có đại diện nào được phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Hình 4. Các đại diện của hai nhóm cổ khuẩn Crenarchaeota và Euryarchaeota.
Hình 5. Hình thái một số đại diện của hai nhóm cổ khuẩn Euryarchaeota và Crenarchaeota

Hình 6 Mối liên quan phả hệ của ba nhóm cổ
khuẩn Euryarchaeota và Crenarchaeota và
Korarchaeota
Hình 7 Nanoarchaeum equitans (cầu

nhận điện tử là CO
2
hoặc nhóm methyl trong các hợp chất C
1
và acetat. Tuy nhiên, như ta thấy trong
bảng 4, năng lượng được giải phóng ra trong các phản ứng tạo methane đều rất nhỏ. Để so sánh ta có
thể lấy năng lượng giải phóng từ phản ứng oxygen hoá glucoza bằng oxygen C
6
H
12
O
6
+ 6 O
2
→ 6
CO
2
+ 6 H
2
O (∆G
0
’ = −2870 kJ/mol). Là những sinh vật duy nhất có khả năng tạo ra khí methane, cổ
khuẩn sinh methane có những enzyme và coenzyme thiết yếu cho quá trình tổng hợp methane và
đóng vai trò chỉ thị cho nhóm, ví dụ như coenzyme F
420
và coenzyme M. Sự hiện diện của coenzyme
F
420
khiến cho các tế bào của cổ khuẩn sinh methane có tính tự phát sáng dưới ánh đèn huỳnh quang
(bước sóng 350−420 nm). Mặc dù hiện tượng tự phát sáng này có thể mạnh, yếu, hay đôi khi mất

→ CH
4
+ 4 Aceton + 2H
2
O − 36,5
2 Etanol + CO
2
→ CH
4
+ 2 Acetat −116,3
Metanol + H
2
→ CH
4
+ H
2
O −112,5
4 Metanol → 3CH
4
+ CO
2
+ 2H
2
O −104,9
4 Methylamin + 2H
2
O → 3CH
4
+ CO
2

+ H
2
S − 73,8
Acetat → CH
4
+ CO
2
− 31,0
Những nơi thông thường có thể tìm thấy cổ khuẩn sinh methane là các bể lên men hữu cơ kỵ
khí, các lớp trầm tích thiếu oxygen, đất ngập úng và hệ đường ruột của động vật. Khi ở dạng chủng
đơn cổ khuẩn sinh methane rất nhạy cảm với oxygen, tuy vậy trong tự nhiên chúng có thể tồn tại ở
môi trường hiếu khí nhờ được bao bọc và bảo vệ bởi các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí khác. Trong
môi trường kỵ khí, cổ khuẩn sinh methane phải cạnh tranh về cơ chất, đặc biệt là hydro và acetat, với
các nhóm vi sinh vật sử dụng chất nhận điện tử có hiệu điện thế khử dương tính hơn so với CO
2
như
là nitơrat, sulfat và ôxit sắt III. Như vậy cổ khuẩn sinh methane sẽ chiễm lĩnh các môi trường nơi
không có nhiều các loại chất nhận điện tử tiềm năng này. Do không có khả năng sử dụng rộng rãi các
loại cơ chất khác nhau, trong tự nhiên cổ khuẩn sinh methane thường phải phụ thuộc vào các loài vi
khuẩn lên men vì chúng chuyển hoá đa dạng chất hữu cơ thành các acid hữu cơ, hydro, format và
acetate, trong đó hydro, format và acetate là nguồn thức ăn trực tiếp cho cổ khuẩn sinh methane, còn
các acid hữu cơ sản phẩm của quá trình lên men như propyonat, butyrate thì cần phải được một nhóm
vi khuẩn khác chuyển hoá thành cơ chất thích hợp rồi mới đến lượt cổ khuẩn chuyển thành khí
methane. Có hai hình thức cộng sinh: bắt buộc và không bắt buộc. Trong hình thức cộng sinh giữa cổ
khuẩn sinh methane và vi khuẩn lên men, chỉ có cổ khuẩn phụ thuộc vào mối liên hệ này do nhu cầu
về thức ăn còn các hoạt động trao đổi chất của chúng hoàn toàn không có ảnh hưởng gì tới các vi
khuẩn lên men, vì thế hình thức này được gọi là cộng sinh không bắt buộc.
Cộng sinh bắt buộc diễn ra giữa cổ khuẩn
sinh methane và một nhóm vi khuẩn cộng
sinh bắt buộc, trong đó cả đôi bên cùng cần

Lớp Họ Chi
Methanobacteriales Methanobacteriaceae (T) Methanobacterium (T)
-nt- -nt- Methanobrevibacter
-nt- -nt- Methanosphaera
Hình 9 : Cộng sinh giữa Methanobrevibacter (tế
bào trực khuẩn) và Synthrophobacter (tế bào hình
oval).
-nt- Methanothermaceae Methanothermus (T)
Methanococcales Methanococcaeae (T) Methanococcus (T)
Methanomicrobiales Methanosarcinaceae Halomethanococcus
-nt- -nt- Methanococcoides
-nt- -nt- Methanohalobium
-nt- -nt- Methanohalophilus
-nt- -nt- Methanolobus
-nt- -nt- Methanosarcina (T)
-nt- -nt- Methanosaeta (Methanothrix)
-nt- Methanomicrobiacaea (T) Methanoculleus
-nt- -nt- Methanogenium
-nt- -nt- Methanolacinia
-nt- -nt- Methanomicrobium (T)
-nt- -nt- Methanoplanus
-nt- -nt- Methanospirillum
-nt- Methanocorpusculaceae Methanocorpusculum (T)
T = họ/ chi chuẩn; -nt- như trên
Về hình thái, cổ khuẩn sinh methane rất đa dạng, trong đó một số loài có hình dạng đặc trưng
dễ nhận biết dưới kính hiển vi như Methanosarcina, Methanospirillum hay Methanosaeta (Hình 10).
Ngoài ra, một trong những đặc điểm quan trọng dùng để phân loại nhóm cổ khuẩn này là nguồn cơ
chất có thể sử dụng để sinh methane (Bảng 6).
Họ Methanobacteriaceae có thành tế bào cấu tạo từ pseudomurein, vì thế bắt mầu Gram (+). Họ
Methanobacteriaceae gồm có ba chi là Methanobacterium, Methanobrevibacter và Methanosphaera.

• Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm
khô.
• Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không
khí.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100×.
Kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (−) bắt màu đỏ.

Hình 1.1. Các bước tiến hành nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả.
1.2. Nhuộm tiên mao
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch A: Acid tannic 5 g
FeCl
3
1,5 g
Formalin 2 ml
NaOH 1% 1 ml
Nước cất 100 ml
• Dung dịch B: 2 g AgNO
3
hoà tan trong 100 ml nước cất, lấy 10 ml dể riêng. Nhỏ
dung dịch NH
4
OH đậm đặc vào 90 ml

còn lại, thấy hình thành tủa rất đặc, tiếp tục
nhỏ NH
4
OH vào cho đến khi tan hết tủa. Lấy 10ml AgNO
3

Chú ý: với vi khuẩn hiếu khí chỉ quan sát ở phần trên của vết cấy.
1.4. Nhuộm bào tử
Có hai phương pháp nhuộm
1.4.1. Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch Lục Malachite (Malachite green) bão hoà (khoảng 7,6%)
• Dung dịch Safranin 0,5% (xem nhuộm Gram)
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi và cố định tế bào như đối với nhuộm Gram.
• Nhuộm bằng dung dịch Lục Malachite trong 10 phút, rửa nước.
• Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100×
Kết quả:
Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ.
Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục
1.4.2. Nhuộm Carbolic Fuchsin
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch A:
10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong etanol (khoảng 10%)
100 ml dung dịch acid carbolic (phenol) 5% (trong nước).
Trộn đều với nhau (chuẩn bị trước khi dùng)
• Dung dịch B:
100 ml Etanol 95%
3 ml HCl đậm đặc
• Dung dịch C:
30 ml dung dịch Xanh metylen (Methylene blue) bão hoà trong etanol (khoảng 2%)
100 ml dung dịch KOH 0,01% trong nước.
Trộn đều với nhau, để càng lâu càng tốt.
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi trên phiến kính, cố định tế bào.

• Dung dịch HCl 1%
• Hỗn hợp 30 ml dung dịch Xanh metylen bão hoà (khoảng 2%) trộn với 100 ml dung
dịch KOH 0,01%.
Các bước tiến hành:
• Nhỏ 1 giọt dung dịch Đỏ Congo và 1 giọt dung dịch gelatin lên phiến kính sạch.
• Lấy vi khuẩn trộn đều với 2 giọt nói trên để làm vết bôi, để khô trong không khí
• Nhỏ dung dịch HCl lên để rửa, phiến kính có màu xanh.
• Rửa bằng nước để loại bỏ dung dịch HCl.
• Nhuộm lại bằng Xanh metylen trong 1 phút, rửa nước, hong khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100×.
Kết quả:
Nền vi trường màu xanh, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu
1.5.3. Phương pháp nhuộm âm bản đơn giản (Hình 1.4):
• Nhỏ 1 giọt Nigrosin vào đầu một phiến kính sạch.
• Lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn trộn với giọt nigrosin.
• Lấy một phiến kính khác để nghiêng 45
0
và kéo giọt nigrosin đã trộn vi khuẩn về phía
phải một chút sau đó kéo nhẹ về phía trái để dàn mỏng thành một vết bôi. Để khô tự nhiên
(không hơ lửa).
• Quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy vỏ nhầy màu sáng nổi lên trên một nền màu đen.

Hình 1.4. Nhuộm âm bản dùng Nigrosin và ví dụ minh hoạ kết quả.

1.5.4. Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch Tím kết tinh 1% trong nước
• Dung dịch Sulfat đồng CuSO
4
20% trong nước

Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi, cố định vết bôi.
• Nhuộm bằng dịch A trong 5 phút, đổ đi
• Tráng bằng dịch B, nhuộm thêm trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100×.
Kết quả:
Các hạt dị nhiễm có màu đen.
Các thành phần khác của tế bào bắt màu lục hay lục nhạt
1.8. Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch A: Đen Sudan B (Sudan black B) 0,3 g
Etanol 70% 100 ml.
Trộn đều, lắc mạnh, để qua đêm mới sử dụng.
• Dung dịch B: Xylene
• Dung dịch C: Dung dịch Safranin 0,5% trong nước.
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi, cố định vết bôi.
• Nhuộm bằng dịch A trong 10 phút, rửa nước, thấm khô.
• Dùng dịch B rửa cho đến khi mất màu.
• Nhuộm bằng dịch C trong 1-2 phút, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100×
Kết quả:
Hạt PHB bắt màu lam đen. Tế bào và các bộ phận khác có màu đỏ.
1.9. Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch nhuộm:
1 ml dung dịch Fuchsin bão hoà bão hoà (xem nhuộm carbolic fuchsin) trộn với 100 ml
dung dịch acid carbolic 5% trong nước.
Khi dùng pha loãng 10 lần.
Các bước tiến hành:


2. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ:
2.1. Hình thái khuẩn lạc
• Lấy 15-20ml môi trường thạch vô trùng, để nguội đến 50
0
C rồi đổ vào đĩa Petri (thao tác
vô trùng). Nếu có nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào tủ ấm 30-37
0
C để
làm khô mặt thạch.
• Lấy một vòng que cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch ở một góc. Quay đĩa thạch sang hướng
khác và ria cấy từ một vạch thành 3-4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước.
Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy. Chú ý
không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy.