BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN KHÁNH VY

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NITROSAMIN
TRONG THỊT NƯỚNG
BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN KHÁNH VY
MÃ SINH VIÊN: 1301482

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NITROSAMINE
TRONG THỊT NƯỚNG
BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Cao Sơn

2. TS. Đặng Thị Ngọc Lan

Nơi thực hiện:


i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ................................................................. vii
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................2
1.1. Giới thiệu về nitrosamin ....................................................................................2
1.1.1.

Công thức cấu tạo của nitrosamin............................................................2

1.1.2.

Sự tạo thành nitrosamin ...........................................................................2

1.1.3.

Tính chất hóa lý của nitrosamin ...............................................................3

1.1.4.

Độc tính....................................................................................................3

1.1.5.


Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong

các sản phẩm thịt nướng ........................................................................................12
2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS .........12
2.2.1.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ......................................................12
2.2.2.

Thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong

các sản phẩm thịt nướng ........................................................................................12
2.2.3.

Sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt nướng

trên địa bàn Hà Nội ................................................................................................13
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ...............................................................................13
2.3.1.

Thiết bị ...................................................................................................13

2.3.2.

Dụng cụ ..................................................................................................13

2.3.3.

Hóa chất, chất chuẩn ..............................................................................13

2.3.4.



Phương pháp lấy mẫu ............................................................................18

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................19
3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong thịt
nướng .........................................................................................................................19
3.1.1.

Khảo sát điều kiện GC-MS/MS .............................................................19

3.1.1.1. Điều kiện MS/MS ..............................................................................19
3.1.1.2. Điều kiện GC......................................................................................20
3.1.2.

Xây dựng quy trình xử lý mẫu ...............................................................22

3.1.2.2. Khảo sát phương pháp chiết ...............................................................24
3.1.2.3. Khảo sát thời gian chiết......................................................................25
3.1.2.4. Khảo sát bột làm sạch ........................................................................26
3.1.2.5. Khảo sát khối lượng bột làm sạch ......................................................26
3.1.3.

Khảo sát ảnh hưởng nền ........................................................................28

3.2. Thẩm định phương pháp ..................................................................................29
3.2.1.

Tính chọn lọc .........................................................................................29

3.2.1.1. Tính số điểm Index Period .................................................................29


Collision energy (Năng lượng va chạm)

CI

Chemical ionization (Ion hóa hóa học)

DCM

Dichloromethan

d-SPE

Dispersive solid phase extraction (Chiết pha rắn phân tán)

EI
GC-MS/MS

LC-MS/MS

Electron impact (va chạm electron)
Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí khối
phổ hai lần)
Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng
khối phổ hai lần)

LOD

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)



Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

TEA

Thermal energy analyser (Bộ phân tích năng lượng nhiệt)

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số nitrosamin thường gặp ...................................................................... 2
Bảng 1.2. Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin ............................................. 4
Bảng 1.3. Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống ............................. 5
Bảng 1.4. So sánh một số nghiên cứu chiết nitrosamin bằng kỹ thuật QuEChERS .... 8
Bảng 1.5. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS……...11
Bảng 2.1. Các nitrosamin được sử dụng trong nghiên cứu………………………….12
Bảng 2.2. Pha dung dịch chuẩn làm việc…………………………………………….15
Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích nitrosamin ................................................. 19
Bảng 3.2. Chương trình nhiệt độ xác định nitrosamin .................................................. 21
Bảng 3.3. Tỷ lệ ion và sai số cho phép .......................................................................... 29
Bảng 3.4. Khoảng làm việc và độ chệch ....................................................................... 34
Bảng 3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDMA ............................................................. 34
Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPA .............................................................. 34
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPhA ............................................................ 36
Bảng 3.8. So sánh độ lặp lại của phương pháp với tiêu chuẩn AOAC ......................... 36
Bảng 3.9. So sánh độ thu hồi của phương pháp với tiêu chuẩn AOAC ........................ 37
Bảng 3.10. Kết quả phân tích mẫu thực tế .................................................................... 37
Bảng 3.11. Tóm tắt kết quả phân tích mẫu thực ............................................................ 39


Việt Nam có khoảng 7.000 người được chuẩn đoán mắc bệnh ung thư, trong đó có
5.000 ca tử vong và thực phẩm được cho là một trong những nguyên nhân chính gây ra
tình trạng này
Nitrosamin là một nhóm hóa chất có khả năng gây ung thư cho con người khi
tiếp xúc với môi trường và một số loại thực phẩm, trong đó có thịt chế biến. Để bảo
quản, thịt thường được tiêm chất bảo quản có chứa muối nitrit, nitrat. Amin từ quá
trình phân hủy protein trong khi nấu sẽ kết hợp với nitrit tạo thành nitrosamin. Mức độ
tạo thành nitrosamin phụ thuộc vào các yếu tố: phương pháp nấu, nhiệt độ, thời gian,
nồng độ của nitrit/nitrat, quy trình sơ chế, điều kiện bảo quản. Vấn đề cấp bách đang
được đặt ra là phải kiểm soát hàm lượng nitrosamin trong các sản phẩm chế biến từ
thịt, đặc biệt là thịt nướng để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng.
Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác định
nitrosamin trong thực phẩm. Tuy nhiên, ở Việt Nam sự quan tâm cho vấn đề này vẫn
còn khá hạn chế. Khóa luận “Nghiên cứu phương pháp xác định một số nitrosamin
trong thịt nướng bằng sắc ký khí khối phổ” được thực hiện không chỉ có ý nghĩa về
mặt khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn. Mục tiêu của khóa luận như sau:
1.

Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số

nitrosamin trong thịt nướng
2.

Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong

một số sản phẩm thịt nướng trên địa bàn Hà Nội.

1




3.

N-nitroso diphenyl amine (NDPhA)

N N O

N N O

N N O

74

130

198

1.1.2. Sự tạo thành nitrosamin
Trong thực phẩm, nitrosamin được tạo bởi nitrit và các amin bậc 2, là các chất
thường gặp trong protein, trong các điều kiện nhất định như môi trường acid mạnh như
trong dạ dày người. Theo các nghiên cứu, khoảng pH tối ưu cho sự tạo thành
nitrosamin từ nitrit là 2,5 – 3,5. Nhiệt độ cao như khi chiên thực phẩm cũng thúc đẩy
sự tạo thành nitrosamin. Có thể nhận biết nitrosamin bằng phản ứng Liebermann
nitroso.
2


Trong môi trường acid, nitrit tạo thành acid nitrous (HNO2), acid này nhận
thêm proton và phân chia thành cation nitrosonium N≡O+ và nước:
H2NO2+ → H2O + NO+



1.1.5. Nitrosamin trong thực phẩm
Bên cạnh những nguồn chứa nitrosamin từ môi trường, khói thuốc lá, nước
uống, một số sản phẩm thực phẩm cũng có nguy cơ lớn có chứa nitrosamin. Bảng 1.2
tóm tắt một số đối tượng thực phẩm thường có chứa nitrosamin [17],[29].
Bảng 1.2. Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin
Thực phẩm

Loại nitrosamin

Khoảng nồng độ
(µg/kg)

Thịt hun khói

NDMA, NPYR, NDPA, NDPhA

1-100

Thịt cà ri

NDMA, NPYR, NPIP

KPH -50

Cá muối

NDMA, NDEA



4


Bảng 1.3. Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống[9]
Mức tối đa trong nước uống

STT

Quố c gia, khu vực

1

Mỹ

2

Canada

0,04 μg/L (tổ ng nitrosamin)

3

Châu Âu

Âm tính

4

Đức


Chưng cất

Theo kết quả của Sen và Seaman, mẫu thịt hun khói được kiềm hóa và chưng
cất với dầu khoáng trong thiết bị chưng cất chân không và thu nitrosamin vào một thiết
bị bẫy hơi, sau đó bẫy được chiết lại bằng DCM. DCM sau đó được cô để làm giàu và
phân tích bằng sắc ký khí [30]. Kỹ thuật chưng cất này có hiệu quả tốt đối với
nitrosamin đặc biệt là NDMA là chất có nhiệt độ bay hơi thấp. Phương pháp này sau
đó đã được AOAC chấp nhận và trở thành phương pháp chuẩn AOAC 982.22 [6].

5


Al-Kaseem và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật chưng cất hơi nước để cất các
nitrosamin. Mẫu thịt được đồng nhất trong nước sau đó chưng cất nitrosamin vào pha
nước. Mẫu sau chưng cất được chiết lại bằng DCM và làm sạch bằng SPE [3].
Tuy nhiên, hiện nay phương pháp này ít được áp dụng do sự phức tạp của hệ
thống chưng cất (yêu cầu hệ thống chưng cất đặc biệt và cần có N2 để làm mát). Việc
sử dụng sắc ký khí với bộ phân tích TEA cũng ít phổ biến ngày nay.
1.2.1.2.

Chiết lỏng – lỏng

Đối với một số mẫu dạng lỏng như bia, nước uống, kỹ thuật chiết lỏng lỏng có
thể được áp dụng để chiết nitrosamin. Ngày nay, kỹ thuật chiết lỏng lỏng với chất nhồi
Celite hay Extrelut có thể được sử dụng. Nitrosamin được hấp phụ vào lớp nước bao
quanh các hạt nhồi, sau đó được chiết lại bằng dung môi hữu cơ thích hợp như DCM
hay hỗn hợp DCM và n-hexan. Phương pháp này có thể đạt độ thu hồi từ 74-85% với
giới hạn phát hiện 0,5 µg/L. Một trong những phương pháp này sau đó đã trở thành
phương pháp chính thức của AOAC, áp dụng cho nền mẫu bia [7].

Chiết pha rắn (SPE)

Chiết pha rắn là kỹ thuật được ứng dụng rất phổ biến ngày nay trong phân tích
hàm lượng vết do khả năng làm giàu và làm sạch mẫu rất tốt. Kỹ thuật này có thể phối
hợp với các kỹ thuật chiết khác như chiết lỏng hoặc chưng cất trong quá trình chuẩn bị
mẫu để xác định nitrosamin.
Nhiều loại pha rắn đã được sử dụng để chiết và làm sạch mẫu khi xác định
nitrosamin. Yurchenko và cộng sự nghiên cứu nhiều loại cột khác nhau như florisil,
cyano, silicagel, aminopropyl, alumina cho thấy florisil cho hiệu quả tốt nhất khi phối
hợp với chiết lỏng lỏng bằng cột extrelut. Phương pháp này sau đó được nhiều tác giả
sử dụng trên các nền mẫu khác nhau như thịt cừu, rau, xúc xích và các sản phẩm thịt
khác [18], [25], [27],[32], [33].
1.2.1.5.

Kỹ thuật QuEChERS

Kỹ thuật QuEChERS (viết tắt của thuật ngữ Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged and Safe) là kỹ thuật chuẩn bị mẫu hiện đại được thiết kế ban đầu cho phân
tích thuốc bảo vệ thực vật trong nông sản sau đó được ứng dụng rộng rãi cho các mẫu
khác nhờ vào tính ưu việt của nó. Phương pháp này tối thiểu hóa các bước chuẩn bị
mẫu, giảm sử dụng dung môi hóa chất độc hại, đồng thời giảm chi phí thử nghiệm. Kỹ
thuật QuEChERS hiện nay là cơ sở cho các phương pháp thử được thừa nhận rộng rãi
trên thế giới như AOAC 2010 (2001.07), EN 15662 và đang được các PTN lớn, hiện
đại ở nước ta áp dụng.
❖

Các bước trong quy trình xử lý mẫu QuEChERS

✓


Bước 8: Tách lớp

✓

Bước 9: Hút lớp trên vào vial

✓

Bước 10: Bảo quản và phân tích

❖

Ứng dụng kỹ thuật QuEChERS trong xử lý mẫu

Năm 2015, Lehotay và cộng sự sử dụng kỹ thuật QuEChERS để xác định các
nitrosamin trong thịt hun khói. Các tác giả sử dụng acetonitril để chiết nitrosamin từ
nền mẫu thịt có bổ sung nước. Lớp acetonitril được tách khỏi nước bằng phân bố lỏng
lỏng nhờ sự có mặt của MgSO4 và HCO2NH4. Dịch chiết acetonitril sau đó được làm
sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với hỗn hợp chất hấp phụ gồm MgSO4, PSA,
C18 và bột Z-Sep [21].
Kỹ thuật chiết QuEChERS ngày càng được nhiều tác giả nghiên cứu để xác
định nitrosamin trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau [26], [34], [35]. Một số
nghiên cứu chính được tóm tắt ở bảng 1.4.
Bảng 1.4. So sánh một số nghiên cứu chiết nitrosamin bằng kỹ thuật QuEChERS
Tác giả,

Nền mẫu

Dung môi


Muối chiết

HCO2NH4

EtOAc

-

d-SPE
MgSO4, PSA,
C18, Z-Sep
PSA, C18,
GCB

H2O:ACN

MgSO4:NaCl

Na2SO4, C18,

(10:15)

(4:1)

PSA

ACN

-


nitrosamin do khó đáp ứng được yêu cầu về độ nhạy. Theo một nghiên cứu của
Cardenes và cộng sự, nitrosamin được dẫn xuất dansyl hóa và xác định bằng sắc ký
lỏng với detector huỳnh quang. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định
nitrosamin trong bia và khói thuốc lá, nhưng chỉ có thể xác định ở nồng độ khoảng từ
2,5 µg/kg trở lên.
Một số nghiên cứu gần đây sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để xác định
nitrosamin trong nước, bia, và sản phẩm thịt [10], [14], [20]. Bản thân các nitrosamin
không đáp ứng tốt với nguồn ESI (ion hóa phun điện tử) cũng là yếu tố tạo nên sự khó
khăn khi ứng dụng LC-MS hoặc LC-MS/MS. Các nghiên cứu đều sử dụng nguồn
APCI (ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển). Aerola xác định 4 nitrosamin trong xúc
xích sử dụng kỹ thuật LC-APCI-MS để tạo các ion có số khối [M+H]+ với LOD khá
thấp dao động từ 0,2 đến 1,0 µg/kg tùy từng nitrosamin [10]. Herrmann cũng sử dụng
LC-APCI-MS/MS để xác định đồng thời 14 nitrosamin trong sản phẩm thịt thu được
kết quả khá tốt với LOD từ 0,2 đến 1,0 µg/kg. Các kết quả cũng cho thấy LOD có sự
khác biệt trên nhiều đối tượng mẫu khác nhau, cho thấy ảnh hưởng của nền mẫu tới tín
hiệu phân tích rất đáng kể.
Mặc dù, phương pháp LC-MS/MS cũng thu được một số kết quả khá khả quan
trong việc xác định nitrosamin nhưng việc sử dụng nguồn APCI tạo nên sự không
thuận lợi cho các phòng thí nghiệm khi áp dụng trong thực tế do đòi hỏi về thiết bị
cũng như kinh nghiệm sử dụng loại nguồn này. Ảnh hưởng nền khá lớn cũng là một
yếu tố cần cân nhắc khi sử dụng phương pháp LC-MS/MS.
1.2.2.2.

Sắc ký khí

Do các nitrosamin có thành phần N nên có thể sử dụng GC-NPD (detector nitơphốtpho) để xác định các nitrosamin. Grebel đã thực hiện so sánh việc sử dụng GCNPD với GC-MS để xác định nitrosamin cho thấy không có sự khác biệt quá lớn về độ
chính xác của kết quả. Giới hạn phát hiện của NDMA có thể đạt đến 4 µg/L (trên dịch

9


10


Bảng 1.5. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS
Tác giả,
năm

Nền mẫu

Campillo,

Sản phẩm

2011 [8]

thịt

McDonald

Nước

, 2012 [22] uống
Huang,

Sản phẩm

2013 [16]

thịt


bơm mẫu

Cột sắc ký

Nguồn ion

LODNDMA

hóa

(µg/kg)

SSL, 3 µL

HP5-MS UI

EI, 70 eV

0,56

SSL, 1 µL

DB1701P

EI, 70 eV

0,9

PTV, 10 µL


DB-Waxetr

EI, 70 eV

0,03

ngược
SSL, 1 µL, kỹ
thuật thổi
ngược
SSL, 2 µL

Kết luận: Các số liệu nêu trên cho thấy, việc sử dụng nguồn EI với phương
pháp GC-MS/MS, kết hợp kỹ thuật QuEChERS hoàn toàn có thể thu được hiệu quả tốt
nếu chọn được điều kiện thích hợp. Sỡ dĩ nguồn EI được ưu tiên hơn vì sự phổ biến
của nó so với nguồn CI.

11


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng của nghiên cứu này là 3 nitrosamin (thường phát hiện trong mẫu thực

phẩm) được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các nitrosamin được sử dụng trong nghiên cứu
Công thức


Nitrosamin

Ký hiệu

1

N-Nitroso dimethyl amine

2
3

Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và
ứng dụng phương pháp bao gồm một số nền mẫu thịt nướng gồm có thịt lợn nướng,
thịt bò nướng và thịt gia cầm nướng được mua trên địa bàn Hà Nội.
2.2.

Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong
các sản phẩm thịt nướng
2.2.1.1.
❖

Khảo sát các điều kiện xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS

Khảo sát điều kiện sắc ký khí: các điều kiện tách sắc ký bao gồm cột sắc

ký, nhiệt độ.
❖




Đánh giá các thông số cơ bản của phương pháp gồm có:
-

Tính chọn lọc

-

Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ

-

Khoảng làm việc

-

Độ chụm (độ lặp lại)

-

Độ đúng (độ thu hồi)

2.2.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt
nướng trên địa bàn Hà Nội
❖

Lấy mẫu tại một số chợ và cửa hàng ở Hà Nội:

−


Máy rung siêu âm S100H, Elma

−

Máy lắc ngang HS260, IKA

−

Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg) XS105, Metter Toledo.

2.3.2. Dụng cụ
−

Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20-200 µL, 100-1000 µL và

1000-5000 µL.
−

Ống ly tâm loại 15 mL, 50 mL

−

Vial 1,8 mL

2.3.3. Hóa chất, chất chuẩn
−

Chuẩn hỗn hợp nitrosamin 2000 µg/mL mỗi chất trong methanol (Dr.


MgSO4 khan (tinh khiết phân tích): có thể dùng muối ngậm nước nhưng

phải nung ở 450oC trong 2h để loại nước.
−

NaCl (tinh khiết phân tích)

−

(NH4)2CO3 (tinh khiết phân tích)

−

NH4Cl (tinh khiết phân tích)

2.3.4. Pha dung dịch chuẩn
2.3.4.1.

Dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrosamin 10 µg/mL và 1 µg/mL

Dùng pipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc 2000 µg/mL vào bình
định mức 20 mL, định mức bằng ACN, thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL.
Bảo quản ở nhiệt độ -18oC, sử dụng trong 6 tháng.
Dùng pipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL vào vial,
thêm 900 µL ACN, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 µg/mL. Pha mới khi
sử dụng.
2.3.4.2.

Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL



VDCM

(ng/mL)

1µg/mL (µL)

µg/mL (µL)

(µL)

(µL)

0,5

0,5

50

449

500

2

2

50

448


500

50

50

50

400

500

100

100

50

350

500

2.4.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Quy trình xử lý mẫu
❖


Lắc và ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút. Dùng
pipet pasteur loại bỏ lớp n-hexan

Hút 0,5 mL lớp ACN vào vial, thêm 0,5 mL DCM, lắc đều

Phân tích trên GC-MS/MS
Hình 2.1. Quy trình chiết mẫu dự kiến

16