Nghiên cứu phương pháp xác định các axit
béo trong một số loại dầu mỡ động, thực vật
Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký Võ Thị Việt Dung Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận án TS. ngành: Hóa phân tích; Mã số: 62 44 29 01
Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Xuân Trung, PGS. TS. Lưu Văn Bôi
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm - xây dựng mô hình
hồi quy bậc hai tâm trực giao để tìm điều kiện tối ưu cho quá trình xác định các axit
béo trong dầu mỡ động thực vật. Kết quả nghiên cứu đã thu được tối ưu hơn nhiều
so với các nghiên cứu phân tích axit béo trước đây. Đã sử dụng các kỹ thuật sắc ký
hiện đại: sắc ký khí ion hóa ngọn lửa (GC/FID) và sắc ký lỏng siêu nhanh (UFLC)
để phân tích đồng thời 37 metyl este axit béo trong hỗn hợp. Các nghiên cứu được
tiến hành một cách có hệ thống từ khảo sát đơn lẻ đến mô hình hóa các yếu tố có ảnh
hưởng tương hỗ. Quá trình xử lý thống kê và xác nhận giá trị sử dụng của phương
pháp nghiên cứu được tiến hành đầy đủ, đáp ứng yêu cầu khi xây dựng phương pháp
phân tích. Ứng dụng phương pháp nghiên cứu xác định các axit béo trong 8 mẫu dầu
mỡ động thực vật thông dụng của Việt Nam gồm: mỡ cá basa, mỡ lợn, dầu mè, dầu
đậu nành, dầu lạc, dầu dừa, dầu hạt cao su và dầu hạt jatropha. Phân tích đề xuất có
khả năng xây dụng thành phương pháp tiêu chuẩn để xác định thành phần các axit
béo trong dầu mỡ động thực vật, phục vụ nghiên cứu về dinh dưỡng, kiểm nghiệm
thực phẩm, chế tạo nhiên liệu sinh học và các nghiên cứu khác.

Keywords. Hóa phân tích; Axit béo; Kỹ thuật sắc ký; Dầu động vật; Dầu thực vật

- Xây dựng mô hình thí nghiệm bậc hai tâm trực giao xét ảnh hưởng đồng thời các yếu tố
đến khả năng tách và xác định các FAME bằng phương pháp sắc ký khí.
- Dựa trên mô hình thí nghiệm ở trên tối ưu hóa và đánh giá ảnh hưởng các nhân tố khảo
sát đến việc tách và xác định các FAME bằng phương pháp sắc ký khí detector ion hóa ngọn
lửa (GC/FID)
- Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng siêu nhanh (UFLC) nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu và
đánh giá ảnh hưởng đồng thời các nhân tố khảo sát đến hiệu suất quá trình chuyển đổi este
dầu mỡ.
- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp nghiên cứu.
- Ứng dụng phương pháp nghiên cứu xác định các axit béo trong 8 mẫu DMĐTV Việt
Nam.
3. Những điểm mới về khoa học của luận án
3.1. Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm theo mô
hình thí nghiệm bậc hai tâm trực giao nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời các yếu tố như tốc độ
pha động, nhiệt độ ban đầu của cột tách, tốc độ tăng nhiệt, tỉ lệ bơm chia dòng đến khả năng
tách và xác định các FAME bằng phương pháp sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa.
- Lần đầu tiên xây dựng mô hình thí nghiệm bậc hai tâm trực giao xét ảnh hưởng đồng
thời các yếu tố đến hiệu suất quá trình chuyển đổi este DMĐTV như tỉ lệ mol metanol/dầu
mỡ, hàm lượng chất xúc tác (axit hoặc kiềm), nhiệt độ, thời gian và môi trường phản ứng
nhằm đạt hiêu suất chuyển đổi tối ưu ( 100%).
3.2. Dựa trên các điều kiện tối ưu hóa ở trên lần đầu tiên đã tách và xác định đồng thời
37 FAME trong hỗn hợp với độ lặp lại tốt, làm cơ sở để tiến hành xác định các axit béo trong
DMĐTV.
3.3. Đã tiến hành nghiên cứu một cách có hệ thống các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách,
xác định các axit béo trong DMĐTV bằng phương pháp sắc ký khí. Kết quả phân tích các
axit béo đã xử lý thống kê, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp, đáp ứng yêu cầu khi
xây dựng phương pháp phân tích.
3.4. Lần đầu tiên đã tiến hành phân tích đồng thời các axit béo trong 8 mẫu DMĐTV
Việt Nam: mỡ cá basa, mỡ lợn, dầu mè, dầu đậu nành, dầu lạc, dầu dừa, dầu hạt cao su và
dầu hạt jatropha.

2
SO
4

96% (Trung Quốc),…
Thiết bị sắc ky
́
lỏng siêu nhanh UFLC của Shimadzu (Nhật) với detector chỉ số khúc xạ
RID–10A, máy sắc ký lỏng: LC–20AD, degasser: DGU–20A
3
, lò cột: CTO–20A, cột sắc ký:
Cadenzal CD–C18 (250 mm × 4,6 mm ID × 3 μm) của Imtakt (Mỹ); thiết bị sắc ký khí
Shimadzu GC–2010 (Kyoto, Nhật) với detector FID, cột mao quản phân cực mạnh SP
TM
-
2560 (100 m × 0,25 mm × 0,2 m) và cột mao quản ít phân cực Equity-5 (30 m × 0,25 mm ×
0,25 m) của Supelco (Mỹ), máy khuấy từ gia nhiệt Velp 1200 rmp (Italia), lò vi sóng Sanyo
1200W (Nhật), bơm chân không IKA (Đức), máy rung siêu âm Telsonic 750W (Thụy Sỹ),
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách và xác định các FAME
Sử dụng sắc ký khí với detector FID, cột mao quản phân cực mạnh SP
TM
-2560 (100 m ×
0,25 mm × 0,25 m) có thành phần 100% poly(xyanoisopropyl siloxan), khí mang Heli, dung
môi diclometan, nội chuẩn n-hexadecan.
2.2.2. Xác định hàm lƣợng axit béo tự do trong dầu mỡ
Sử dụng phương pháp chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,01M, chỉ thị phenolphatalein.
2.2.3. Chuyển đổi este dầu mỡ động thực vật
Sử dụng phản ứng transeste hóa DMĐTV với metanol xúc tác kiềm và phản ứng este
hóa DMĐTV với metanol xúc tác axit.

của GC/FID để tối ưu hóa các điều kiện này nhằm tách tốt các FAME. Kết quả khảo sát đơn
biến tìm khoảng biến thiên các điều kiện phân tích GC/FID thu được như sau:
- Tốc độ pha động (tốc độ khí mang) He: 18 – 25 cm/s
- Tốc độ tăng nhiệt của cột tách: 2 – 4
0
C/phút
- Nhiệt độ ban đầu của cột tách: 60 – 140
0
C
- Tỉ lệ bơm chia dòng: 10:1 – 200:1
3.1.2. Tối ƣu hóa điều kiện GC/FID theo phƣơng pháp đa biến
3.1.2.1. Xây dựng mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao
Sử dụng mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao để xây dựng phương trình hồi quy
(PTHQ) và đánh giá ảnh hưởng đồng thời của 4 nhân tố khảo sát: tốc độ pha động, X
1
; nhiệt
độ ban đầu của cột tách, X
2
; tốc độ tăng nhiệt của cột tách, X
3
; tỉ lệ bơm chia dòng, X
4
đến
khả năng tách (độ phân giải R) các FAME, y
1
và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của tỉ lệ
diện tích pic FAME/IS, y
2
. Kết quả thực nghiệm được trình bày trên bảng 3.2.
Quan hệ giữa hàm mục tiêu và các nhân tố khảo sát được mô tả theo phương trình bậc

2
2
– ) +… Với tham số
hồi quy  và cánh tay đòn sao d được tính sẵn cho mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao khi
n = 4 là:  = 0,8000, d = 1,4142.
Bảng 3.2. Kết quả thực nghiệm tìm điều kiện GC/FID tách và xác định các FAME theo mô
hình hồi quy bậc hai tâm trực giao
TT
Biến mã hóa
Biến số thực
Kết quả
x
1

x
2

x
3

x
4

X
1

X
2

X

0,6
1,88
3
-1
1
-1
-1
18
140
2
10
1,0
2
1,75
4
1
1
-1
-1
25
140
2
10
0,2
1
1,79
5
-1
-1
1

8
1
1
1
-1
25
140
4
10
0
1,75
9
-1
-1
-1
1
18
60
2
200
0,6
3,85
2
10
1
-1
-1
1
25
60

-1
-1
1
1
18
60
4
200
0
3,84
14
1
-1
1
1
25
60
4
200
0
3,87
15
-1
1
1
1
18
140
4
200

0
0
26,4
100
3
105
0,1
5
3,18
19
0
-
1,4142
0
0
21,5
43,4
3
105
0,6
8
3,2
20
0
1,4142
0
0
21,5
156,6
3

0
0
-
1,4142
21,5
100
3
-29,3
-
-
24
0
0
0
1,4142
21,5
100
3
239,
3
0,8
6
4,07
25
1
0
0
0
0
21,5

7
3,23

Ở đây, cần tiến hành N = 27 thí nghiệm để xác định các hệ số trong PTHQ. Thí nghiệm
thứ 25 là thí nghiệm ở tâm được tiến hành 3 lần. Phương sai của các thí nghiệm được xác
định theo thí nghiệm bổ sung ở tâm là
2
0(R)
S
= 7,43.10
-5
,
2
0(RSD)
S
= 7.10
-4
. Từ kết quả thí nghiệm,
sử dụng phần mềm Modde 5.0 loại bỏ các hệ số hồi quy không phù hợp, tức là các hệ số có
TN
i
t
=
i
ib
b /S
< t
p
(f) hay
TN

8,01.10
-
19

8,0.10
7

3,6.10
9

0,03
0,06
x
1

-0,22
0,01
3,89.10
-13

0,30
3,7.10
5

0,018
0,01
0,03
x
2


0,03
x
4

0,01
1,04
0,12
1,45.10
-
16

0,024
8,6.10
7

0,01
0,03
x
1
.x
1

-0,24
-0,02
2,36.10
-11

0,29
4,9.10
4

2,5.10
5

0,14
0,02
0,04
x
4
.x
4

-0,05
-0,33
1,19.10
-5

1,15.10
-8

13
3,1.10
-3

0,02
0,05
x
1
.x
2


1
.x
4

-0,01
0,01
0,30
0,49
0,013
0,014
0,01
0,03
x
2
.x
3

-0,01
3,10.10
-3

0,20
0,82
0,02
3,4.10
-3

0,01
0,03
x

0,03
N = 26
2
I
R 
0,9983
RSD
I
=0,025
P
=0,95
2
II
R 
0,9984
RSD
II
=0,053
*Ghi chú: Những hệ số in nghiêng, đậm là hệ số không có ý nghĩa trong PTHQ.

Những kết quả thu được ở bảng 3.3 cho thấy có ảnh hưởng bậc nhất tới khả năng tách
các FAME y
1
là tốc độ pha động x
1
(tiêu cực), nhiệt độ ban đầu x
2
(tích cực) và tốc độ tăng
nhiệt của cột tách x
3

i
như sau:
y
1
= 0,95 – 0,22x
1
+ 0,12x
2
– 0,21x
3
– 0,11x
1
x
2
+ 0,10x
1
x
3
– 0,24(x
1
2
– 0,800) – 0,05(x
2
2

– 0,800) – 0,31(x
3
2
– 0,800) – 0,05(x
4

< F
bảng
= F
0,95
(15, 2) = 19,43.
F
mô hình II
=
II
2
phï hîp II
2
0
S
S
=
3
4
1,33 . 10
1,91
7.1 0



< F
bảng
= F
0,95
(23, 2) = 19,45.
F

1
2
– 0,33.10
-4
X
2
2
– 0,31X
3
2
– 0,05.10
-4
X
4
2
(3.3)
Y
2
= 1,95 + 0,02X
4
– 3,65.10
-5
X
4
2
(3.4)
Với
o
ii
i

giá trị thực nghiệm chỉ có một sự sai khác nhỏ.
3.1.2.2. Xác định điều kiện tối ƣu của GC/FID
Dựa trên mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao xây dựng được khi thực nghiệm khảo sát
ảnh hưởng đồng thời của các nhân tố của GC/FID đến khả năng tách các FAME và độ lệch
chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS để xác định điều kiện tối ưu. Bằng cách lấy
đạo hàm của hàm hồi quy theo từng biến và cho bằng 0 để tìm ra cực trị của hàm (thông qua
phần mềm Modde 5.0) tìm được điều kiện tối ưu để tách và xác định các FAME như sau: tốc
độ khí mang He: 20,5 cm/s; tốc độ tăng nhiệt của cột tách: 2,4
0
C/phút; nhiệt độ ban đầu của
cột tách: 140
0
C; tỉ lệ bơm chia dòng: 30:1. Ở điều kiện tối ưu trên, khả năng tách các FAME
và độ lệch chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS có giá trị dự đoán theo mô hình
tối ưu hóa lần lượt là 1,08 và 2,11%. Các giá trị trung bình tương ứng thu được khi tiến hành
thực nghiệm 3 lần với chất chuẩn FAME 20–40–60 ppm là 1,08 và 2,12%.
Giá trị các phương sai thực nghiệm theo điều kiện tối ưu thu được:
I
2
tu
S
= 6,43.10
-5
,
II
2
tu
S
=
5,33.10

(0,95; 2; 2) = 19. Như vậy độ
chính xác của các số liệu theo mô hình và theo thực nghiệm ở điều kiện tối ưu là giống nhau.
Kết quả này cho thấy mô hình dự đoán có độ chính xác cao, đảm bảo độ tin cậy. Đây là một
công cụ hữu ích trong việc tiên đoán kết quả cũng như tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm.
3.2. Nghiên cứu chuyển đổi DMĐTV thành FAME
3.2.1. Kiểm tra hàm lƣợng axit béo tự do, lựa chọn quy trình chuyển đổi
Hàm lượng axit béo tự do (%FFA) có ảnh hưởng đến quy trình chuyển đổi DMĐTV
thành FAME. Các phản ứng chuyển đổi este dùng xúc tác kiềm cần có nguyên liệu đầu với
hàm lượng FFA < 2,5%. Nếu hàm lượng FFA > 2,5% thì cần sử dụng nhiều kiềm hơn để
trung hòa FFA, đồng thời sản phẩm tạo ra xà phòng và nước nhiều hơn. Xà phòng sinh ra làm
tăng độ nhớt của hỗn hợp, tạo thành nhũ và làm cho việc tách glyxerin trở nên khó khăn.
Phản ứng sinh ra nhiều nước có thể làm cho metyl este bị thủy phân tạo ra axit béo và
metanol, do vậy tiêu tốn nhiều xúc tác hơn và hiệu suất phản ứng bị giảm đi đáng kể. Do đó
với dầu mỡ có hàm lượng FFA > 2,5% cần chuyển đổi qua hai giai đoạn, giai đoạn đầu thực
hiện phản ứng este hóa xúc tác axit để chuyển axit béo tự do thành FAME sau đó tiếp tục giai
đoạn hai với phản ứng transeste hóa dầu mỡ sử dụng xúc tác kiềm. Vì vậy trước hết chúng tôi
chuẩn độ kiểm tra hàm lượng axit béo tự do của nguyên liệu DMĐTV để lựa chọn quy trình
chuyển đổi DMĐTV thành FAME thích hợp.
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng FFA trong mỡ cá basa: 1,26%; mỡ lợn: 0,45%;
dầu đậu nành: 0,21%; dầu mè: 1,68%; dầu lạc: 0,33% và dầu dừa: 0,21%. Các mẫu dầu mỡ
này đều có hàm lượng FFA < 2,5%, hoàn toàn thích hợp tiến hành chuyển đổi thành FAME
bằng phương pháp metyl este hóa xúc tác kiềm một giai đoạn. Riêng dầu hạt cao su và dầu
hạt jatropha có hàm lượng FFA rất lớn, tương ứng 46,19% và 21,01%, phải tiến hành chuyển
đổi qua hai giai đoạn, giai đoạn đầu este hóa với xúc tác axit, giai đoạn hai chuyển vị este với
xúc tác kiềm.
3.2.2. Điều kiện chuyển đổi este theo phƣơng pháp đơn biến
Qua khảo sát đơn biến các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng chuyển đổi este
giữa mỡ cá basa và metanol sử dụng xúc tác kiềm và có mặt của dung môi chúng tôi thu được
khoảng biến thiên các điều kiện phản ứng như sau:
+ Tỉ lệ mol metanol/mỡ cá (X

4
(X
2
, % m/m): 0,5 – 2%
+ Thời gian phản ứng (X
3,
giờ): 1 – 6 giờ
+ Hàm lượng dung môi axeton (X
4
, % m/m): 10 – 50%
3.2.3. Điều kiện chuyển đổi este theo phƣơng pháp đa biến
* Xây dựng mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao
Tương tự như quá trình thực nghiệm tối ưu hóa các điều kiện GC/FID để tách và xác
định các FAME, với quá trình chuyển đổi DMĐTV, qua mô hình hồi quy bậc hai tâm trực
giao, chúng tôi thu được các PTHQ dạng mã hóa sau khi loại bỏ các nhân tố ảnh hưởng
không đáng kể như sau:
- Hiệu suất phản ứng este hóa xúc tác kiềm điều chế FAME từ mỡ cá basa ( = 0,7698):
y
1
= 94,06 + 5,88x
1
+ 1,53x
2
+ 2,18x
3
+ 4,46x
4
+ 0,99x
5
– 0,80x

4
– 1,18x
1
x
2
– 1,04x
1
x
4
– 1,47x
2
x
3
– 11,08x
1
2

– 3,2x
4
2
(3.6)
Biến đổi
o
ii
i
i
XX
x



+ 0,01X
5
2
(3.7)
Y
2
= – 20,39 + 17,71X
1
+ 4,43X
2
+ 2,18X
3
+ 0,68X
4
– 0,52X
1
X
2
– 0,02X
1
X
4
–
0,78X
2
X
3
– 1,23X
1
2

2
) và ảnh hưởng đồng thời của tỉ lệ mol metanol/mỡ cá và hàm lượng
dung môi (x
1
x
5
), hàm lượng xúc tác và nhiệt độ phản ứng (x
2
x
3
), hàm lượng xúc tác và thời
gian phản ứng (x
2
x
4
), hàm lượng xúc tác và hàm lượng dung môi (x
2
x
5
), nhiệt độ phản ứng và
thời gian phản ứng (x
3
x
4
), nhiệt độ phản ứng và hàm lượng dung môi (x
3
x
5
), thời gian phản
ứng và hàm lượng dung môi (x

1
) lại làm giảm nhiều nhất hiệu suất phản ứng (ảnh
hưởng tiêu cực). Các ảnh hưởng bậc hai và ảnh hưởng đồng thời của các nhân tố khảo sát
cũng đều là ảnh hưởng tiêu cực. Sự thay đổi đồng thời hàm lượng xúc tác (x
2
x
2
), thời gian
phản ứng (x
3
x
3
), tỉ lệ mol metanol/dầu và thời gian phản ứng (x
1
x
3
), xúc tác và dung môi
(x
2
x
4
), thời gian phản ứng và dung môi (x
3
x
4
) ít ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng. Ảnh
hưởng của các nhân tố khảo sát đến hiệu suất phản ứng este hóa dầu hạt cao su được thể hiện
trên hình 3.17.
Hình 3.17. Sự biến thiên của hiệu suất phản ứng este hóa xúc tác axit dầu hạt cao su theo tỉ
lệ mol metanol/dầu (3/1 – 9/1) và hàm lượng dung môi (10 – 50%) khi cố định hàm lượng

Điều kiện tối ưu của phản ứng este hóa xúc tác axit (giai đoạn một) của quá trình hai giai
đoạn điều chế FAME từ dầu hạt cao su thu được như sau: tỉ lệ mol metanol/dầu: 7,5/1
(mol/mol); hàm lượng xúc tác H
2
SO
4
: 1,65% (m/m); thời gian phản ứng: 4 giờ; hàm lượng
dung môi axeton: 35%; phản ứng thực hiện ở 60
o
C. Ở điều kiện tối ưu này, hiệu suất phản
ứng este hóa dự đoán có giá trị là 97,9%. Kết quả thực nghiệm thu được giá trị trung bình của
3 lần thí nghiệm ở điều kiện này là 98,3%. Giá trị phương sai theo điều kiện tối ưu thu được
là S
tu
2
= 0,034, của mô hình là S
0
2
= 0,350, F
tn
= 0,350/0,034 = 10,29 < F
bảng
(0,95, 2, 2) = 19,
độ chính xác của các số liệu theo mô hình và theo thực nghiệm ở điều kiện tối ưu là giống
nhau.
Qua so sánh kết quả nghiên cứu với các kết quả chuyển đổi este DMĐTV theo hướng
khảo sát đơn biến từng nhân tố với các loại xúc tác khác nhau cho thấy phản ứng chuyển đổi
theo hướng tối ưu hóa đồng thời các nhân tố trong môi trường đồng thể đạt được hiệu suất
cao hơn với lượng metanol cần dùng ít hơn, thời gian ngắn và nhiệt độ thấp hơn nhiều. Đó
chính là ưu điểm của phương pháp tối ưu hóa chuyển đổi DMĐTV thành FAME này so với


LO
D
(pp
m)
LO
Q
(pp
m)
1
C4:0
y = (0,2138  0,0334)x – (0,7961 
1,6451)
0,9964
0,8
2,6
2
C6:0
y = (0,1066  0,0191)x – (0,3036 
0,9336)
0,9953
1,6
5,2
3
C8:0
y = (0,2688  0,0347)x – (0,7646 
1,7056)
0,9976
0,3
1,1

y = (0,2599  0,0216)x – (0,4558 
1,0707)
0,9990
1,1
3,5
9
C14:1
y = (0,2466  0,0159)x – (0,1023 
0,3895)
0,9994
0,5
1,7
10
C15:0
y = (0,2512  0,0197)x – (0,1922 
0,4856)
0,9991
0,9
3,1
11
C15:1
y = (0,2322  0,0146)x – (0,0498 
0,3618)
0,9994
0,8
2,6
12
C16:0
y = (0,2581  0,0226)x – (0,5489 
1,6721)

0,5174)
0,9987
0,2
0,7
15
C17:1
y = (0,2373  0,0210)x – (0,1194 
0,5180)
0,9988
0,2
0,7
16
C18:0
y = (0,2436  0,0353)x – (0,4954 
1,7351)
0,9969
1,4
4,6
17
C18:1n-
9t
y = (0,2683  0,0382)x – (0,3669 
0,9365)
0,9970
0,8
2,7
18
C18:1n-
9c
y = (0,2485  0,0073)x – (0,2644 

0,3701)
0,9992
0,8
2,6
23
C20:1
y = (0,2322  0,0239)x – (0,1528 
0,5855)
0,9985
0,9
2,9
24
C18:3n-3
y = (0,2017  0,0185)x – (0,0941 
0,4550)
0,9988
0,8
2,5
25
C21:0
y = (0,2784  0,0566)x – (0,5429 
1,3969)
0,9939
0,7
2,4
26
C20:2
y = (0,1954  0,0264)x – (0,1625 
0,6517)
0,9973

31
C22:4n-6
y = (0,1847  0,0207)x – (0,1544 
0,5107)
0,9981
0,9
2,8
32
C23:0
y = (0,2001  0,0245)x – (0,1093 
0,6039)
0,9978
0,4
1,3
33
C22:2
y = (0,1528  0,0162)x – (0,0829 
0,9984
1,8
5,8
Bảng 3.16. Phương trình hồi quy, giới hạn phát hiện, giới hạn
định lượng các FAME của phương pháp phân tích
TT
FAME
Phƣơng trình hồi quy (
P
=0,95)
R

LO

C22:6n-3
y = (0,1994  0,0111)x – (0,0331 
0,2762)
0,9995
0,4
1,3
MIN
0,2
0,
7
MAX
2,2
7,
3

3.3.2. Khảo sát độ lặp lại
Độ lặp lại của hệ thống sắc ký khí (thời gian lưu, tỉ lệ diện tích pic FAME/IS) được khảo
sát bằng cách bơm 7 lần song song mẫu chuẩn hỗn hợp 37 FAME 20-40-60 ppm trong cùng
điều kiện tối ưu của GC/FID. Kết quả thu được cho thấy độ lặp lại của hệ thống sắc ký khí rất
tốt, giá trị độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu của mẫu chuẩn hỗn hợp 37 FAME 20-40-
60 ppm dao động trong khoảng từ 0,03 đến 0,08%, độ lệch chuẩn tương đối về tỉ lệ diện tích
pic FAME/IS dao động trong khoảng từ 1,28 đến 4,98%. Khi hàm lượng chất phân tích 10
ppm thì RSD (%) cho phép là 7,3%, hàm lượng chất phân tích 100 ppm thì RSD (%) cho
phép là 5,3% [117]. Như vậy với mẫu chuẩn FAME 20-40-60 ppm, độ lệch chuẩn tương đối
của hệ thống GC đều dưới 5%, đáp ứng được yêu cầu phân tích định lượng.
Kết quả khảo sát độ lặp lại 6 lần của phương pháp phân tích khi tiến hành thực nghiệm
trên 8 mẫu DMĐTV Việt Nam ở các điều kiện tối ưu của quá trình chuyển đổi este và của
GC/FID cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về hàm lượng FAME điều chế từ mỡ cá basa dao
động từ 1,02 đến 4,65%, mỡ lợn: từ 1,25 đến 5,13%, dầu đậu nành: từ 0,87 đến 5,18%, dầu
mè từ 1,18 đến 4,72%, dầu lạc: từ 1,28 đến 4,96%, dầu dừa: từ 0,95 đến 4,89%, dầu hạt cao

phân tích
(mg/g)
Kết quả kiểm
nghiệm Vilas
(mg/g)
t
tn
(N=6)
Mỡ cá basa
Axit
palmitic
227
238
2,570
Axit oleic
305
308
0,840
Axit linoleic
118
123
2,448
Dầu mè
Axit
palmitic
77
79
2,330
Axit oleic
285

Ss
H% 100%
S




(3.11)
Trong đó:
i
s

: tổng diện tích pic của các triglyxerit chưa chuyển đổi thành FAME,
i
S

: tổng diện tích pic của tất cả các triglyxerit ban đầu.
Kết quả độ chuyển đổi trung bình ba lần đo của các mẫu DMĐTV được thể hiện trên
bảng 3.29.
Kết quả phân tích bằng UFLC cho thấy mức độ phản ứng chuyển đổi este các mẫu
DMĐTV nghiên cứu là rất cao (> 98%), hàm lượng monoglyxerit, diglyxerit và triglyxerit
sau phản ứng chỉ là lượng vết, quá trình chuyển đổi có độ lặp lại tốt, độ lệch chuẩn tương đối
dưới 0,7%, sản phẩm thích hợp để tiến hành phân tích thành phần FAME trên thiết bị
GC/FID.
Bảng 3.29. Độ chuyển đổi thành FAME của các mẫu DMĐTV (n = 3)
DMĐTV
H
1

(%)

99,8
99,3
99,6  0,7
0,3
0,29
Dầu mè
97,8
98,3
98,1
98,1  0,7
0,3
0,26
Dầu lạc
99,1
98,1
97,9
98,4  1,5
0,6
0,65
Dầu Dừa
99,8
100
99,9
99,9  0,2
0,1
0,10
Dầu hạt cao su
98,3
98,1
97,9

Trong dầu đậu nành phân tích được 15 axit béo, trong đó tổng hàm lượng các MUFA
nhiều nhất (39%), tiếp đến là các PUFA (32%) và thấp nhất là các SFA (29%). Dầu đậu nành
chứa một lượng đáng kể các axit béo -3 (75 mg/g) và axit béo -6 (188 mg/g).
Trong dầu mè có chứa 11 axit béo trong đó nhiều nhất là PUFA, 51%, chủ yếu là axit
linoleic, tiếp đến là MUFA, 34%, chủ yếu là axit oleic và chỉ có 15% các SFA. Dầu mè cũng
chứa lượng đáng kể axit béo -6 (424 mg/g) và đặc biệt có chứa lượng bé thành phần của
DHA (0,165 mg/g) mà các loại dầu thực vật khác không có.
Trong dầu lạc có chứa 13 axit béo, nhiều nhất là các MUFA, 42%, chủ yếu là axit oleic,
tiếp đến là các PUFA, 35%, chủ yếu là axit linoleic và chứa ít hơn các SFA, 22%, chủ yếu là
axit palmitic. Dầu lạc cũng chứa nhiều axit béo -6 (288 mg/g) nhưng lượng axit béo -3 thì
rất ít (0,66 mg/g).
Đối với dầu dừa thì khác với các dầu thực vật đã phân tích, thành phần chủ yếu lại là các
SFA (8/12 axit béo), chiếm đến 87%, nhiều nhất là axit lauric (43%), axit myristoleic (19%),
axit palmitic (12%),… và chứa lượng ít các MUFA (9%) và PUFA (3%). Duy nhất chỉ có dầu
dừa là chứa các axit béo mạch ngắn C8, C10. Lượng axit béo -3, -6 của dầu dừa ít hơn rất
nhiều so với các dầu thực vật trên. Do đó dầu dừa đóng rắn ở điều kiện thường và giá trị dinh
dưỡng của dầu dừa là thấp nhất.
Dầu hạt cao su và dầu hạt jatropha là hai loại dầu trong thành phần có chứa nhiều loại
độc tố và các chất kháng dinh dưỡng (antinutritional) gây độc hại đối với người và vật nuôi.
Vì vậy hai loại dầu này không sử dụng làm thức ăn mà chủ yếu để nghiên cứu sản xuất nhiên
liệu sinh học, xà phòng và dược liệu cho con người. Kết quả phân tích cho thấy dầu hạt cao
su và dầu hạt jatropha có thành phần gần tương đồng nhau, gồm 13 axit béo, trong đó nhiều
nhất là các PUFA (tương ứng 46% và 43%), tiếp đến là MUFA (34% và 35%) và chứa ít hơn
các SFA (19% và 21%), chủ yếu cũng bao gồm các axit palmitic, stearic, oleic, linoleic.
Tóm lại, với kết quả phân tích các mẫu DMĐTV trên chúng tôi nhận thấy: Dầu dừa chứa
hàm lượng axit béo no cao nhất, ít axit béo không no, nhất là axit béo -3, -6 do đó ít có giá
trị dinh dưỡng nhất, thích hợp bổ sung vào thức ăn và làm chế phẩm dinh dưỡng cho động vật
nuôi. Để chế tạo nhiên liệu sinh học từ dầu dừa, cần có thêm phụ gia hạ nhiệt độ đông đặc và
độ nhớt cho nhiên liêu vì nhiên liệu này có hàm lượng axit béo no cao, nhiệt độ đông đặc,
nhiệt độ bắt cháy và độ nhớt cao, không có lợi về mặt kinh tế.

là sản phẩm phụ có sẵn, rẻ tiền, sản lượng tăng nhanh trong những năm gần đây do tình hình
xuất khẩu phile cá phát triển mạnh, đặc biệt là ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Vì vậy
để không ảnh hưởng đến nguồn lương thực, thực phẩm quốc gia, đồng thời tận dụng được
nguồn phế thải, hạn chế gây ô nhiễm môi trường, lại có năng suất thu hoạch cao thì dùng phụ
phẩm mỡ cá basa từ các nhà máy chế biến thủy sản để làm nguyên liệu điều chế biodiesel là
thích hợp hơn cả. KẾT LUẬN

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Nhằm xác định chính xác và chọn lọc đồng thời 37 axit béo, đã sử dụng mô hình hồi
quy bậc hai tâm trực giao xây dựng phương trình hồi quy và đánh giá ảnh hưởng đồng thời
các yếu tố đến khả năng tách và xác định các axit béo trong dầu mỡ động, thực vật Việt Nam.
2. Trên cơ sở dữ kiện thực nghiệm đã tối ưu hóa điều kiện tách và xác định đồng thời 37
axit béo bằng phương pháp sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa gồm: Cột mao quản phân
cực mạnh SP
TM
-2560 (100m × 0,25mm × 0,2m); chương trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 140
0
C,
giữ 5 phút, tăng 2,4
0
C/phút lên 240
0
C, giữ 8 phút; khí mang He, tốc độ 20,5 cm/s; bơm chia
dòng tỉ lệ 30:1.
3. Đã thành công trong việc nghiên cứu một cách có hệ thống kiểm tra hàm lượng axit
béo tự do trong DMĐTV và chuyển đổi DMĐTV thành FAME từ khảo sát đơn lẻ đến mô
hình hồi quy bậc hai tâm trực giao xét ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến hiệu suất chuyển

lượng đồng thời EPA và DHA trong 1 số viên nang mềm omega 3 bằng sắc kí khí”,
Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc (2) tập 5, tr. 14–16.
3. Nguyễn Xuân Duy, Đỗ Trọng Sơn, Trina Lapis, Vanessa Leibero, Stuart Thomas, Tobias
Pop (2010), “Thành phần axit béo của một số loại dầu thương mại có nguồn gốc từ
động vật và thực vật”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng 3 (38), tr.
25–30.
4. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2008), Đề án “Nghiên cứu, phát triển và sử dụng
sản phẩm cây cọc rào ở Việt Nam giai đoạn 2008–2015 và tầm nhìn đến 2025”.
5. Vũ Thị Thu Hà, Lê Đăng Khoa, Nguyễn Đình Lâm (2007), “Nghiên cứu phản ứng tổng
hợp biodiesel bằng phương pháp siêu tới hạn và thu glyxêrin độ tinh khiết cao”,Tạp
chí Hóa học & Ứng dụng 8 (68), tr. 41–43.
6. Trần Thị Việt Hoa, Lê Thị Thanh Hương, Phan Minh Tân, Trương Vũ Thanh (2007),
“Điều chế biodiesel từ mỡ cá basa bằng xúc tác p–Toluen sunfonic”, Hội nghị khoa
học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, tr. 834–839.
7. Lại Mai Hương (2007), “Kết tinh phân đoạn acid béo không no nhiều nối đôi từ dầu cá
trích và cá basa”, Tạp chí Hóa học 45 (5), tr. 559–564.
8. Lê Thị Thanh Hương, Trần Thị Việt Hoa, Nguyễn Thị Ngọc Bích (2006), “Tổng hợp AKD
từ mỡ cá basa sử dụng trong công nghệ xeo giấy”, Tạp chí phát triển KH&CN 9 (7), tr.
49–56.
9. Lê Thị Thanh Hương, Lê Viết Tấn, Phan Minh Tân, Trần Thị Việt Hoa (2009), “Ảnh
hưởng của mức độ chuyển hóa este đến chất lượng của biodiesel điều chế từ mỡ cá
tra”, Tạp chí Hóa học 47 (4A), tr. 107–112.
10. Lê Thị Thanh Hương, Lê Viết Tấn, Phan Minh Tân, Trần Thị Việt Hoa (2009), “Tối ưu
hóa chuyển hóa este mỡ cá tra với xúc tác KOH/–Al
2
O
3
sử dụng phương pháp bề mặt
đáp ứng”, Tạp chí phát triển KH&CN 13 (12), tr. 69–76.
11. Hồ Sơn Lâm, Lê Thị Hòa, Phạm Thanh Hà, Võ Đỗ Minh Hoàng, Nguyễn Thị Thu Thảo,

hạt cao su”, Tạp chí Hóa học 47 (2A), tr. 184–188.
20. Nguyễn Hồng Thanh, Nguyễn Trần Tú Nguyên, Nguyễn Thị Phương Thoa (2009),
“Điều chế biodiesel từ mỡ cá basa bằng phương pháp hóa siêu âm”, Tạp chí phát triển
KH&CN 12 (3), tr. 51–61.
21. Nguyễn Văn Thanh, Bùi Công Mạnh, Đinh Thị Ngọ, Đào Văn Tường (2008), “Nghiên
cứu tổng hợp biodiezel từ dầu đậu nành trên xúc tác bazơ”, Tạp chí Hoá học 46 (2),
tr. 172–177.
22. Tạ Thị Thảo (2008), Giáo trình Thống kê trong Hóa phân tích, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
23. Nguyễn Thị Phương Thoa, Nguyễn Thị Thanh Nhanh, Võ Ðông Phong, Nguyễn Thị Mai
Thanh, Lê Viết Hải, Nguyễn Nhị Trự (2006), “Ðiều chế biodiesel từ dầu thực vật thải
bằng phương pháp hóa siêu âm”, Hội thảo Khoa học lần thứ Nhất về nhiên liệu có
nguồn gốc sinh học biofuel & biodiesel ở Việt Nam, tr. 63–75.
24. Chu Quang Truyền, Lê Tất Thành, Lưu Văn Huyền, Phạm Quốc Long (2006), “Vai trò
của các acid béo đa nối đôi (PUFA) như thức ăn bổ sung trong chăn nuôi”, Hội nghị
Khoa học lần thứ 20, Kỷ niệm 50 năm thành lập trường Đại học Bách khoa Hà Nội
12, tr. 85–89.
25. Nguyễn Thanh Uyên (2005), “Vai trò của DHA và ARA–Những lời khuyên đối với các
bà mẹ mang thai và nuôi con bú”, Y học thực hành số 12, tr. 92–95.
26. Phạm Hùng Việt (2003), Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký khí, NXB Khoa học và
Kỹ thuật Hà Nội, Hà Nội.
27. Nguyễn Tường Vy, Trần Tử An, Đăng Đức Khanh, Trịnh Văn Lẩu (2005), “Xác định các
axit béo trong dầu màng hạt gấc bằng phương pháp sắc ký khí (GC/FID)”, Tạp chí
kiểm nghiệm thuốc 3 (9), tr. 21–25.
28. Nguyễn Tường Vy, Trần Tử An, Đặng Đức Khanh, Trịnh Văn Lẩu (2007), “Xác định
thành phần các acid béo dầu gấc bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS)”, Tạp chí Dược
học 3, tr. 28–30.
29. Hoàng Thị Yến, Lê Thị Anh Đào (2004), “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của màng đỏ hạt gấc và nhân hạt gấc (momordica cochinchinensis spreng) ở
Sơn Tây Hà Tây”, Kỷ yếu hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học năm 2004, Trường

38. Audun F., Eli A. B., Achim K. (2005), “Determination of C22:5 and C22:6 marine fatty
acids in pork fat with Fourier transform mid–infrared spectroscopy”, Meat Science 69,
pp. 433–440.
39. Augustsson K.(2003), "A prospective study of intake of fish and marine fatty acids and
prostate cancer", Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (1), pp. 64–67.
40. Ayhan Demibars (2008), Biodiesel – A realistic Fuel Alternative for Diesel Engines,
Springer–Verlag, London Limited, London.
41. Ayhan Demirbas (2009), “Political, economic and environmental impacts of biofuels: A
review”, Applied Energy 86, pp. 108–117.
42. Ayhan Demirbas (2009), “Progress and recent trends in biodiesel fuels”, Energy
Conversion and Management 50, pp. 14–34.
43. Bahruddin Saad (2007), “Determination of free fatty acids in palm oil samples using
non–aqueous flow injection titrimetric method”, Food Chemistry 102, pp. 1407–
1411.
44. Banerjee A., Chakraborty R. (2009), “Parametric sensitivity in transesterification of waste
cooking oil for biodiesel production – A review”, Resources Conservation and
Recycling 53, pp. 490–497.
45. Bautista L. F., Vicente G., Rodriguez R., Pacheco M. (2009), “Optimization of FAME
production from waste cooking oil for biodiesel use”, Biomass and bioenergy 33, pp.
862–872.
46. B. Brügger, G. Erben, R. Sandhoff, F. T. Wieland, and W. D. Lehmann (1997),
“Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by
nano–electrospray ionization tandem mass spectrometry”, PNAS 94 (6), pp. 2339–
2344.
47. Ben Perston, Nick Harris (2009), Biodiesel Blend Analysis by FTIR (ASTM D7371 and
EN 14078), Seer Green, UK.
48. Bezerra M. A., Santelli R. E., Oliveira E. P., Villar L. S., Escaleira L. A. (2008),
“Response surface methodology (RSM) as tool for optimization in analytical
chemistry”, Talanta 76, pp. 965–977.
49. Boryana Nikolova Damyanova, Herslof B. G., Christie W. W. (1992), “Silver ion high–

fatty acid determination”, Chemija 17 (4), pp. 61–66.
61. Davidson M. H., Stein E. A., Bays H. E., Maki K. C., Doyle R. T., Shalwitz R. A.,
Ballantyne C. M., Ginsberg H. N. (2007), “Efficacy and tolerability of adding
prescription omega–3 fatty acids 4 g/d to Simvastatin 40 mg/d in hypertriglyceridemic
patients: An 8–week, randomized, double–blind, placebo–controlled study”, Clin Ther
29 (7), pp. 1354–1367.
62. De Deckere E. A. (1999), “Possible beneficial effect of fish and fish n−3 polyunsaturated
fatty acids in breast and colorectal cancer”, Eur J Cancer Prev 8 (3), pp. 213–221.
63. Demirbas A. (2008), “Biodiesel from sunflower oil in supercritical methanol with
calcium oxide”, Energy Conversion and Management 48, pp. 937–941.
64. Demirbas A. (2008), “ Comparison of transesterification methods for production of
biodiesel from vegetable oils and fats”, Energy Conversion and Management 49 (1),
pp. 125–130.
65. Demirbas A. (2008), “Relationships derived from physical properties of vegetable oil
and biodiesel fuels”, Fuel 87, pp. 1743–1748.
66. Dennis Y. C. Leung, Xuan Wu, Leung M. K. H. (2010), “A review on biodiesel production
using catalyzed transesterification”, Applied Energy 87, pp. 1083–1095.
67. Dias J. M., Alvim–Ferraz M. C. M., Almeida M. F. (2008), “Comparison of the
performance of different homogeneous alkali catalysts during transesterification of
waste and virgin oils and evaluation of biodiesel quality”, Fuel 87(17–18), pp. 3572–
3578.
68. Di Serio M., Tesser R., Dimiccoli M., Cammarota F., Nastasi M., Santacesaria E. (2005),
“Synthesis of biodiesel via homogeneous Lewis acid catalyst”, Journal of Molecular
Catalysis A: Chemical 239, pp. 111–115.
69. Di Wu (2009), “Determination of α–linolenic acid and linoleic acid in edible oils using
near–infrared spectroscopy improved by wavelet transform and uninformative variable
elimination”, Analytical Chimica Acta 634, pp. 166–171.
70. Du W., Li W., Sun T., Chen X., Liu D. (2008), “Perspectives for biotechnological
production of biodiesel and impacts”, Appl Microbiol Biotechnol 79, pp. 331–337.
71. Edmurphy E. J., Rosenberger T. A., and Horrocks L. A. (1996), “Separation of neutral

esters from transesterified vegetable oils”, J Am Oil Chem Soc 61, pp. 1638–1643.
82. Fredoen V., Jacqueline J. M. S., Lia E. M. L., Albert H. G., Ronald J. A. W., Stephan K.
(2003), “Analysis of very long–chain fatty acids using electrospray ionization mass
spectrometry”, Molecular Genetics and Metabolism 79, pp. 189–196.
83. Kawachinaganoshi Osaka, Yasuaki Maeda, Micrea Vinatoru, Carmen Eugenia Stavarache
(2003), “Method for producing fatty acid alcohol ester”, European patent Office,
Application number 1411042, A1.
84. George Gutnikov (1995), “Fatty acid profiles of lipid samples”, Journal of
Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 671 (1–2), pp. 71–89.
85. George Gutnikov, John R. Stren (1991), “Rapid high–performance liquid
chromatographic determination of fatty acid profiles of lipids by conversion to their
hydroxamic acids”, Journal of Chromatography A 587 (2), pp. 292–296.
86. Giuseppe Procida, Luciano Ceccon (2006), :Gas chromatographic determination of free
fatty acids in olive mill waste water”, Analytica Chimica Acta 561, pp. 103–106.
87. Gerhard Knothe (2005), “Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty
acid alkyl esters”, Fuel Processing Technology 86, pp. 1059–1070.
88. Gerhard Knothe, Dunn R., Bagby M. O. (2008), “Biodiesel: The use of vegetable oils and
their derivatives as alternative diesel fuels”, Oil Chemical Research, National Center
for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S Department
of Agriculture, Peoria, IL 61604.
89. Guan G., Kusakabe K., Moriyama K. (2009), “Transesterification of vegetable oil to
biodiesel fuel using acid catalysts in the presence of dimethyl ether”, Fuel 88, pp.
81–86.
90. Guan G., Sakurai N., Kusakabe K. (2009), “Synthesis of biodiesel from sunflower oil at
room temperature in the presence of various cosolvents”, Chemical Engineering
Journal 146, pp. 302–306.
91. Guerreiro L., Castanheiro J. E., Fonseca I. M., Martin–Aranda R. M., Ramos A. M.,
Vital J. (2006), “Transesterification of soybean oil over sulfonic acid
functionalised polymeric membranes”, Catalysis Today 4648.
92. Havrilla C. M., Hachey D. L., Porter N. A. (2000), “Coordination (Ag

99. Illum R. F., Mussolino M. E., Madans J. H. (1996), “The relationship between fish
consumption and stroke incidence: The NHANES I Epidemiologic Follow–up Study
(National Health and Nutrition Examination Survey)”, Arch Intern Med 156 (5), pp.
537–542.
100. Iso H., Rexrode K. M., Stampfer M. J., Manson J. E., Colditz G. A., Speizer F. E.,
Hennekens C. H., Willett W. C. (2001), “Intake of fish and omega–3 fatty acids and
risk of stroke in women". JAMA 285 (3), pp. 304–312.
101. Jasmika Giacometti, Ana Milosevic, Codomila Milin (2002), “Gas chromatographic
determination of fatty acid contained in different lipid classes after their separation by
solid–phase extraction”, Journal of Chromatography A 976, pp. 47–54.
102. Jean–Pierre C. L. L., Lesley A. S., Elizabeth A. T., Michael A. Q. (2007), “Solid phase
extraction and liquid chromatography – mass spectrometry for the determination of
free fatty acids in shellfish”, Journal of Chromatography A 1145, pp. 51–57.
103. Jeong Gwi–Taek, Yang Hee–Seung, Park Don–Hee (2009), “Optimization of
transesterification of animal fat ester using response surface methodology”,
Bioresource Technology 100, pp. 25–30.
104. Jinmao You, Weibing Zhang, Yukui Zhang (2001), “Simple derivatization method for
sensitive determination of fatty acids with fluorescence detection by high–performance
liquid chromatography using 9–(2–hydroxyethyl)–carbazole as derivatization reagent”,
Analytica Chimica Acta 436 (1), pp. 163–172.
105. Jinmao You, Xianen Zhao, Yourui Suo, Yulin Li, Honglun Wang, Guichen Chen
(2007), “Determination of long–chain fatty acids in bryophyte plants extracts by
HPLC with fluorescence detection and identification with MS”, Journal of
Chromatography B 848 (2), pp. 283–291.
106. Kansedo J., Lee K. T., Bhatia S. (2009), “Biodiesel production from palm oils via
heterogeneous transesterification”, Biomass and Bioenergy 33, pp. 271–276.
107. Karmee S., Chadha A. (2005), “Preparation of biodiesel from crude oil of Pongamia
pinnata”, Bioresource Technology 96, pp. 1425–1429.
108. K. Eder (1995), “Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters”, Journal of
Chromatography B 671, pp. 113–131.

121. Marta Bernárdez, Laura Pastoriza, Gabriel Sampedro, Juan J. R. Herrera, Marta L.
Cabo (2005), “ Modified method for the analysis of free Fatty Acids in Fish”, J.
Agric. Food Chem 53 (6), pp. 1903 – 1906.
122. Meher L. C., Dharmagadda V. S. S., Naik S. N. (2006), “ Optimization of
alkali– catalyzed transesterification of Pongamia pinnata oil for production of
biodiesel”, Bioresource Technology 97, pp. 1392–1397.
123. Meher L., Kulkarni M., Dalai A., Naik S. (2006), “Transesteification of karanja
(Pongamia pinnata) oil by solid basic catalysts”, Eur. J. Lipid Sci. Technol 108, pp.
389–397.
124. Mori Trevor A., Bao Danny Q., Burke Valerie, Puddey Ian B., Beilin Lawrence J.
(1993), “Docosahexaenoic acid but not eicosapentaenoic acid lowers ambulatory blood
pressure and heart rate in humans”, Hypertension 34 (2), pp. 253–260.
125. Morinko Petrovic, Natasa Kezic, Vesna Bolanca (2010), “Optimization of the GC
method for routine analysis of the fatty acid profile in several food samples”, Food
Chemistry 122, pp. 285–291.
126. Morris M.C., Sacks F., Rosner B. (1993), “Does fish oil lower blood pressure? A
meta–analysis of controlled trials”, Circulation 88(2), pp. 523–533.
127. Najera A. I., Aldai N., Osoro K., Barron L. J. R. (2006), “Gas–liquid chromatographic
method for analyzing complex mixtures of fatty acids including conjugated linoleic
acids (cis 9 trans 11 and trans 10 cis 12 isomer) and long–chain (n–3 or n–6)
polyunsaturated fatty acids. Application to the intramuscular fat of beef meat”, Journal
of Chromatography A 1110, pp. 133–139.
128. Nelson L. A., Foglia T. A., Marmer N. W. (1996), “Lipase–catalyzed production of
biodiesel”, Journal of the American Oil Chemists' Society (JAOCS) 73 (8), pp.
1191–1194.
129. Nguyen Thi Danh, Nguyen Ngoc Hanh (2009), “Biodiesel production by
transesterification of catfish fat on solid base catalyst”, Journal of Science and
Technology 47 (5A), pp. 344–347.
130. Nimura N., Kinoshita T., Yoshida T., Uetake A., Nakai C. (1988), “1–
Pyrenyldiazomethane As a Fluorescent Labeling Reagent for Liquid Chromatographic

characterization of biodiesel: A review”, Fuel 87, pp. 2355–2373.
144. Shibasaki–Kitakawa N., Honda H. H., Kuribayashi H., Toda T., Fukumura T.,
Yonemoto T. (2007), “Biodiesel production using anionic ion–exchange resin as
heterogeneous catalyst”, Bioresource Technology 98, pp. 416–421.
145. Shucheng Liu, Chaohua Zhang, Pengzhi Hong, Hongwu Ji (2006), “Concentration of
docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) of tuna oil by urea
complexation: optimization of process parameters”, Journal of Chromatography A 73,
pp. 203–209.
146. Shu–Hui Chen, Kwan–Cheng Chen, Hsiang–Mei Lien (1999), “Determination of fatty
acids in vegetable oil by reversed–phase liquid chromatography with fluorescence
detection”, Journal of Chromatography A 849 (2), pp. 357–369,
147. Simopoulos Artemis P. (2002), “The importance of the ratio of omega–6/omega–3
essential fatty acids”, Biomedicine & Pharmacotherapy 56 (8), pp. 365–379.
148. Sonnich Meier, Svein A. Mjos, Horaldur Joensen, Otto Grahl–Nielsen (2006),
“Validation of a one–step extraction/methylation method for determination of fatty
acids and cholesterol in marine tissues”, Journal of Chromatography A 1104, pp. 291–
298.
149. Soriano Jr. N. U., Venditti R., Argyropoulos D. S. (2009), “Biodiesel synthesis via
homogeneous Lewis acid–catalyzed”, Fuel 88 (3), pp. 560–565.
150. Srivastava A., Prasad R. (2000), “Triglycerides–based diesel fuels”, Renewable and
Sustainable Energy Reviews 4, pp. 111–133.
151. Srivastava P. K., Verma M. (2008), “Methyl ester of karanja oil as an alternative
renewable source energy”, Fuel 87 (8–9), pp. 1673–1677.
152. Stephen T. Ingalls, Paul E. Minkler and Charles L. Hoppela J. Eric Nordlander (1984),
“Derivatization of carboxylic acids by reaction with 4′–bromophenacyl
trifluoromethanesulfonate prior to determination by high–performance liquid
chromatography”, Journal of Chromatography A 299, pp. 365–376.
153. Su Kuan–Pin, Huang Shih–Yi, Chiub Chih–Chiang, Shenc Winston W (2003),
“Omega–3 fatty acids in major depressive disorder: A preliminary double–blind,
placebo–controlled trial”, Eur Neuropsychopharmacol 13 (4), pp. 267–271.