ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG ĐỨC ANH
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI
SINH VẬT PHÂN GIẢI XENLULO ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÁC MẪU
ĐẤT DƯỚI TÁN RỪNG THÔNG Ở TĨNH GIA, THANH HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Quản lý tài nguyên rừng

Khoa

: Lâm nghiệp

Khóa học

: 2014 - 2018

Thái Nguyên - năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

Thái Nguyên - năm 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Luận văn được hoàn thành trong Chương trình thực tập tốt nghiệp của
trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Em xin cam đoan khóa luận tốt
nghiệp này là của bản thân. Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung
thực. Nếu có gì sai sót, em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Thái Nguyên, ngày 09 tháng 06 năm 2018
Giáo Viên Hướng Dẫn
Tác giả
Đồng ý cho bảo vệ trước hội đồng khoa học

TS. Nguyễn Công Hoan

Hoàng Đức Anh

Xác nhận của giáo viên phản biện
Giáo viên chấm phản biện xác nhận sinh viên
Đã sửa chữa sai sót khi Hội đồng chấm yêu cầu
(ký, ghi rõ họ tên)


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành tốt đợt thực tập tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn
chân thành đến Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Lâm nghiệp Trường Đại

Bảng 4.2. Sự phát triển sau 7 ngày của 12 chủng VSV trên các điều ............ 34
kiện ẩm độ khác nhau...................................................................................... 34
Bảng 4.3: Đường kính khuẩn lạc trung bình của các chủng VSV .................. 39
sau 12 ngày nuôi cấy ....................................................................................... 39
Bảng 4.4. Đường kính khuẩn lạc sau 12 ngày ở điều kiện nhiệt độ ............... 42
khác nhau......................................................................................................... 42


4

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase tới cellulose ......................... 5
Hình 2.1. Bản đồ vị trí địa lý Huyện Tĩnh Gia - Thanh Hóa .......................... 19
Hình 3.1. Tủ đổ môi trường ............................................................................ 27
Hình 3.2. Kính hiển vi và Tủ định ôn ............................................................. 28
Hình 4.1. Ảnh thí nghiệm sự phát triển của 12 chủng VSV đánh giá điều kiện
sinh trưởng phát triển ...................................................................................... 29
Hình 4.2. Biểu đồ đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng của các
chủng VSV sau 3 ngày nuôi cấy ..................................................................... 31
Hình 4.3. Ảnh thí nghiệm sự phát triển của Chủng VSV I.PN3 ở các thang ẩm
độ khác nhau.................................................................................................... 32
Hình 4.5. Ảnh thí nghiệm sự phát triển của chủng VSV LSN 13.4 ở các thang
ẩm độ khác nhau.............................................................................................. 33
Hình 4.7. Biểu đồ đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng của các
chủng VSV sau 7 ngày nuôi cấy ..................................................................... 35
Hình 4.8. Ảnh thí nghiệm sự phát triển của khuẩn lạc chủng IPN3 sau 7 ngày
nuôi cấy ........................................................................................................... 36
Hình 4.9. Ảnh thí nghiệm sự phát triển của khuẩn lạc chủng SS9 sau 7 ngày
nuôi cấy ........................................................................................................... 36
Hình 4.10. Ảnh thí nghiệm sự phát triển của khuẩn lạc chủng HBN 1.2 sau 7

Chữ viết tắt/ký hiệu

Giải nghĩa đầy đủ

CFU

Đơn vị khuẩn lạc trong 1 ml hoặc 1 gam

PDA

Potato Dextrose Agar

D

Đường kính vòng phân giải cellulose

VK

Vi khuẩn


vii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................. iii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ........................................................................ iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU .................................. vi
MỤC LỤC ...................................................................................................... vii

chủng VSV phân giải xenlulo ......................................................................... 26
3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng
VSV phân giải xenlulo .................................................................................... 26
3.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 27
3.4.1. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng của các
chủng VSV phân giải xenlulo ......................................................................... 27
3.4.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của
các chủng VSV phân giải xenlulo ................................................................... 28
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................... 29
4.1. Kết qủa đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng của các chủng
VSV phân giải xenlulo .................................................................................... 30
4.1.1 Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo sau 3 ngày
nuôi cấy ........................................................................................................... 30
4.1.2 Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo sau 7 ngày
nuôi cấy ........................................................................................................... 34
4.1.3 Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo sau 12 ngày
nuôi cấy ........................................................................................................... 39
4.2. Kết qủa đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các
chủng VSV phân giải xenlulo ......................................................................... 42
4.2.1 Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo sau 12 ngày
nuôi cấy ........................................................................................................... 42


9

PHẦN 5. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ ......................................................... 46
5.1. Kết luận .................................................................................................... 46
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47




chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi
sinh vật phân giải Xenlulo được phân lập dưới tán rừng thông ở Tĩnh Gia
Thanh Hóa” nhằm xác định được đặc điểm sinh học như điều kiện sinh
trưởng và phát triển tối ưu nhất cho các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân
hủy xenlulo cao ứng dụng vào trong sản xuất chế phẩm sinh học phân hủy
xenlulo nhanh, để phục vụ trong lĩnh vực sản xuất Nông - Lâm nghiệp và ứng
dụng trong phòng chống cháy rừng.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được đặc điểm sinh học, điều kiện sinh trưởng và phát triển
tối ưu của các chủng vi sinh vật là cơ sở khoa học để sản xuất chế phẩm sinh
học nhằm phân hủy xenlulo.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài góp phần bổ sung cơ sở lý luận trong việc nghiên cứu và sản
xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy nhanh xenlulo.
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
- Là cơ sở để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy nhanh
xenlulo phục vụ trong lĩnh vực sản xuất Nông - Lâm nghiệp và phòng chống
cháy rừng.
- Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với việc nghiên cứu khoa học, kỹ
năng thực hành học trong phòng thí nghiệm. Qua đó kết hợp với các kiến thức
lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu về chuyên
nghành đào tạo.


PHẦN 2
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.1 Tổng quan tài liệu nghiên cứu


tạo thành các phân tử đường β-

glucose.
Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase
được chia thành ba loại: - 1,4-  -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) 1,4-  -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) -  -Dglucoside
glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn
sống trong dạ dày cỏ bò và mối và trong một số nấm như Trichoderma,
Aspergillus…
Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß1,4-glucoside và tác động vào chuỗi xenlulo một cách tùy tiện, sản phẩm của
quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc xenlulo
theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi
xenlulo và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin.
Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở
vùng kết tinh của cellulose.
Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng
cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên
CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo vô định hình hoặc xenlulo đã bị phân
giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ nhưng khi có mặt
endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và
các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên


cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi
tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất
cảm ứng của cellulase.
2.1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân xenlulo thành
cellobiose và cuối cùng thành glucose.

phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi
sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Enzyme này có
khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu
lignoxenlulo và xenlulo trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua
các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng
lượng khác.
Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay
đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng
20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hóa học, gỗ
được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase,


pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu
quả khử lignin. Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy
mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và
hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Enzyme cellulase
được bổ sung vào nhiều giai đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất giấy.
Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyme cellulase để giữ màu
vải sáng, bền và không bị sờn cũ. Đối với vải jean, cellulase được dùng để
làm mềm vải jean và tạo ra các vệt “stone washed”. Trước đây các vệt “stone
washed” được làm thủ công bằng cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất
lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra những sợi chỉ trắng. Hiện nay người ta sử
dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean thay cho việc sử dụng đá
bọt. Enzyme cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên vải jean đã nhuộm
màu để tạo ra các vệt “stone washed”. Các vệt “stone washed” được tạo ra
bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt. Ngoài ra, người ta có
thể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm hàm lượng
cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt.
Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc
tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được

B.megaterium

A.syndovii

Act. roseus

B.mensenteroides

A. flavus

Act.griseus

Clostridium sp.

Fusarium culmorum

Act.melamocylas

Acetobacter xylinum

Fusarium oxysporum

Act.coelicolor

Vi khuẩn dạ cỏ

Mucor pusilus

Act.candidus


Clos.locheheadil

Trichoderma konongi

Act.xanthostrums

Cellulosemonas

Thermonospora curvata
Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật
sản sinh enzyme phân giải xenlulo và khả năng phân giải xenlulo của chúng.
Các vi sinh vật phân giải xenlulo trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng bao
gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩnchủ yếu được phân lập từ hệ tiêu hóa động vật
ăn cỏ như bò, cừu, dê, và côn trùng như bọ cánh cứng, mối [43]. Ngoài ra
chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước thải [34].
- Vi khuẩn: Vi khuẩn phân giải xenlulo bao gồm Clostridium,
Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus,
Methanobrevibacter

ruminatium,

Siphonobacter

aquaeclarae,


Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi,
Ochorobactrum

Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia,

chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều


nhất trong lĩnh vực phân hủy xenlulo [58]. Các cellulase từ nấm thường có
hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme
này từ vi khuẩn. Một số chủng nấm như Acremonium spp., Chaetomium spp.,
Trichoderma

reesei,

Trichodermaviride,

Phanerochaete

chrysosporium,

penicillium

Fusariumsolani,Talaromyces

pinophilum,
emersonii,

Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus
terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy
xenlulo ở nhiều môi trường khác nhau [58].
Theo Sivakumaran (2014) phân lập được 21 chủng từ các nguồn vật
liệu khác nhau như mùn cưa, lá rụng…. Trong đó lựa chọn loài nấm có khả
năng phân giải xenlulo bằng phương pháp giấy lọc và phương pháp dùng
thuốc thử DNS. Kết quả cho thấy Helminthosporium sp. và Cladosporium sp.

Lamot, Voets (1979)[ 3] đã 7 chủng vi sinh vật phân giải xenluloza để
phân hủy xenlophan như: Aspergillus.sp, Penicillium.sp, 2 loài Chaetomium,
1 loài Sclerotium rolfsii, 2 loài xạ khuẩn Streptomyces. Tác giả nhận thấy nếu
để riêng rẽ từng loại vi sinh vật tác dụng thì sự phân giải hầu như không diễn
ra, còn khi hỗn hợp các chủng nói trên thì sự phận giả xenlophan bị phân hủy.
Sau khi 7 chủng trong thời gian 100 ngày 85% xenlophan bị phân hủy sản
phẩm cuối cùng được làm phân bón bao gồm: 30% protein, 60% đường hòa
tan, 10% các gốc còn lại. Tại New Delhi- Ấn Độ Gaur và Bhardwaj (1985)[1]
đã phân lập và tuyển chọn được rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân
hủy xenluloza. Sau đó tác giả đã sử dụng chủng nấm Trichurus spiralis,
Trichoderma viride, Paecilomyces fusisporus, Aspergillus. Sp để đưa vào
đống ủ (rơm rạ, lá khô) kết quả cho thấy: hàm lượng C hữu cơ giảm từ 48%
xuống 25% trong vòng 1 tháng đầu tiên của quá trình ủ và chỉ trong vòng 810 tuần rơm rạ đã phân hủy hoàn toàn thành một loại phân hữu cơ có chất
lượng tốt. Trong phân chứa khoáng 1,7 %N và tỷ lệ C/N là 12:3.
Ở Nhật Bản đã phân lập và tuyển chọn ra một hỗn hợp các vi sinh vật có


ích thuộc nhóm yếm khí và hiếu khí gồm: Nấm men, vi khuẩn quang hợp, xạ
khuẩn, vi khuẩn lactic, nấm lên men và chế tạo ra được một chế phẩm vi sinh
hữu hiệu (EM) đã được chứng minh có tác dụng tốt ở nhiều lĩnh vực của đời
sống và sản xuất như: trong trồng trọt, trong chăn nuôi, trong bảo vệ môi
trường góp phần nâng cao chất lượng của đống ủ.
2.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi
sinh vật phân hủy xenlulo và khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase phân
hủy xenlulo từ vi sinh vật. Các nghiên cứu về vi sinh vật đã được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chế phẩm
từ vi sinh vật có hiệu lực phân giải hợp chất hữu cơ cao, nhằm tạo ra các chế
phẩm sinh học thân thiện với môi trường, mang lại nhiều lợi ích kinh tế trong
đời sống sản xuất. Có thể điểm qua các công trình nghiên cứu về vi sinh vật

22mm). Trong đó có 3 chủng P1.1, P1.4, PGLRH3 sinh trưởng tốt nhất trên
môi trường nước chiết khoai tây có bổ sung một số nguyên tố khoáng, có thể
ứng dụng 3 chủng này để sản xuất phân bón vi sinh hỗn hợp [25].
Nguyễn Thị Thuý Nga (2010) đã phân lập được 25 chủng vi sinh vật có
khả năng phân giải xenlulo trong đó có 10 chủng hiệu lực mạnh đường kính
vòng phân giải >15 mm và 5 chủng hiệu lực rất mạnh đường kính vòng phân
giải > 20mm. Trong 5 chủng đó có 2 chủng ĐT2 và ĐV2 đường kính >25
mm, có thể ứng dụng 2 chủng này để sản xuất phân bón vi sinh hỗn hợp [19].
Theo Nguyễn Thị Thúy Nga và cộng sự (2015) đã phân lập được 24
chủng vi khuẩn phân giải xenlulo trong đó tuyển chọn 8 chủng có hiệu lực
phân giải xenlulo khá và mạnh với đường kính vòng thủy phân lớn hơn 25mm
bao gồm các chủng M1.1, M5.2, M5.3, M5.4, X7, X3, X1, X10 chiếm khoảng
33,0% [18].


Theo Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp (2011) đã phân lập vi
khuẩn phân giải xenlulo trong đất trồng lúa và dạ cỏ bò nhằm sử dụng phân
giải rơm rạ và rác hữu cơ thành phân hữu cơ. Nhóm tác giả đã phân lập được
96 dòng vi khuẩn từ đất trồng lúa và 4 dòng vi khuẩn (Q4, Q5, Q8 và Q9) từ
dịch dạ cỏ của bò. Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng thủy
phân CMC [21].
Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng
nấm sợi có khả năng phân giải xenlulo cao.Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm
ra được một số điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai
chủng nấm này [10].
Hoàng Quốc Khánh và cộng sự (2003), đã nghiên cứu khả năng sinh
tổng hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua
nghiên cứu tác giả đã tìm ra được một số trông tin và điều kiện cơ bản cho sự
tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và chất thải công
nghiệp như mật rỉ đường [13].