BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ KIM MỴ

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY
AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC
PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ KIM MỴ



LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Thanh Trà – Phòng Hóa
sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt
Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp tôi
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Để hoàn thành bản luận văn này, Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ
kinh phí của đề tài cấp Viện HLKH & CN Việt Nam thuộc 7 hƣớng ƣu tiên,
MSĐT: VAST 04.03/18.19
Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm đào tạo Sau đại học Học Viện
Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Hóa học – Viện HLKH &
CN Việt Nam, Các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, Trung tâm nghiên cứu
các phƣơng pháp Phổ ứng dụng.
Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn này bằng tất cả sự
nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Rất mong nhận đƣợc những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2019
Học viên

Trần Thị Kim Mỵ


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên Tiếng Anh

Tên Tiếng Việt


NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

1

1

H-NMR

13

C-NMR

H-Nuclear
Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Resonance Spectrocopy
Proton
13

C-Nuclear
Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Resonance Spectrocoy
Carbon 13
Tăng cƣờng biến dạng bằng
chuyển phân cực



Phổ tƣơng tác hai chiều đồng
hạt nhân

HSQC

Heterronuclear
Quantum Coherence

HMBC

Heterronuclear Multiple Bond Phổ tƣơng tác đa liên kết hai
Correlation
chiều dị nhân

HR-MS

High
Resolution
Spectroscopy

δH, - δC

Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Single Phổ tƣơng tác hai chiều dị hạt
nhân

Mass Phổ khối phân giải cao
Độ chuyển dịch hóa học của

Hình 3.14: Phổ 1H của hợp chất HH03 ................................................................................ 40
Hình 3.15: Phổ 13C của hợp chất HH03 ............................................................................... 40
Hình 3.16: Phổ DEPT của hợp chất HH03 .......................................................................... 41
Hình 3.17: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH03 ................................................................ 41
Hình 3.18: Phổ MS của hợp chất HH04 .............................................................................. 42


Hình 3.19: Phổ 1H của hợp chất HH04 ................................................................................ 43
Hình 3.20: Phổ 13C của hợp chất HH04 ............................................................................... 43
Hình 3.21: Phổ 13C của hợp chất HH04 ............................................................................... 44
Hình 3.22: Cấu trúc của hợp chất HH04.............................................................................. 44
Hình 3.23: Phổ MS của hợp chất HH05 .............................................................................. 45
Hình 3.24: Phổ 1H của hợp chất HH05 ................................................................................ 46
Hình 3.25: Phổ 13C của hợp chất HH05 ............................................................................... 47
Hình 3.26: Cấu trúc hợp chất HH05 .................................................................................... 47
Hình 3.27: Phổ khối phân giải cao HRESI-MS của hợp chất HH06 ................................... 48
Hình 3.28: Phổ 1H-NMR của hợp chất HH06 ..................................................................... 48
Hình 3.29 : Phổ 13C-NMR của hợp chất HH06 ................................................................... 49
Hình 3.30: Phổ HSQC của hợp chất HH06 ......................................................................... 49
Hình 3.31: Phổ HMBC của hợp chất HH06 ........................................................................ 50
Hình 3.32 : Tƣơng tác HMBC của hợp chất HH06 ............................................................. 50
Hình 3.33: Phổ 1H-NMR của HH07 .................................................................................... 51
Hình 3.34: Phổ 13C-NMR của HH07 ................................................................................... 52
Hình 3.35: Phổ DEPT của HH07 ......................................................................................... 52
Hình 3.36: Phổ HMBC của HH07 ....................................................................................... 53
Hình 3.37: Cấu trúc của hợp chất HH07.............................................................................. 54
Hình 3.38: Phổ 1H của hợp chất HH08 ................................................................................ 54
Hình 3.39: Phổ 13C của hợp chất HH08 ............................................................................... 55
Hình 3.40: Phổ DEPT của hợp chất HH08 .......................................................................... 56
Hình 3.41: Cấu trúc của hợp chất HH08.............................................................................. 56

1.4.3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy)
...................................................................................................................................16
1.4.3.2. Phổ khối lƣợng MS (Mass spectrometry) ....................................................17
1.4.3.3. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ......17
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................20
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................20
2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .................................20
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu .........................................................................................21
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................21


2.3.1. Xử lý mẫu thực vật ..........................................................................................21
2.3.2. Điều chế các cặn chiết .....................................................................................21
2.3.3. Phƣơng pháp phân lập và phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất tự
nhiên [35,36] .............................................................................................................22
2.3.4. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân cây An xoa ......................24
2.4. DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP
ĐƢỢC .......................................................................................................................25
2.4.1. Betulin (HH01)................................................................................................25
2.4.2. Axit betulinic (HH02) .....................................................................................26
2.4.3. Axit alphitolic (HH03) ....................................................................................27
2.4.4. Axit oleanolic (HH04).....................................................................................27
2.4.5. Hibiscolactone A (HH05) ...............................................................................28
2.4.6. Heliclactone (HH06) .......................................................................................28
2.4.7. Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (HH07) ...............................................................29
2.4.8. β-sitostenone (HH08): .....................................................................................30
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................31
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH01 (betulin) ................31
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH02 (axit betulinic) ......35
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH04 (axit oleanolic) ......41

tăng bệnh tật đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo nhƣ ung thƣ, tim mạch…thì việc
nghiên cứu tác dụng làm thuốc của các loài thực vật mang tính ý nghĩa khoa
học và thời sự [2].
Cây An xoa đã đƣợc nhắc đến trong danh mục Thực vật chí ở Việt Nam
và trên thế giới, dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau nhƣ cảm cúm, sởi, ung
nhọt, kiết lỵ, trong đó có tác dụng với các bệnh về gan. Ở nƣớc ta, cây mọc
nhiều ở Bình Phƣớc, ven các sông suối, ngoài ra còn tìm thấy ở Lâm Đồng và
các tỉnh miền núi phía Bắc. Theo y học cổ truyền, từ xa xƣa, cây An xoa đƣợc
xem nhƣ là một bài thuốc gia truyền hỗ trợ điều trị xơ gan của ngƣời dân tộc
thiểu số Camphuchia. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học hoàn


2

chỉnh và tác dụng dƣợc lý của cây An Xoa ở Việt Nam và trên thế giới vẫn
còn rất hạn chế. Chính vì thế, chúng tôi đề xuất đề tài luận văn: “Phân tích
cấu trúc một số hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt
Nam bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại” với mục tiêu nghiên cứu
thành phần hóa học trong cây An xoa nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử
dụng cây thuốc một cách hợp lý và hiệu quả.
*Mục tiêu nghiên cứu:
Nghiên cứu thành phần hóa học của thân cây An xoa (Helicteres
hirsuta L.) thu hái ở Việt Nam
*Nội dung nghiên cứu:
- Thu hái mẫu cây An xoa tại Thừa Thiên, Huế.
- Phân lập các hợp chất tử thân cây An xoa bằng các phƣơng pháp sắc ký.
- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng
pháp phổ hiện đại: MS, 1D, 2D-NMR.



rằng dịch chiết của loài H. isora có hoạt tính chống tiểu đƣờng, giảm mỡ máu


4

[4-6]; dịch chiết của H. hirsuta có hoạt tính độc tế bào [7] và dịch chiết của H.
gardneriana thể hiện hoạt tính kháng ký sinh trùng gây bệnh sốt rét,
leishmania…[8].
Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài Helicteres đã chỉ ra đƣợc
việc phân lập các hợp chất: triterpenoid, flavonoid, lignan, neolignan và các
dẫn xuất của axit rosmarinic.
1.2.1. Các triterpenoid
Từ rễ của loài H. angustifolia. Các nhà khoa học Đài Loan [9] đã tách và
định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC ba triterpenoid có khung lupan đó là:
3β-acetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester (1), 3βacetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid (2) và 3β-acetoxy-27- (phydroxyl) benzoyloxylup -20(29)-en-28-oic acid methyl ester (3).
Tiếp theo nghiên cứu trên, vào năm 2008, khi nghiên cứu rễ của loài H.
angustifolia, nhóm tác giả Min-Hsiung Pan và cộng sự [10] đã công bố các
kết quả phân lập, và xác định cấu trúc của 3 triterpen mới đó là 3β-acetoxy27-[(E)-cinamoyloxy]lup-20(29)-en-28-oic acid methyl este (4), 3β-acetoxy27-[4-hydroxybezoyl)oxy]lup-20(29)-en-28-oic acid (5), 3β-acetoxy-27-[(4hydroxybezoyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid methyl este (6), cùng với 8
triterpen có cấu trúc đã biết là 3β-acetoxy-27-(benzoyloxy)_olean-12-en-28oic acid methyl este (7), cylicodiscic acid (3β,27-dihydroxylup-20(29)-en-28oic acid) (8), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulinic acid (9), pyracrenic acid (3βO-(trans-caffeoyl)_betulinic acid) (10), 3β-O-(trans-feruloyl)betulinic acid
(11), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulin (12), 3β-O-(cis-coumaroyl)_betulin
(13), 3β-O-(trans-caffeoyl)_betulin (14), và 3β-O-(trans-feruloyl)_betulin
(15).
Ngoài ra, một số triterpenoid có khung lupan cũng đƣợc công bố bởi
các nhóm tác giả khác nhau khi nghiên cứu loài H. angustifolia nhƣ 3βacetoxylup-20 (29)-en-28-ol (16) [10], 3β-hydroxylup-20(29)-en-28-oic acid
3-caffeate (17) [12], axit betulinic (18).


5

Hình 1.1: Một số triterpenoid phân lập từ chi Dó Helicteres

8

1.2.2. Các coumarin
Từ rễ loài H. angustifolia, nhóm tác giả Wenliang Chen và cộng sự đã
phân lập đƣợc một coumarin mới có tên là 6,7,9α-trihydroxy-3,8,11αtrimethylcyclohexo-[d,e]-coumarin (28) [15]. Cũng từ loài H. angustifolia,
Wang và cộng sự [17] đã phân lập ra một hợp chất coumarin mới và đặt tên là
heliclacton (29)

Hình 1.3: Một số coumarin phân lập từ chi Dó Helicteres
Ngoải ra, chi Helicteres còn có chứa các hợp chất khác nhƣ
sesquiterpenoid quinon [19, 20], lignan [21], neolignan [22, 23], acid
rosmarinic [24] và flavonoid [25,26].
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO
(STERCULIACEAE)
Cây An xoa (hay còn gọi là Dó lông, Tổ kén cái) có tên khoa học là
Helicteres hirsuta Loureiro thuộc Họ Trôm Sterculiaceae. An xoa là cây bụi,
cao khoảng 1-3m, nhánh hình trụ, có lông. Lá hình trái xoan, dài 5-17cm,
rộng 2,5-7,5cm. Gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn. Mép có răng
không đều. Mặt dƣới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao; gân gốc 5,
cuống lá dài 0,8-4cm, lá kèm hình dải, có lông, dễ rụng. Cụm hoa là những
bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá. Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có
khớp và có lá bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5
răng. Cánh hoa 5, cuống bộ nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị, bầu có
nhiều gợn, chứa 25-30 noãn trong mỗi lá noãn. Quả nang hình trụ nhọn, hạt
nhiều, hình lăng trụ. Ra hoa kết quả từ tháng 7 đến tháng 11 [27].


9

Hình 1.4: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.)

Kiên Giang: lupeol (36), stigmasterol (37), tiliroside (38) và apigenin (39), kết
quả thử nghiệm gây độc tế bào cho thấy: cao chiết PE và cao chiết
dichloromethane (DC) có hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ gan HepG 2 với IC50
lần lƣợt là 28,29 và 30,30 µg/ml [33].

Hình 1.6: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu
hái ở Kiên Giang (Hữu Duyên, 2016)
Ngoài ra, nhóm tác giả Ngọc Quang (2018) đã phân lập đƣợc 12 hợp
chất từ loài An xoa H.hirsuta thu hái ở Bình Phƣớc bao gồm: 3-Otranscaffeoylbetulinic acid (40), 3b-benzoylbetulinic acid (41), betulinic acid
methyl
ester
(42),
betulinic
acid
(43),
lupeol
(44),
4-hydroxybenzoic acid (45), 3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester


11

(46), 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid (47), 5,8-dihydroxy-7,40dimethoxyflavone
(48),
isoscutellarein
4’-methyl
ether
8-O-bDglucopyranoside (49), methyl caffeate (50) and stigmasterol (51) [34].

Hình 1.7: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu

dung môi thu đƣợc cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dƣợc liệu. Khi
cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa
lẫn với nƣớc và có độ phân cực từ yếu đến mạnh. Ví dụ dãy dung môi: ether
dầu, ether, chloroform, ethyl axetate, n-buthanol.
Về cách chiết có hai cách chiết:
Chiết ngâm lạnh: là phƣơng pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ
xƣa. Sau khi chuẩn bị dƣợc liệu, tiến hành đổ dung môi ngập dƣợc liệu
trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết.
Để tăng cƣờng hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút
dịch chiết ở dƣới rồi đổ lên trên. Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần.
Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý
một cách mãnh liệt- gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất
-


13

cần chiết xuất. Phƣơng pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phƣơng
pháp chiết xuất bằng ngâm lạnh nhƣng có nhƣợc điểm là chỉ áp dụng đƣợc
với quy mô nhỏ.
1.4.2. Các phƣơng pháp sắc ký
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dƣợc liệu vì đơn
giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao.
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh
là chất hấp phụ đƣợc lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, đƣợc trải mỏng
đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một
hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định
tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu

dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để
giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bình triển
khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín
bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy đến đƣờng giới hạn,
lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết.

Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bƣớc sóng
254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là
Ce(SO4)2).

Hình 1.9: Các bƣớc tiến hành sắc ký bản mỏng
Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254,
kích thƣớc 20×20 cm, dày 0,2 mm.


Phương pháp sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất
hấp phụ pha tĩnh đƣợc nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà
có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh.
Giống nhƣ sắc ký lớp mỏng, phƣơng pháp này cũng dựa vào độ phân
cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi
cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong


15

quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc
phân bố tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột.


16

cả các thông tin cấu trúc từ các nguồn trên. Hiện nay, các phƣơng pháp phân
tích cấu trúc hiện đại đã đƣợc sử dụng để xác định cấu trúc gồm có: các
phƣơng pháp phổ hấp thụ nhƣ phổ tử ngoại (UV)/khả kiến (Vis) và phổ hồng
ngoại (IR), các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lƣợng (MS).
Ngoài ra, sự phát triển và ứng dụng các phƣơng pháp “ghép-nối" giữa sắc kí
lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các phƣơng pháp khác nhƣ HPLC-MS,
HPLC-NMR,… đã làm tăng tốc độ và độ nhạy của các phƣơng pháp xác định
cấu trúc.
Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là
kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phƣơng pháp phổ hiện
đại. Tuy nhiên, phƣơng pháp phổ biến nhất là các phƣơng pháp đo phổ: phổ
hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1 chiều và 2
chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC…).
1.4.3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared
Spectroscopy)
Phƣơng pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ
thuật phân tích rất hiệu quả, cung cấp thông tin nhanh về cấu trúc phân tử mà
không đòi hỏi các phƣơng pháp tính toán phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên
nguyên lí là các phân tử khác nhau sẽ hấp thụ ở các vùng bức xạ khác nhau.
Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử ở trạng thái kích thích sẽ
dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ
hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng
ngoại tƣơng ứng với các nhóm chức đặc trƣng và các liên kết có trong phân
tử.
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong
vùng từ 10000 đến 100 cm-1 và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử.
Sự biến đổi năng lƣợng dao động này luôn đi kèm với sự biến đổi năng lƣợng
quay. Sự hấp thụ này có định lƣợng và biểu hiện thành các dải hấp thụ với