ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ THU HẰNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT
TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA)
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ THU HẰNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT
TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA)
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thu Hà


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................a
MỤC LỤC ........................................................................................................ b
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ......................................................... d
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... f
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... g
DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................. h

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Sơ lược về họ Đậu (Fabaceae), Chi Đậu (Vigna) và loài đỗ xanh
(Vigna radiata) .............................................................................................. 3
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học .......................................................................................... 4
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................... 4
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.................................................... 7
1.3. Hợp chất Flavonoid................................................................................ 8
1.3.1. Phân loại .......................................................................................... 8
1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng.................................... 12
1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid ......................................... 14
1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid .................................... 15
1.4. Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các
hợp chất tự nhiên ......................................................................................... 20
1.4.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và

13

C-


PHỤ LỤC ......................................................................................................... 1

c


DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
Kí hiệu/
Tên tiếng anh

Tên tiếng việt

Từ viết tắt
NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân

1

Nuclear Magnetic Resonance-1H

Phổ cộng hưởng từ
proton

Nuclear Magnetic Resonance-1H

Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân 13C

Phổ tương tác trực
tiếp H-C

ESI-MS

Electron Inoniziation-Mass Spectroscopy

Phổ
khối
phun
sương mù điện tử

IR

Infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại

MS

Mass Spectroscopy

Phổ khối lượng

đnc

by

Phổ DEPT



Ethanol

MeOH

Methanol

Methanol
Độ chuyển dịch hóa
học của proton và
cacbon

δH, δC

ppm

Part per million

Phần triệu

s: singlet
dd: doublet of doublets
d: doublet
dt: doublet of triplets
t: triplet
dq: doublet of quartets
q: quartet

e


Hình 3.18.
Hình 3.19.
Hình 3.20.
Hình 3.21.
Hình 3.22.
Hình 3.23.
Hình 3.24.

Cây Đậu xanh (Vigna radiata) ..................................................... 3
Một số hợp chất flavonoid phân lập từ hạt Đậu xanh
(Vignaradiata) .............................................................................. 7
Phổ ESI-MS của hợp chất MB1 ................................................. 32
Phổ 1H-NMR của hợp chất MB1 ................................................ 33
Phổ DEPT của hợp chất MB1..................................................... 33
Phổ HSQC của hợp chất MB1 .................................................... 35
Phổ HMBC của hợp chất MB1 ................................................... 36
Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC
của chất vitexin ........................................................................... 36
Phổ ESI-MS của hợp chất MB2 ................................................. 37
Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB2................................ 38
Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB2 ............. 39
Phổ 13C-NMR của hợp chất MB2 ............................................... 40
Công thức cấu tạo của hợp chất isovitexin ................................. 40
Phổ ESI-MS của hợp chất MB3 ................................................. 41
Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB3................................ 42
Phổ 13C-NMR của hợp chất MB3 ............................................... 42
Công thức cấu tạo của hợp chất luteolin..................................... 43
Phổ ESI-MS của hợp chất MB4 ................................................. 43
Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB4................................ 44
Phổ 13C-NMR của hợp chất MB4 ............................................... 45

quan tâm chính là những tác dụng phụ và độc tính kèm theo, đặc biệt trong
trường hợp điều trị lâu dài đối với các bệnh mãn tính. Vì vậy ngày nay người
ta có xu hướng trở về với tự nhiên.
Do Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và
ẩm, được thiên nhiên ưu đãi nên nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho
sự phát triển của các chủng loại cây cỏ có thảm thực vật phong phú và đa
dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, không ít loại
cây được sử dụng làm thuốc rất hiệu quả, theo nghiên cứu có khoảng gần
4.000 loài được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền. Nước ta có nền Y
học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử,
nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời kỳ đó. Có những
loại dược liệu thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian, nhưng lại được
các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị liệu không thua kém gì so với
các loại thuốc tân dược hiện nay. Chính vì thế việc nghiên cứu để khai thác,
kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là
vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta.

1


Cây Đậu xanh (Vigna radiata) là cây thực phẩm quan trọng thứ 3, sau
cây Đậu tương và cây Lạc. Ngày càng nhiều các nghiên cứu khoa học cho
thấy tác dụng tích cực của hạt Đậu xanh đối với sức khỏe con người. Các
nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy các hợp chất chính hạt Đậu xanh
chứa chủ yếu các hợp chất flavonoid, với nhiều hoạt tính sinh học quí như
chống oxy hóa, kháng viêm, chống miễn dịch, chống dị ứng, ngăn ngừa sinh
tổng hợp và hấp thu cholesterol. Do vậy, sự lựa chọn vỏ của hạt đậu xanh làm
đối tượng nghiên cứu của đề tài “PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP
CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA
RADIATA) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI” được đặt

nách lá. Hoa màu vàng lục. Quả đậu hình trụ mảnh, có lông, chứa nhiều hạt nhỏ
hình trụ ngắn, gần hình cầu, thường có màu xanh. Hoa tháng 8 - 10; quả tháng 311. Bộ phận thường dùng là hạt, hay còn gọi là Lục dâu đậu xanh [2].

Hình 1.1: Cây Đậu xanh (Vigna radiata)
Nơi sống và thu hái: Cây của vùng nhiệt đới, được trồng rộng rãi ở
đồng bằng và vùng núi. Ở Việt Nam đậu xanh là loại đậu thường được sử
dụng để làm xôi, làm các loại bánh ngọt, bánh đậu xanh, chè, hoặc được ủ cho
lên mầm thành giá đỗ để làm thức ăn.
3


Tính vị, tác dụng: Đậu xanh có thành phần dinh dưỡng cao, hạt chứa
nước 14%; protid 23,4%, lipid 2,4%, glucid 53,10%, cellulose 4,7%. Còn có
các nguyên tố vi lượng Ca, P, Fe và các vitamin (tiền sinh tố A, B1, B2, PP,C).
Còn có phosphatidyl choline, phosphatidylethanolamine, phosphtidylinositol,
phosphatidylserine; phosphatidicacid.
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học
Đậu xanh (Vigna radiata) là cây thực phẩm quan trọng thứ 3, sau cây
Đậu tương và cây Lạc. Ngày càng nhiều các nghiên cứu khoa học cho thấy
tác dụng tích cực của hạt Đậu xanh đối với sức khỏe con người. Cây Đậu
xanh là một vị thuốc quý giá mà thiên nhiên ban tặng và được mệnh danh là
“Thực phẩm của tương lai”.
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Loài đậu xanh (Vigna radiata) có nguồn gốc ở Ấn Độ và Trung Á, từ
đó lan sang nhiều khu vực khác của châu Á và trên thế giới. Cây đậu xanh có
khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với các vùng có
điều kiện khắc nghiệt. Ở châu Á cây đậu xanh được trồng nhiều ở các quốc
gia như: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal, Trung Quốc,
Mianma, Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, Lào, Philippines, Malaysia và

hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết
này trên hệ DPPH và 2,2'-azino-di- (3-etyl-2,3-dihydrobenzthiazoline -6sulfonate) (ABTS) lần lượt là 11,33 ± 0,24 và 36,65 ± 0,63 mmol/g [5]. Các
nhà khoa học đã chứng minh khả năng bắt giữ gốc tự do của 100 g đậu xanh
tương đương với 36,3 g trà xanh khô và 1462 mg vitamin C. Hoạt chất
Vitexin ức chế khoảng 60% gốc tự do DPPH ở 100 mg/mL và ngăn chặn hiệu
quả các tế bào da chết do tia UV gây ra [6].

5


Trên mô hình tăng lipid máu, thỏ thử nghiệm được cho ăn một hỗn hợp
70% bột đậu xanh và mầm đậu xanh và kết quả làm giảm triệu chứng của
bệnh động mạch vành [7]. Khi nghiên cứu trên chuột khỏe mạnh được ăn dịch
chiết đậu xanh trong 7 ngày, hàm lượng cholesterol tổng số đã giảm đáng kể.
Tác dụng này được cho là do thành phần phytosterol của đậu xanh, chúng có
khả năng ngăn ngừa sinh tổng hợp và hấp thu cholesterol [8].
Ở liều 600 mg peptide/kg thể trọng, sau khi chuột được tiêm dịch chiết
mầm va hạt đậu xanh từ 3-9 giờ đã làm giảm đáng kể huyết áp tâm thu và
duy trì trong thời gian thử nghiệm từ tuần 1-4 [9].
Tác giả Yao Y và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu năm 2008 về tác
dụng điều trị của dịch chiết mầm và vỏ hạt đậu xanh trên 2 loại chuột bị tiểu
đường. Các lô chuột được uống trong 5 tuần với nồng độ dịch chiết mầm đậu
xanh là 2 g/kg và vỏ hạt đậu xanh là 3 g/kg thể trọng. Kết quả cho thấy có sự
giảm lượng glucose, cholesterol tổng số, triglycerides và urê máu, đồng thời
nồng độ của insulin ở cả 2 lô chuột còn cải thiện rõ rệt [10].
Đậu xanh được chứng minh có khả năng chống tăng sinh tế bào qua thử
nghiệm MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]
trên dòng tế bào ung thư biểu mô (CAL27) và một số dòng tế bào ung thư
khác như DU145, SK-OV-3, MCF-7, và HL-60) [11]. Ở nồng độ 10 mmol/L
và sau 72 giờ, trypsin phân lập từ hạt đậu xanh có khả năng làm giảm xấp xỉ

danh Y Tuệ Tĩnh viết: “Đậu xanh không độc, thanh nhiệt, có thể làm sạch mát
nước tiểu, chữa lở loét, làm sáng mắt, trị được nhiều bệnh”… Đề cập đến tác
dụng chữa bệnh của đậu xanh, đặc biệt là vấn đề giải độc, sách "Bản thảo
cương mục" của Lý Thời Trân (đời Minh) có ghi nếu ăn uống bị ngộ độc,
buồn bực trong người, có thể dùng đậu xanh để chữa trị. Loại thực phẩm này
có tác dụng giải độc khi uống nhầm thuốc (thủy ngân, thạch tín...); uống thuốc
quá liều (ô đầu, phụ tử…); giải độc do ngộ độc thức ăn, ngộ độc sắn, nấm...
Các nghiên cứu về vỏ hạt đậu xanh ở nước ta cho đến nay cũng không
có nhiều. Năm 1996, nhóm nghiên cứu của Trần Lê Vân Hiền và cộng sự đã
công bố thành phần hóa học của chủ yếu trong vỏ hạt đậu xanh là flavonoid,
chủ yếu là vitexin và isovitexin có tác dụng bảo vệ cơ thể chống phóng xạ,
chống đột biến nhiễm sắc thể, ức chế rõ các phản ứng peroxide hóa trong cơ
thể. Trong một nghiên cứu khác, tác giả Nguyễn Thị Hương cũng đã phân lập
được hai hoạt chất
vitexin và isovitexin từ vỏ của loài đậu này [18].
1.3. Hợp chất Flavonoid [19]
1.3.1. Phân loại
Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực
vật, có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa
(màu vàng trong hoa hòe...).Về cấu trúc hoá học Flavonoid có khung cơ bản
là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon,
cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở.

Trong đa số trường hợp thì mạch 3 cacbon đóng vòng với vòng A và
tạo nên 1 dị vòng có oxy (vòng C). Tuỳ theo vị trí gắn của vòng bezen B vào
dị vòng ở C2 hoặc C3, ta có các hợp chất Flavonoid có nhân Flavan hay
8


Isoflavan. Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxyl tự do hoặc đã


10


1.3.1.3. Neoflavonoid
Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật.
4-arylchroman
Ví dụ chất brasilin có trong cây tô mộc - Caesalpinia sappan
O

O

OH

OH

OH
OH
Brasilin

4-aril croman

4-aryl coumarin
Ví dụ calophyllolid trong cây mù u - Calophyllum inophyllum.

1.3.1.4. Biflavonoid và triflavonoid
Những flavonoid dimer và trimer đã có nói đến trong phần flavan-3-ol
và flavan 3,4 diol. Những hợp chất đó được gọi là proanthocyanidin. Ở đây là
những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol, chalcon,
dihydro chalcon, auron, isoflavon. Biflavon cấu trúc gồm 2 đơn vị flavon

flavonoid glycosid và aglycon của chúng, Bryant đem lắc dung dịch có màu
với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycon,
nếu lớp octanol không màu, chất thử là glycosid.

12


- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm
Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành
muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc
kiềm. Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid. Nếu tiến hành trong ống
nghiệm, chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì
acetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm dihydroxyphenol.
- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni
Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với
muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ.

1.3.2.2. Định lượng
Tuỳ vào từng loại Flavonoid mà ta có phương pháp định lượng cụ thể
khác nhau.
 Flavon hoặc flavonol
+ Phương pháp cân: ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavon hoặc
flavonol và dịch chất ít tạp chất.
+ Đo màu: bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối
diazoni, tạo phức màu với AlCl3, Muối titan, chrom…
+ Phương pháp đo phổ tử ngoại.
 Chalcon
 Phương pháp phân tích HPLC (sắc kí lỏng cao áp). Với pha động
là dung dịch acetonitrile và acid H 3PO4 1% (phương pháp chuẩn trong
phân tích).

+ Dựa vào khả năng phản ứng ghép đôi với hợp chất diazo trong môi
trường acid tạo thành hợp chất có màu vàng đặc trưng.
+ Lắc đều, để yên dung dịch trong 1 giờ, sau đó đem đo độ hấp thu.
 HCl: Tạo thành hợp chất có màu đỏ: Phương pháp Vanillin
1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid
Không có phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng
rất khác nhau về độ tan trong nước và các dung môi hữu cơ. Các flavonoid
glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon
dễ tan trong dung môi kém phân cực. Các dẫn chất flavon, flavonol có OH tự
do ở vị trí 7 hòa tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết.
Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất
thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hay
etanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các
flavonoid.
Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết
tủa.sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid

thì

flavonoid được giải phóng. Để phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng

14


phương pháp sắc ký cột.chất hấp phụ thông dụng nhất là polyamid. Có thể
dùng celluose, silicagel. Silicagel dùng để tách các chất flavanon, isoflavon,
flavonol. Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần .
1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid
1.3.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa [20-22]
Quá trình oxi hóa khử là quá trình quan trọng và phổ biến trong mọi cơ