ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HUYỀN

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN HỒNG
(NELUMBO NUCIFERA GAERTN.) BẰNG CÁC
PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HUYỀN

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN HỒNG
(NELUMBO NUCIFERA GAERTN.) BẰNG CÁC
PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ THU HÀ


DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... f
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .........................................................................................g
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Giới thiệu về họ Sen (Nelumbonaceae), chi sen (Nelumbo), và loài Sen
hồng (Nelumbo nucifera gaertn.) ................................................................................3
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt
tính sinh học của cây Sen hồng (Nelumbo Nucifera gaertn.) .....................................4

1.2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước ...................................... 4
1.2.2. Tổng quan tính hình nghiên cứu trong nước....................................... 7
1.3. Hợp chất Flavonoid ..............................................................................................8

1.3.1. Phân loại .............................................................................................. 8
1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng flavonoid ....................... 11
1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid ............................................. 13
1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid ........................................ 14
1.4. Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất
tự nhiên ......................................................................................................................19

1.4.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR. .... 19
1.4.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .................................................. 20
1.4.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) .................................................... 21
Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................23
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................23

2.1.1. Đối tượng .......................................................................................... 23
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................ 23
b


Từ viết tắt

Tên tiếng anh

Tên tiếng việt

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân

1

H-NMR

13

C-NMR
DEPT

COSY
HMBC
HSQC
ESI-MS
IR
MS
đnc
TLC

d: doublet
t: triplet
q: quartet

Phổ cộng hưởng từ proton
Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân 13C
Phổ DEPT
Phổ COSY
Phổ tương tác di hạt nhân
qua nhiều liên kết
Phổ tương tác trực tiếp HC
Phổ khối phun sương mù
điện tử
Phổ hồng ngoại
Phổ khối lượng
Điểm nóng chảy
Sắc ký bản lớp mỏng
Ethyl acetat
Ethanol
Methanol
Độ chuyển dịch hóa học
của proton và cacbon
Phần triệu

dd: doublet of doublets
dt: doublet of triplets
dq: doublet of quartets

d

Hình 3.25. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất NN6 ................................... 48
Hình 3.26. Phổ 13C-NMR của hợp chất NN6 ................................................... 48
Hình 3.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide ... 50

e


Hình 3.28. Các hợp chất phân lập được từ dịch chiết EtOAc lá sen hồngNelumbo
nucifera ........................................................................................... 50

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN1 ............................32
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN2 ............................37
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN4 ............................42
Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN6 ............................49

f


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Sen hồng Nelumbo nucifera .............................24
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của lá Sen hồng ...................26

g


DANH MỤC PHỤ LỤC
PL1.Phổ ESI-MS của hợp chất catechin (NN1): C15H14O6 ........................................1
PL2.Phổ IR của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6.................................................2
PL3. Phổ1H-NMR của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6 ......................................3

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm,
được thiên nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng
hơn 14.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, có khoảng 4000 loài được sử dụng
làm thuốc trong y học cổ truyền.Nước ta có nền Y học cổ truyền hết sức đa
dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng
không ngừng phát triển qua các thời kì đó. Nhiều bài thuốc, vị thuốc có tác
dụng tốt trên lâm sàng nhưng chưa được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học,
tác dụng dược lí và độc tính. Nghiên cứu để khai thác, kế thừa, ứng dụng và
phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa
học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta.
Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, và rất
nhiều các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra, được nghiên cứu để phục vụ
trong y học.Các hợp chất thiên nhiên giữ vai trò chính trong việc phát hiện và
phát triển các dược phẩm mới. Ngoài ra hàng trăm cây thuốc đã được khoa học
y - dược chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Nhiều loại thuốc được
chiết xuất từ dược liệu Việt Nam được sử dụng rộng rãi trong nước và xuất
khẩu.Xu hướng đi sâu nghiên cứu các dược liệu trong Y học cổ truyền và tìm
kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc ngày càng
được thế giới quan tâm.
Việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên và các sản phẩm có nguồn gốc
thiên nhiên làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan
tâm của các nhà khoa học cũng như cộng đồng bởi ưu điểm của chúng là độc
tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm
tổng hợp.
Sự lựa chọn cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) làm đối tượng
nghiên cứu của đề tài dựa vào kinh nghiệm sử dụng của nền Y học cổ truyền
dân tộc cũng như các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, với mục

1


Cây Sen hồng có tên khoa học Nelumbo nucifera, thuộc chi Sen
(Nelumbo), họ Sen (Nelumbonaceae). Sen hồng được coi là loài hoa thần thánh
và đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động tín ngưỡng.
Cây mọc ở nước, có thân rễ hình trụ (ngó sen), từ đó mọc lên những lá
có cướng dài.Hoa to, màu trắng hay đỏ hồng, có nhiều nhị (tua sen) và những
lá noãn rời; các lá noãn này về sau thành quả gắn trên một đế hoa hình nón
ngược (gương sen).Mỗi quả chứa một hạt, trong hạt có chồi mầm (tâm sen)
gồm 4 lá non gập vào trong [2].

Hình 1.1: Cây Sen hồng(Nelumbo nuciferaGaertn.)
3


Trong thế giới thảo dược, ít có loài thực vật nào mà các bộ phận đều là
những vị thuốc quý như cây Sen hồng. Trong Y học cổ truyền nhiều nước trên
thế giới, N. nucifera được dùng để chữa trị bệnh mất ngủ, hôi miệng, rong kinh,
bệnh ngoài ra, nhiễm trùng, béo phì, rối loạn thần kinh, các bệnh tim mạch, và
có công dụng như một loại thuốc bổ, giải độc và lợi tiểu. Theo Đông y, nước
sắc từ lá Sen được sử dụng để chữa nhiều loại bệnh như tiêu chảy, say nắng,
làm mát máu, lợi tiểu, hạ sốt, nôn ra máu, chảy máu cam, băng huyết, điều trị
bệnh phong, bệnh ngoài da, mệt mỏi thần kinh và béo phì [3].
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của cây Sen hồng (Nelumbo Nucifera gaertn.)
Do có lịch sử sử dụng lâu đời, nên cây Sen hồng được rất nhiều các nhà
khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như
hoạt tính sinh học, đặc biệt là lá sen.
1.2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước
Phân tích thành phần hóa học, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều lớp
chất có trong các bộ phận khác nhau của cây Sen như alkaloids, flavonoid,
glycosides. Chúng bao gồm nuciferine, roemerine, anonaine, pronuciferine, Nnornuciferine, (+) - 1 (R) -coclaurine , (-) - 1 (S) -norcoclaurine, liriodenine , Nmethyl-coclaurine , Dehydroemerine, dehydronuciferine, dehydroanonaine, Nmethylisococlaurine,

ngăn ngừa sự gia tăng trọng lượng cơ thể, trọng lượng mô mỡ và mức
triacylglycerol ở gan [6].
Theo tác giả Onishi E, dịch chiết nước của lá sen được nghiên cứu tác
dụng hạ lipid huyết thanh trên chuột. Chuột được cho ăn một chế độ ăn giàu
chất béo có chứa 1,5% cholesterol và 1% acid cholic, sau đó được uống dịch
chiết nước lá sen. Kết quả cho thấy có sự giảm mạnh cholesterol tổng số,
cholesterol tự do và các phospholipid so với lô đối chứng [7].
Nghiên cứu tác giả Wu và cộng sự cho thấy dịch chiết methanol từ lá sen
có hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng [8]. Trong một nghiên cứu khác của Lee
và cộng sự, dịch chiết lá sen có chứa rutin (11.331,3 ± 4.5 mg), catechin
(10,853.8 ± 5,8 mg), acid sinapic (1,961,3 ± 5,6 mg), axit chlorogenic (631,9 ±
2,3 mg), axit syringic (512,3 ± 2,5 mg) và quercetin (415,0 ± 2,1 mg) được
đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan. Kết quả thử nghiệm cho
thấydich chiết này có khả năng loại bỏ gốc tự do tạo bởi hệ DPPH và ABTS
với giá trị IC50từ 4,46 μg/mL đến 5,35 μg/mL. Dịch chiết còn có tác dụng bảo
vệ tế bào gan và sự perox hoá lipid trong màng tế bào [9].
Một số alkaloid như asimilobine và lirinidine đóng vai trò như chất ức
chế sự điều khiển co cơ,gây ra các cơn co thắt ở thỏ thực nghiệm [10];
nelumbine có hoạt tính như một chất gây độc cho tim mạch [11].
Các bộ phận khác của cây như thân, hoa và hạt sen cũng chứa hoạt chất
thuộc nhiều lớp chất như alkaloids, flavonoid, glycosides, triterpenoid, các
vitamin, khoáng chất với hoạt tính chống đông máu, hoạt tính bảo vệ gan, chống
oxy hóa, chống xơ hóa, chống tăng sinh, chống loạn nhịp tim, chống virus,
kháng khuẩn, kháng viêm [12]…
Như vậy, có thể cho rằng, tác dụng dược lý đa dạng của Sen hồng là do
sự có mặt của nhiều lớp hoạt chất trong cây và cần phải có các nghiên cứu sâu
hơn để chứng minh khả năng chữa bệnh của loài thảo dược này.

6


7


1.3. Hợp chất Flavonoid [15]
1.3.1. Phân loại
Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật,
có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa.Về
cấu trúc hoá học Flavonoid có khung cơ bản là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A
và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở.

Trong đa số trường hợp thì mạch 3 cacbon đóng vòng với vòng A và tạo
nên 1 dị vòng có oxy (vòng C). Tuỳ theo vị trí gắn của vòng bezen B vào dị
vòng ở C2 hoặc C3, ta có các hợp chất Flavonoid có nhân Flavan hay Isoflavan.
Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxyl tự do hoặc đã thay thế
một phần, vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính axit.
Trong thực vật, Flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do
(aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycozit). Trong đó, dạng aglycol thường
tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan
trong nước, còn dạng glycozit thì tan trong nước nhưng không tan trong các
dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform.
Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6 đều có 2 vòng thơm. Tuỳ thuộc vào
cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các
nhóm sau:
 Eucoflavonoid: Flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon,
antocyanin, anthocyanidin.
 Isoflavonoid: isolavon, isoflavanon, rotenoid.
 Neoflavonoid: calophylloid.
 Biflavonoid và triflavonoid.
1.3.1.1. Eucoflavonoid


OH
Brasilin
1.3.1.4. Biflavonoid và triflavonoid
Những flavonoid dimer và trimer đã có nói đến trong phần flavan-3-ol
và flavan 3,4 diol. Những hợp chất đó được gọi là proanthocyanidin.Ở đây là

10


những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol, chalcon,
dihydro chalcon, auron, isoflavon. Biflavon cấu trúc gồm 2 đơn vị flavon được
biết trước tiên. Chất điển hình là amentoflavon tạo thành từ 2 phân tử apigenin
nối theo dây nối carbon-carbon ở vị trí 3', 8''.
1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng flavonoid
1.3.2.1. Định tính
Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)
- Tác dụng của FeCl3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị
trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu.
- Tác dụng của kiềm. Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát
cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có
màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid.
Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương.
Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam.Một số nhóm khác như flavan-3ol, flavanon, isoflavon màu không thay đổi. Tuy nhiên nếu thực hiện trong ống
nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu vì dễ
bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành chalcon nên nếu để một lúc lại
cho màu vàng đậm đến đỏ.
- Tác dụng của H2SO4 đậm đặc: Axit H2SO4 khi nhỏ lên các dẫn chất
flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm. Đối với chalcon và auron cho màu đỏ,
đỏ thắm, đỏ tươi.Flavanon cho màu đỏ cam rồi đỏ thắm, có thể do chuyển
flavanon thành chalcon.

+ Đo màu: bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni,
tạo phức màu với AlCl3, Muối titan, chrom…
+ Phương pháp đo phổ tử ngoại.

12


 Chalcon
 Phương pháp phân tích HPLC (sắc kí lỏng cao áp). Với pha động là dung
dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% (phương pháp chuản trong phân tích).
 Phương pháp so màu: có nhiều phương pháp so màu khác.
 ciocalteu: (hỗn hợp muối phứcPhương pháp Folin polyphosphotungstate molydate).
+ Rất nhạy đối với chất khử, trong môi trường kiềm nhẹ thì sẽ bị khử
thành sản phẩm phức molydenium tungsten có màu xanh.
+ Sau đó đem đo độ hấp thu A (chalcon chỉ hấp thu mạnh ở 400 nm).
Phương pháp Prussian Blue:
+ Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN) 6 bị khử bởi các hợp chất
phenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) có màu xanh.
+ Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đó đem đo đọ hấp thu A.
 Phương pháp Diazotized
+ Dựa vào khả năng phản ứng ghép đôi với hợp chất diazo trong môi
trường acid tạo thành hợp chất có màu vàng đặc trưng.
+ Lắc đều, để yên dung dịch trong 1 giờ, sau đó đem đo độ hấp thu.
 HCl: Tạo thành hợp chất có màu đỏ: Phương pháp Vanillin
1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid
Không có phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng
rất khác nhau về độ tan trong nước và các dung môi hữu cơ. Các flavonoid
glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon
dễ tan trong dung môi kém phân cực. Các dẫn chất flavon, flavonol có OH
tự do ở vị trí 7 hòa tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết.

do hoạt động. Bên cạnh đó flavonoid có khả năng tạo phức với các ion kim loại
chuyển tiếp như Fe+2, Cu+2… để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenton
sinh ra các gốc hoạt động nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các
phản ứng oxy hóa. Các flavonoid có các nhóm hydroxyl ở vị trí 3, 5, 3', 4' có
khả năng liên kết tốt với các ion kim loại tạo phức oxycromon, oxycacbonyl
hoặc 3', 4' orthodioxyphenol.

14


Khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do của một số
flavonoid theo thứ tự: myricetin > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin
> naringenin > apigenin > catechin > 5,7 dihydroxy-3', 4', 5' trimethoxy flavon
> robinin > kaempferol > flavon.
1.3.4.2. Tác dụng đối với các bệnh về tim mạch [19-20]
Các flavonoid như catechin và leucoanthocyan rồi đến flavonol, flavanon
và một số chalcon… có thể có tác dụng làm bền thành mạch, làm tăng sức bền
và tính đàn hồi của thành mao mạch, chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm
sức thấm vào mao mạch, có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch, gây xuất huyết,
gây phù thũng máu.
Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch,
tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, các bệnh trong nhãn khoa như sung
huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc. Các dẫn chất anthocyanoside có tác
dụng tái tạo tế bào võng mạc và có tác dụng tăng thị lực.
Trên hệ tim mạch, nhiều Flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn
hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích
phút của tim.... Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và
hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng
lên các cấu trúc màng tế bào của nó, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức
năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch.