1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1953, hai nhà bác học James D. Watson và Francis H.C. Crick đã
phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA chính thức đánh dấu sự ra đời của
sinh học phân tử . Kỹ thuật sinh học phân tử là việc sử dụng các kỹ thuật gen
và kỹ thuật protein để xác định trình tự gen hay chuỗi acid amin của mỗi từng
gen khác nhau, cũng như lập bản đồ gen của từng khu vực nhất định trong bộ
gen của các loài sinh vật. Hiện nay, có nhiều phương pháp sinh học phân tử
ứng dụng cho từng loại bệnh lý khác nhau.giúp phát hiện các bệnh lý di
truyền. Trong lĩnh vực Y học và di truyền học kỹ thuật gen giúp con người
phát hiện được căn nguyên của một số bệnh nan y, chế tạo các loại thuốc mới
để điều trị bệnh. Đặc biệt, trong những năm gần đây, liệu pháp gen đã được
nghiên cứu và dần dần đưa vào ứng dụng để điều trị một số bệnh lý di truyền.
Di truyền Y học trong các năm qua đã phát triển rất nhanh cả về
chiều rộng lẫn chiều sâu, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử đã thâm
nhập vào hầu hết các chuyên ngành của y học và phát huy hiệu quả to lớn
trong chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh.
Từ những năm 1970, Shaffer và Weiss đã xác định glôcôm bẩm sinh
nguyên phát là một thể bệnh glôcôm di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể
thường phổ biến ở trẻ em . Các nghiên cứu đã chỉ ra protein CYP1B1 đóng
vai trò quan trọng nhất trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng
vùng bè, góc tiền phòng của nhãn cầu và đột biến gen này dẫn đến bệnh
glôcôm bẩm sinh nguyên phát . Trong 5 năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh
glôcôm bẩm sinh nguyên phát ở châu Á đã và đang tập trung đi sâu vào cơ
chế bệnh sinh ở mức độ phân tử, làm cơ sở cho việc triển khai chẩn đoán
trước sinh cũng như liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt
những người mang gen gây bệnh, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội.


2

cộng sự (1997) đã chỉ ra gen CYP1B1 có 3 exon và 2 intron, dài 12 kb, mã
hóa phân tử mRNA gồm 1.631 base. Cụ thể hơn nữa, các gen CYP1B1 nằm
từ cặp base số 38.067.602 đến 38.076.180 . Trong một loạt nghiên cứu về
nhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen CYP1B1 đã được xác định là GLC3A .

Hình 1. Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2
Năm 1998, Ivaylo Stoilov và cộng sự đã xây dựng mô hình ba chiều về
vùng C' tận (C-terminal) của protein CYP1B1. Cấu trúc này gồm bốn vùng I,
L, J và K cùng với vùng gắn heme mô tả 3 đột biến dẫn đến thiếu một sản
phẩm giữa axit amin 189 và 254 axit amin từ terminus C là Glu387, Arg390
và Cys470.

Hình 2. Hình ảnh không gian 3 chiều vùng C' tận của protein CYP1B1.


4

1.2.2. Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen CYP1B1

Gen CYP1B1 là một phân họ của cytochrome P450. Các cytochrome
của dòng P450 được biết đến chủ yếu với khả năng chuyển hóa các chất lạ
sinh học (xenobiotics) và có chức năng giống như bất kỳ phân tử men nào.
Các cytochrome tham gia vào các phản ứng oxy hóa như: sinh tổng hợp, sản
xuất hormon cần thiết hoặc đóng vai trò là các hợp chất trao đổi chất trung
gian trong hầu hết các sinh vật sống. Đột biến ảnh hưởng đến men thường tạo
ra các đột biến lặn. Đối với đột biến lặn dạng dị hợp tử, alen bình thường có
khả năng bù đắp chức năng cho alen bị đột biến. Từ quan điểm này, một kiểu
hình lặn như glôcôm bẩm sinh nguyên phát được gây ra bởi đột biến trong
một loại men như CYP1B1 là hợp lý.
Trong quá trình hình thành và phát triển nhãn cầu, chức năng của men


Thể hoang dại CYP1B1

Cơ chất

Hoạt hóa
hay
Bất hoạt

gắn heme

Đột biến
cắt cụt

Đột biến
vùng bản lề

Đột biến
vùng lõi

Hình 3. Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1

Có sự khác biệt về tác động của thể hoang dại và thể đột biến của phân
tử CYP1B1. Phân tử CYP1B1 thể hoang dại được neo trên màng của lưới nội
nguyên sinh. Chức năng bình thường của nó đòi hỏi sự tham gia của một số
đối tác oxy hóa khử P450 reductase. P450 reductase có khả năng đưa một
nguyên tử của phân tử oxy vào cơ chất của nó. Khi đó có 2 khả năng xảy ra:
(B) trường hợp cơ chất được hoạt hóa và tác động trên mục tiêu xuôi dòng
chưa được biết. Tuy nhiên, oxy phân tử có thể làm tăng khả năng ưa nước của
cơ chất và làm dễ dàng cho sự bài tiết và thanh lọc cơ chất từ trong tế bào.

- 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm
của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên
72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,
Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ


7

thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây
đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi ADN mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản
phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài là
khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được
xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi.
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn
DNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng
gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đã
nhân bản được thành 2n bản sao. Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách ra
khi điện di và có thể phát hiện được sau khi nhuộm và để có thể tạo dòng
hoặc giải trình tự. Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳ
sau lượng khuôn tăng nhưng lượng mồi và dNTP (deoxyribonucleoside
triphosphate) tự do giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần. Do đó,
cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản ứng PCR cho
kết quả tốt nhất .



phản ứng PCR khó thực hiện.
Enzym DNA polymerase
Là yếu tố đóng vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Enzym
thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase, được phân lập từ vi khuẩn
Thermus aquaticus sống ở nhiệt độ cao. Hàm lượng enzym ảnh hưởng rất lớn
đến hiệu quả PCR. Khi hàm lượng enzym quá ít, không đủ tạo sản phẩm PCR
cần thiết. Ngược lại, quá nhiều enzym, sẽ tạo ra các sản phẩm PCR không đặc
hiệu. Thông thường lượng enzym Taq polymerase cần cho mỗi phản ứng có
thể tích 25 μl là 0,5 U , .
Dung dịch đệm của phản ứng
Dung dịch đệm của phản ứng PCR cần đảm bảo các thành phần cần
thiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như MgCl 2, KCl, Tris-HCl,...
Trong đó, Mg2+ là thành phần ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng
PCR do ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch
khuôn. Nồng độ Mg2+ thường là 1-5mM .
2.1.3. Phương pháp PCR thường được sử dụng phát hiện đột biến gen CYP1B1
gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát - PCR đơn mồi (monoplex PCR)

Là PCR kinh điển nhất, trong mỗi phản ứng PCR, chỉ sử dụng duy nhất
một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA
của tế bào .


10

Các tác giả đã sử dụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của gen
CYP1B1 bằng phản ứng PCR, sau đó điện di trên gel agarose, mẫu bệnh nhân
được tiến hành song song với mẫu đối chứng. Nếu mẫu đối chứng xuất hiện
vạch DNA tương ứng với kích thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫu
bệnh nhân không xuất hiện vạch thì bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon đó.

3’ hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi (hình 8.A). Tuy nhiên, nếu một
ddNTP được gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ
dừng lại do không hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotid tiếp theo
(hình 8.B).


12

Hình 8. Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A) và tổng hợp DNA bị ức chế (B)

Quy trình giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid gồm các bước:

Hình 9. Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP

(a). Đoạn DNA cần giải trình tự được đưa vào vector tách dòng (thường
là plasmid), vector mang đoạn DNA này được biến nạp vào tế bào E.coli để


13

chọn lọc và nhân dòng. Sau đó tiến hành tách chiết DNA plasmid.
(b). Sử dụng một đoạn mồi bổ sung với trình tự của vector và gắn vào
đầu 3’ của vector gần vị trí chèn DNA.
(c). Phản ứng được tiến hành trong 4 ống nghiệm, mỗi ống được cung
cấp thêm DNA polymerase, 4 loại dNTP tự do ( một trong bốn loại dNTP này
được đánh dấu phóng xạ) và một trong bốn dideoxynucleic (ddATP, ddCTP,
ddGTP, ddTTP). Nồng độ của mỗi ddNTP được điều chỉnh thận trọng, thường
chỉ dùng một lượng nhỏ, khoảng 1%.
Trong quá trình tổng hợp chuỗi, enzym DNA polymerase sẽ gắn các
dNTP vào để kéo dài chuỗi. Do hàm lượng rất thấp nên thỉnh thoảng mới có 1

đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại
dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng
hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát
huỳnh quang đặc hiệu khác nhau. Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp
từ sợi khuôn được phân tách bằng điện di trên thạch acrylamid có độ phân
giải cao, cho phép phân biệt được các sợi đơn DNA hơn kém nhau 1
nucleotid. Trình tự các nucleotid được xác định tương ứng với trình tự của các
vạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotid.
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc
sử dụng ddNTP do F. Sanger và cộng sự phát minh. Máy giải trình tự gen
dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, hệ thống điện
di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử
ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang
tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích.
Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận biết được từng loại nucleotid và
trình tự của DNA đích .
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank
(National Center for Biotechnology Information – NCBI).


15

Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều nghiên
cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thêm nucleotid
trên gen.

Người bình thường

Bệnh nhân


sinh nguyên phát đã phát hiện được 22 bệnh nhân (chiếm 25,9%) mang 11
đột biến gen khác nhau, trong đó có 3 trường hợp đồng hợp tử và 8 trường
hợp dị hợp tử. 7 đột biến thay thế acid amin (1 đột biến mới là p.G329S) và
4 đột biến xóa đoạn (1 đột biến mới làm lệch khung dịch mã là
p.V419Gfs11X) .


18

Người
bình thường

Bệnh nhân
Hình 15. Hình ảnh giải trình tự gen của đột biến xóa đoạn
làm lệch khung dịch mã p.V419Gfs11X .

Nghiên cứu của Gronskov K. và cộng sự năm 2016 tại Đan Mạch đã
dùng phương pháp Sanger sequencing để xác định được 12 đột biến của gen
CYP1B1 gây bệnh Glôcôm bẩm sinh nguyên phát, trong đó có 5 đột biến
mới. 12 đột biến gen bao gồm 6 đột biến thay thế acid amin, 4 đột biến tạo mã
kết thúc (2 đột biến vô nghĩa và 2 đột biến lệch khung dịch mã), 1 đột biến
xóa đoạn và 1 đột biến lặp đoạn .
Nghiên cứu của Đỗ Tấn và cộng sự năm 2016 ở Việt Nam đã dùng
phương pháp Bi-directional sequencing trên 30 bệnh nhân đã phát hiện được
5 đột biến (chiếm 16,7%), trong đó có 2 dạng đồng hợp tử và 3 dị hợp tử .

Bệnh nhân

Bệnh nhân


+ Đoạn 1’: Chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở
đầu tận 5’.
+ Đoạn 2’: Gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống
nhau cho tất cả các probe. Là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuyếch đại
probe.
+ Đoạn 3’: Còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai
đoạn 1’ và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không
đặc hiệu với DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn
stuffer khác nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài


20

khác nhau. Do đó, sản phẩm khuyếch đại của các probe sẽ được phân tách
bằng điện di , .

Hình 17. Các giai đoạn của Kỹ thuật MLPA (theo Jan P. Schouten, 2002)
2.3.2. Các bước tiến hành phản ứng MLPA

- Mẫu DNA hòa với 5 μl TE được biến tính ở 98°C trong 5’.
- Cho hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe vào.
- Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong vòng 16 giờ (qua đêm). Hai đoạn lai
của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn với DNA đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau.
- Cho enzym ligase vào và ủ ở 54°C trong 15 phút, enzym lipase xúc
tác, nối hai đoạn oligonucleotid của probe lại với nhau. Phản ứng nối sẽ chấm


21

dứt bởi sự tăng nhiệt độ lên 98°C trong 5 phút của phản ứng PCR để khuyếch

CYP1B1 đã đưa ra cái nhìn đầy đủ về nguyên nhân gây bệnh, phối hợp với
lâm sàng giúp chẩn đoán, điều trị sớm, cũng như tiên lượng và phòng bệnh
cho bệnh nhân. Với sự phát triển không ngừng của sinh học phân tử, các kỹ
thuật chẩn đoán ngày càng hoàn thiện và cho kết quả nhanh, chính xác. Song
song với việc chẩn đoán bệnh, ngành công nghệ sinh học còn giúp tạo ra
nhiều thuốc mới bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Bên cạnh đó, nhờ các kỹ thuật
sinh học phân tử, có nhiều phương pháp điều trị mới được ra đời và thu được
thành quả tốt như liệu pháp điều trị thay thế gen, ghép tế bào gốc... Hy vọng
trong tương lai, các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh glôcôm bẩm sinh


23

nguyên phát nói riêng sẽ được chẩn đoán sớm và những biện pháp can thiệp
hợp lý nhằm giảm tỷ lệ mù lòa ở trẻ cũng như giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng
đồng.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

J. D. Watson và F. H. Crick (1974), "Molecular structure of nucleic
acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. J.D. Watson and F.H.C.
Crick. Published in Nature, number 4356 April 25, 1953", Nature,
248(5451), tr. 765.

2.

Robert N. Weiss, Shaffer và Daniel I. (1970), "Congenital and pediatric
glaucomas", Mosby, St. Louis, tr. 37.