BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1
GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHãA 2008 - 2012
HÀ NỘI – 2012
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1
GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHãA 2008 - 2012
Giáo viên hướng dẫn: GS.TS. TẠ THÀNH VĂNHÀ NỘI – 2012
2
3
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là một bước ngoặt đánh dấu sự chuyển tiếp từ một
sinh viên trở thành cử nhân kỹ thuật y học; là quá trình học tập, tích lũy kiến
thức, kỹ năng để áp dụng vào thực tế. Trong suốt quá trình đó, tôi đã nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu.
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới:
GS.TS. Tạ Thành Văn - Giám đốc trung tâm nghiên cứu Gen -
Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã tạo điều kiện cho tôi thực

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
OI Osteogenesis imperfect (tạo xương bất toàn)
COL1A1 Collagen týp I alpha 1
COL1A2 Collagen týp I alpha 2
DNA Deoxyribonucleic Acid
cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid
RNA Ribonucleic Acid
mRNA Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin)
NST Nhiễm sắc thể
Kb Kilo base
bp Base pair
dNTP deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphate
PCR Polymerase Chain Reaction
RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR sao mã ngược)
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
BN Bệnh nhân
Ala: Alanine Gly: Glycine Pro: Proline
Arg: Arginine His: Histidine Ser: Serine
Asn: Asparagine Ile: Isoleucine Thr: Threonine
Asp:Aspartic Leu: Leucine Trp: Tryptophan
Cys: Cysteine Lys: Lysine Tyr: Tyrorine
Gln: Glutamine Met: Methionine Val: Valine
Glu: acid Glutamic Phe: Phenylalanine Stop codon: mã kết thúc
6
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh xương bất toàn có tên tiếng Anh là Osteogenesis Imperfecta, viết
tắt là OI, còn gọi là bệnh xương thủy tinh hay bệnh giòn xương. Đây là bệnh
phổ biến nhất trong các rối loạn di truyền về xương. Tần suất mắc bệnh
khoảng 1/15.000 – 1/25.000 trẻ sinh ra và chủ yếu là di truyền trội trên nhiễm

Với những ý nghĩa trên, đề tài “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen
COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn” được thực hiện nhằm mục tiêu:
Phát hiện đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn
bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.
8
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh OI
1.1.1. Trên thế giới
Theo nghiên cứu của Lowenstein E.J. ở Ai Cập thì bệnh OI đã xuất
hiện từ 1000 năm trước công nguyên [21]. Tuy nhiên đến năm 1788 những
mô tả khoa học đầu tiên về bệnh OI mới được Olaus Jakob Ekman đưa ra.
Trong thế kỷ 20, những biến đổi lâm sàng đáng kể với mức độ nghiêm
trọng khác nhau của bệnh OI được xác định. Looser đã tiến hành phân loại
bệnh OI đầu tiên năm 1906, sau đó là Silence đề xuất phân loại OI thành 4 týp
năm 1979. Tuy đã được chỉnh sửa nhiều lần nhưng cách phân loại này vẫn
được áp dụng tới ngày nay [36].
Về mặt dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh OI vào khoảng 6-7/100,000. Tỷ lệ này
khác nhau ở các týp khác nhau: týp I và týp IV chiếm hơn một nửa trong số
tất cả các trường hợp. Với týp II, tỷ lệ mắc là 1-2/100,000 và đều tử vong
sớm. Týp III có tỷ lệ mắc tương đương týp II, còn týp IV là loại hiếm gặp
[36].
Năm 1974, những bất thường trong collagen của xương lần đầu tiên
được nhìn thấy trên kính hiển vi điện tử. Ba năm sau, báo cáo của Sykes đã
chỉ ra mối quan hệ tương tác giữa hai loại collagen trong sự tiêu biến của
pepsin trên da những bệnh nhân OI bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamide [36].
Đột biến gen mã hóa collagen týp I lần đầu tiên được mô tả bởi Chu và
cộng sự năm 1983 là đột biến xóa đoạn dài khoảng 0.5 kb trong 1 alen của
chuỗi procollagen - α1. Phát hiện này đánh dấu sự khởi đầu làm sáng tỏ quá
trình sinh tổng hợp collagen và cơ chế bệnh học phân tử của OI [5], [36].

tuổi nhỏ, các biến dạng xương ở mức nhẹ đến trung bình, tần suất gãy xương
thay đổi. Củng mạc mắt có thể bình thường hoặc xám; có hoặc không có tạo
răng bất toàn; thường giảm thính lực ở tuổi trưởng thành và tiền sử gia đình
có người điếc [5].
Xếp theo thứ tự từ nhẹ đến nặng sẽ là týp I, týp IV, týp III, týp II. Một
số nghiên cứu mới đã phân loại thêm týp V, VI, VII, VIII.
Bảng 1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh OI [36]
Týp
Đặc điểm
I II-A II-B III IV
Di truyền
Trội trên
NST thường
Trội trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Mức độ nghiêm trọng Nhẹ
Tử vong
trước sinh
Nghiêm trọng Nhẹ vừa Vừa
Gãy xương bẩm sinh Không Có Có
Thường
xuyên
Hiếm gặp
Biến dạng xương Hiếm gặp Rất nặng Nặng Nặng vừa Nhẹ vừa

Chẩn đoán bệnh OI ở người trưởng thành dựa vào: biểu hiện lâm sàng,
phim chụp X quang, tiền sử gãy xương và tiền sử gia đình.Với những trường
hợp không có tiền sử gia đình hoặc gãy xương không có kết hợp với những
bất thường ngoài xương thì chẩn đoán cần kết hợp thêm xét nghiệm số lượng
và cấu trúc phân tử collagen týp I qua nuôi cấy nguyên bào sợi từ da bệnh
nhân và kết hợp phân tích gen [5].
12
Hình 1.1. Sơ đồ chẩn đoán phân loại bệnh OI. [36]
1.2.3. Điều trị
Hiện nay, chưa có phương pháp thay thế cấu trúc collagen bị tổn
thương hay kích thích cho cơ thể tăng tổng hợp số lượng collagen, vì vậy
chứng bất toàn trong tạo sinh xương vẫn được xem là một rối loạn di truyền
không thể chữa khỏi được. Liệu pháp tác động lên gen và tế bào chỉ có tác
dụng hỗ trợ [17].
Các phương pháp chính điều trị OI gồm: Hóa dược trị liệu, vật lý trị
liệu (phục hồi chức năng), phẫu thuật chỉnh hình, điều trị răng, điều trị điếc
[2], [36].
13
a. Hóa dược trị liệu
Một trong những hoá dược điều trị OI được coi là hiệu quả nhất hiện
nay đó là thuốc ngăn cản quá trình huỷ xương nhóm bisphosphonate [2].
Bisphosphonate dùng để uống hoặc tiêm tĩnh mạch, được sử dụng rộng
rãi cho bệnh nhân OI thể nặng, nhưng tác dụng của nó trên nhóm bệnh nhân
OI thể nhẹ vẫn chưa được làm rõ [10], [36]. Ở một nhóm bệnh nhân OI dùng
thuốc sau vài tuần có biểu hiện: giảm đau, khỏe khoắn hơn, tăng trương lực
cơ [2]. Công bố mới đây của Bradbury về ảnh hưởng của Risedronate trên
người trưởng thành khẳng định ở bệnh nhân OI dùng thuốc có sự cải thiện
đáng kể mật độ chất khoáng ở cột sống thắt lưng, kèm theo giảm quá trình
hủy xương [8]. Clodronate và etidronate (bisphosphonates thế hệ đầu tiên)
gây ra sự tự chết của các hủy cốt bào do ức chế hoạt động của enzyme phụ

1.3.1.1. Thành phần, cấu trúc
Phân tử collagen týp I là protein gồm 3 chuỗi polypeptide (2 chuỗi α1
và 1 chuỗi α2); trong đó gen COL1A1 mã hóa cho hai chuỗi procollagen - α1,
gen COL1A2 mã hóa cho một chuỗi procollagen - α2. Các chuỗi propeptide
liên kết với nhau (2 chuỗi procollagen - α1 và 1 chuỗi procollagen - α2) tạo
thành chuỗi bậc ba helix. Vùng trung tâm của chuỗi xoắn dài 1012 acid amin,
trong đó có 338 tripeptide G-X-Y lặp lại liên tục (với G là Glycin, X thường
là Proline, Y thường là Hydroxyproline) [16], [32], [36].
15
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử collagen bình thường và bất thường [32]
(A): Cấu trúc gen COL1A1 gồm 3 phần chính:
(1) Vùng promoter hay vùng hoạt hóa (màu vàng) chứa trình tự TATA (hộp TATA
màu đen) (4) là nơi bám dính của các protein liên kết với hộp TATA, để tạo phức hợp RNA
polymerase khởi động quá trình phiên mã (transcription). Hộp TATA cách mã mở đầu của
gen khoảng 50 nucleotide.
(2) Vùng chứa 51 exon và các intron của gen COL1A1 (màu xanh lá cây).
(3) Đuôi poly A (poly Adenin) màu hồng, nằm ở vùng 3’-UTR (untranslated
region): là chuỗi lặp lại nhiều ribonuceleotide dạng Adenine ở đầu 3’ của mRNA (sau khi
phiên mã). Sự polyadenyl hóa được thực hiện nhờ enzyme đặc biệt là poly(A) polymerase
sử dụng Adenine như một cơ chất để gắn và kéo dài chuỗi Adenine vào đầu 3’. Chuỗi poly
A là nơi bám dính đặc hiệu của protein đặc hiệu PABP (poly A binding protein). Protein
này hoạt hóa cùng với phức hợp eIF (Eukaryotic initiation factors), cụ thể là eIF-4, để hoàn
thiện quá trình phiên mã, kích hoạt sự bám của ribosom, khởi động quá trình dịch mã.
(B): Collagen týp I bao gồm 2 chuỗi procollagen - α1 và 1 chuỗi procollagen - α2.
Sự bền vững của cấu trúc này phục thuộc vào sự lặp lại của bộ ba axít amin Gly-X-Y. Khi
có sự bất thường xảy ra trên gen COL1A1 dẫn tới thêm hoặc mất glycin (vùng màu đỏ) sẽ
gây rối loạn cấu trúc phân tử collagen, là nguyên nhân gây bênh OI.
(C): Phân tử collagen týp I [32].
16
1.3.1.2. Chức năng:

intron, đuôi poly A.
Để tổng hợp chuỗi procollagen, đầu tiên gen COL1A1 sẽ thực hiện
phiên mã tổng hợp phân tử mRNA tiền thân. Phân tử mRNA này trải qua quá
trình cắt các intron và nối chính xác các exon với nhau để tạo ra phân tử
mRNA hoàn chỉnh đảm bảo đúng trình tự. Phân tử mRNA hoàn chỉnh được
sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp chuỗi procollagen - α1.
1.3.3. Các dạng đột biến trên gen COL1A1
Hiện nay có đến 90% các trường hợp mắc bệnh OI là do đột biến gen
trội nằm trên gen COL1A1 hoặc COL1A2; còn lại 10% gây nên bởi các đột
biến gen lặn trên một trong các gen hiện nay đã biết (CRTAP, LEPRE1, PPIB,
SERPINH1, FKBP10, PLOD2, SP7, SERPINF1) hoặc trên các gen chưa
đươc phát hiện [36], [39].
18
Hình 1.5. Tỷ lệ các gen đột biến gây bệnh OI.
(https://oi.gene.le.ac.uk)
Các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI gồm: đột biến thay thế, đột
biến lặp, đột biến cắt nối, đột biến mất, đột biến thêm nucleotide. Trong đó
dạng đột biến thay thế là phổ biến nhất, chiếm khoảng 82% các đột biến trên
gen COL1A1 (Hình 1.6).
Hình 1.6. Tỉ lệ các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI.
(https://oi.gene.le.ac.uk)
19
Hầu hết các đột biến xảy ra trên exon, chiếm 83% tổng số đột biến trên
gen COL1A1. Trong đó đột biến thay thế là phổ biến nhất ở cả hai vị trí đột
biến trên exon và trên intron của gen COL1A1: chiếm 87% các đột biến trên
exon, 81% các đột biến trên intron (Hình 1.7).
Trong các đột biến thay thế thì phổ biến nhất là đột biến thay thế glycin
bằng một acid amin khác. Hiện nay có hơn 700 đột biến thay thế glycin được
phát hiện trên bệnh nhân OI và tổng hơp lại trên dữ liệu các đột biến gen
COL1A1 [5], [15], [36].

E3 c.2687G>A p.Gly896Asp 40
C5 c.2839G>T p.Gly947Cys 41
c.2563A>C p.Asn855His 38
G3 c.2930G>A p.Gly977Asp 41
B3 c.3001G>T p.Gly1001Cys 42
B2 c.3065G>T p.Gly1022Val 43
F3 c.3065G>T p.Gly1022Val 43
B5 c.3164G>A p.Gly1055Asp 44
21
G8 c.3280G>A p.Gly1094Ser 46
C6 c.3299G>A p.Gly1100Asp 46
c.436C>A p.Pro146Thr 5
D6 c.4237G>A p.Asp1413Asn 51
Thêm, lặp đoạn
H6 c.3148_3156dupGCTCCTGGT p.1050_1052dupAlaProGly 44
Cắt nối intron
C4 c.957+5G>A IVS14+5G>A Mất exon 14
A5 c.2509_2559+9del Mất exon 37
B6 c.3261+1G>A IVS45+1G>A Mất exon 45
H8 c.3423+2T>A IVS47+2T>A Mất exon 47
A2 c.3424-1G>C IVS47-1G>C Mất exon 48
1.3.4. Đặc điểm bệnh học phân tử của OI:
OI là bệnh di truyền trội trên NST thường.
Hình 1.8. Sự di truyền tính trạng bệnh trong bệnh OI
(http://ditruyen.com).
22
Sự di truyền bệnh OI qua các thế hệ có 3 đặc điểm chính: Nam nữ có tỉ
lệ mắc bệnh ngang nhau và bố mẹ cũng có vai trò ngang nhau trong việc
truyền tính trạng cho con cái; sự di truyền không ngắt quãng qua các thế hệ,
nếu bố mẹ không mang tính trạng bệnh thì sẽ không truyền bệnh cho con cái;

phản ứng PCR dựa trên đặc điểm của quá trình tự sao chép DNA trong tế bào:
cần có DNA ở dạng sợi đơn, cần các đoạn mồi và các loại enzym xúc tác.
Kỹ thuật PCR sử dụng Taq polymerase (enzym chịu nhiệt) tổng hợp
một mạch DNA mới từ mạch DNA đơn làm khuôn với nguyên liệu là 4 loại
nucleotide. Phản ứng đòi hỏi phải có mặt của cặp mồi đặc hiệu (mồi xuôi, mồi
ngược) có trình tự bổ sung với 2 đầu của trình tự DNA khuôn.
24
PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai
đoạn nhiệt độ khác nhau (Hình 1.9):
- Giai đoạn 1 (Biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độ
cao (cao hơn nhiệt độ Tm) mà tại đó phân tử từ dạng sợi kép thành
sợi đơn (94
0
C - 95
0
C trong vòng từ 30-60s).
- Giai đoạn 2 (Bắt cặp): Nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy
Tm (temperature melting) của các mồi (khoảng 40
0
C - 70
0
C tùy
thuộc mồi được sử dụng) cho phép các mồi bắt cặp với các sợi đơn
DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Thời gian cho giai đoạn này
khoảng 30-60s.
- Giai đoạn 3 (Kéo dài): Nhiệt độ tăng lên 72
0
C là nhiệt độ thích hợp
nhất cho enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA mới
bằng cách kéo dài sợi mồi từ 4 loại nucleotid (dATP, dCTP, dGTP,