BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
VŨ VĂN THÀNH
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khóa 2008 - 2012
Người hướng dẫn:
TS. TRẦN VÂN KHÁNH
Hà Nội - 2012
1
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận
được sự giúp đỡ vô cùng tận tình của các thầy, các cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, với tất cả tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ sự biết ơn sâu
sắc tới TS. Trần Vân Khánh – Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử - Khoa Kỹ
thuật Y học – Trường Đại học Y Hà Nội, người cô đã hết lòng dạy bảo, tận
tình hướng dẫn em những bước đầu tiên trên con đường học tập và nghiên
cứu khoa học.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Tạ Thành Văn, PGS.
TS. Nguyễn Thị Hà, những người thầy người cô đã giúp đỡ, động viên em
trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho em trong quá trình thực
hiện và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo Đại Học
Trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em
thực hiện khóa luận này.
Em xin cảm ơn Ths. Hồ Cẩm Tú cùng các anh chị cán bộ, anh chị Nghiên
cứu sinh tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em khi thực hiện và hoàn thành
khóa luận.
Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập.

ATP7B. Gen ATP7B nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể 13 (13q14.3) gồm 21
exon, với chiều dài khoảng 80 kb và mã hóa cho chuỗi protein gồm 1465 axit
amin. Enzym P-type ATPase đóng vai trò vận chuyển đồng qua màng tế bào.
Sự thiếu hụt hoặc giảm chức năng protein của ATP7B dẫn đến giảm sự bài tiết
Cu từ gan vào mật, khiến cho Cu tích lũy trong gan và tạo thành chất độc cho
gan. Khi lượng đồng trong gan tăng quá mức, đồng sẽ theo hệ thống tuần
hoàn tới các cơ quan đích như : não, mắt, thận gây ra các tổn thương cho cơ
quan đích.
Chẩn đoán bệnh có thể dựa trên các triệu chứng lâm sàng như dấu hiệu về
gan, não và vòng Kayser-Fleischer. Ngoài ra, có thể sử dụng các xét nghiệm
như đo nồng độ đồng trong nước tiểu 24h, hàm lượng ceruloplasmin huyết
thanh, nồng độ Cu trong gan tăng) [35, 12]. Tuy vậy, nếu chỉ dựa các xét
nghiệm hóa sinh thì rất khó để chẩn đoán chính xác cũng như khó có thể phân
biệt giữa người bình thường và người mang gen. Vì vậy, phân tích DNA là
một bước cần thiết để xác định người mắc bệnh [35].
Cho đến nay, khoảng hơn 500 đột biến đã được tìm thấy trên bệnh nhân
mắc bệnh Wilson [44]. Tuy nhiên, mỗi quốc gia cũng như mỗi chủng tộc
người khác nhau có các loại đột biến khác nhau . Đột biến p.His1069Glu là
đột biến thường gặp nhất trong quần thể nguời da trắng chiếm khoảng 37%
4
đến 63% tổng số đột biến. Trong khi đó, ở các bệnh nhân người Trung Quốc
đột biến p.Arg778Leu lại chiếm tới 34-38% tống số đột biến [9]
Từ những ý nghĩa trên đề tài : “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen
ATP7B gây bệnh Wilson” được thực hiện nhằm mục tiêu:
Phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson.
5
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON
1.1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh Wilson trên thế giới

exon 14 và exon 18 chiếm tới 84% tổng số đột biến và họ cũng chỉ ra rằng đột
biến H1069Q là đột biến phổ biến nhất được tìm thấy[16]
Các nhà nghiên cứu Thái Lan cũng đưa ra một báo cáo về việc phát hiện
đột biến trên gen ATP7B một năm sau đó[37].
Năm 2011, nhóm nghiên cứu Xin- Hua Li, Yui Lu, Qing- Chun Fu đã
phát hiện thêm 14 đột biến mới trong các bệnh nhân người Trung Quốc[44].
1.1.2.Tình hình nghiên cứu bệnh Wilson ở Việt Nam
Lần đầu tiên vào năm 1969, Bùi Quốc Hương và cộng sự đã báo cáo 8 trường
hợp bệnh Wilson tại hội nghị Thần kinh học quốc tế lần thứ IX tại Mỹ [1].
Sau đó vào những năm 2002-2005, Thái Duy Thành và cộng sự đã có
công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 29 trường
hợp bệnh nhân Wilson ở khoa Thần kinh - bệnh viện Bạch Mai [8].
Tiếp theo Quách Nguyễn Thu Thủy và cộng sự công bố nghiên cứu về
đặc điểm lâm sàng bệnh Wilson ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương giai
đoạn 2001 - 2006 [5]
Vào năm 2010, Nguyễn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Phương
Mai, W. Yoo cùng nhóm nghiên cứu đã phát hiện 4 loại đột biến điểm trên
gen ATP7B bằng phương pháp phân tích đột biến tại bệnh viện nhi trung
ương[6].
Năm 2011, Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein trường ĐH Y Hà Nội
tiến hành nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson[7].
Nhìn chung tình hình nghiên cứu bệnh Wilson ở nước ta còn chưa nhiều.
Mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về các đặc điểm lâm sàng và cận lâm
sàng[2,3,4].
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH WILON
2.1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson
7
Bệnh Wilson có nhiều biểu hiện lâm sàng phức tạp, theo nghĩa rộng,
bệnh nhân Wilson có thể mắc các vấn đề liên quan tới thần kinh, gan, hoặc cả
hai. Trong những năm qua những tiến bộ trong việc chẩn đoán đã cho phép

thống khác
• Mắt: vòng Kayser-Fleischer, đục thủy tinh thể hướng dương
• Thận bất thường: sỏi thận
• Xương bất thường: loãng xương sớm,viêm khớp
• Viêm tụy
• Kinh nguyệt bất thường, vô sinh, sẩy thai lặp đi lặp lại
1.1.1.1. Bệnh về gan
Các loại bệnh về gan có thể là rất khác nhau, từ không có triệu chứng tới
bất thường chỉ số hóa sinh trong suy gan cấp[27]. Trẻ em có thể hoàn toàn
không có triệu chứng về bệnh gan hoặc một số bệnh nhân lại có triệu chứng
lâm sàng giống viêm gan virus. Bệnh Wilson có thể được mô tả như bệnh suy
gan kịch phát, rối loạn hệ thống đông máu và tan huyết cùng với xét nghiệm
Coomb âm tính, suy thận, và tăng đáng kể nồng độ đồng trong huyết thanh và
nước tiểu. Những hình ảnh lâm sàng của bệnh Wilson có thể tương tự như
bệnh viêm gan mãn tính, trong đó nhấn mạnh sự cần thiết cần phải sàng lọc
bệnh nhân cho bệnh Wilson. Ở những bệnh nhân mắc bệnh gan, các vấn đề
về thần kinh( nếu xảy ra) thường xảy ra sau 2-5 năm [9, 25].
Bệnh nhân có biểu hiện xơ gan đặc hiệu như lách to, huyết áp cao và cổ
chướng. Tất cả bệnh nhân trẻ bị viêm gan mạn tính không rõ nguyên nhân , có
hoặc không có xơ gan, cần được sàng lọc cho bệnh Wilson[28,35].
1.1.1.2. Những thay đổi về mắt
Vòng KF rõ ràng nhất tại vùng ngoại biên của giác mạc, vòng KF xuất
hiện do sự lắng đọng đồng bên trong giác mạc trong màng Descemet. Kiểm
tra bằng đèn khe dùng để xác định có hay không vòng KF. Vòng KF xuất hiện
ở hầu hết bệnh nhân mắc bệnh Wilson, tuy nhiên nó không hoàn toàn là đặc
hiệu, bởi vì vòng KF xuất hiện trong một số trường hợp bệnh lý khác như
gan mãn tính, ứ mật, xơ gan[9]
9
Hình 1.1. Vòng KF ở vùng ngoại biên giác mạc[24]
1.1.1.3. Triệu chứng về thần kinh

hay 5mg/dL) nên được xem là dấu hiệu mạnh mẽ cho việc chẩn
đoán bệnh Wilson.
• Nên xét nghiệm nước tiểu 24h trong tất cả các bệnh nhân đang
nghi nghờ mắc bệnh Wilson. Lượng đồng đào thải ra
>100µg( >1.6µmol) trong các bệnh nhân có triệu chứng, nếu lượng
đồng đào thải ra >40µg( >0.6µmol) thì cần phải xác định thêm.
• Lượng đồng trong gan khô > 250µg/g là một thông tin quan trọng
trong việc chẩn đoán bệnh Wilson.
• Đánh giá thần kinh và hình ảnh X- Quang của não bộ nên được
xem xét trong tất cả các bệnh nhân thần kinh.
11
• Trong trường hợp khó khăn trong chẩn đoán bằng các dấu hiệu lâm
sàng và các chỉ số sinh hóa thì nên thực hiện phân tich toàn bộ
chuỗi gen đột biến.
1.2.3.Điều trị bệnh Wilson
Dùng thuốc: Hiện nay vẫn chưa có biện pháp can thiệp vào gen đột biến mà
các thuốc dùng để điều trị bệnh Wilson nhằm giúp tăng đào thải đồng ra khỏi
cơ thể hoặc dùng để giảm hấp thu đồng. Hay nói cách khác, những thuốc này(
penicillamine, trientine, kẽm acetate ) chỉ có tác dụng lập lại trạng thái cân
bằng của đồng trong mô[11,42].
Chế độ ăn: Nên tránh ăn các loại thực phẩm như scola, gan, các loại hạt, nấm
và các loại tôm, cua ,sò ,hến [13,35]
Ghép gan: việc ghép gan chỉ có hiệu quả với những bệnh nhân Wilson có biểu
hiện suy gan cấp tính và xơ gan mất bù[9].
1.3.CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH WILSON
1.3.1. Cấu trúc, chức năng của protein ATP7B
Bệnh Wilson là do đột biến gen ATP7B. Gen ATP7B mã hóa cho protein
ATP7B là một thành viên trong nhóm ATPase P- một nhóm các protein vận
chuyển kim loại vào và ra khỏi tế bào bằng cách sử dụng năng lượng được
lưu trữ trong các phân tử adenosine triphosphate(ATP)[32,34]. ATP7B được

exon 20. Nhìn chung, typ P- ATPase có những vị trí bám cho các ion trong
vùng xuyên màng để tạo điều kiện thuận lợi cho các ion di chuyển qua màng.
Trên vị trí xuyên màng số 6 gồm 1 motif CPC được bảo tồn đặc hiệu cho
protein vận chuyển kim loại nặng . Peptid chứa các motif này được chỉ ra rằng
là có gắn với đồng , điều đó cho thấy vậy motif CPC thực sự tham gia vận
chuyển Cu qua màng tế bào[32].
Vùng N: Là vùng bám ATP, các vị trí liên kết chính xác với ATP trong
vùng N chưa được xác định, nhưng phân tích cấu trúc vùng N của ATP7B
thấy có liên quan đến một số đột biến bao gồm H1069, G1099, G1101, I1102,
G1149 và N1150. Đặc biệt, H1069, G1099, G1101 và I1102 đều là những vị
trí đột biến được tìm thấy trên bệnh nhân Wilson. Và đột biến H1069Q là đột
biến điển hình gây bệnh Wilson ở quần thể người Châu Âu và Bắc Mỹ. Điều
này phù hợp với vị trí liên kết ATP, nghĩa là, đột biến H1069Q đồng nghĩa
với việc mất vị trí gắn của ATP vào ATP7B. Tuy nhiên, trong vùng N, hơn 40
đột biến gây bệnh Wilson đã được tìm thấy, điều này chỉ ra rằng có thể có
nhiều vị trí tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình liên kết với ATP.
Điều này được khẳng định rõ hơn khi đột biến E1064A gây ra sự thiếu hụt
hoàn toàn sự liên kết của ATP vào vùng N trên ATP7B[32].
Vùng P: Có chức năng phosphor hóa. Việc phân tích mô hình thực
nghiệm phân tử cho thấy rằng ATP gắn vào vùng N của protein ATP7B tạo
ra thay đổi về mặt hình thái làm cho vị trí gắn ATP trong vùng N gần với
vùng P hơn. Điều này có thể thúc đẩy việc gắn ATP và phosphoryl hóa của
vùng P. Việc gắn ATP trong vùng P của ATP7B xảy ra trong vùng lân cận
của axit amin aspartic vị trí 1027. Vị trí này là một phần của motif bảo tồn
cao DKTG(D: axit aspartic, K: Lysin, T: Threonin, G: Glycine) ở typ P-
ATPase. Và là vị trí phosphor hóa bằng γ-phosphate của ATP[32].
15
Vùng A: Có chức năng khử phosphoryl hóa. Sự khử phospho của axit
aspartic được thực hiện nhờ phản ứng trung gian của enzyme phosphatase nội
bào, trong đó vùng A đóng 1 vai trò then chốt[32].

Đột
biến
Sự hoạt động xúc tác ATPase Tương tác Protein-Protein
G85V
L4925
A604P
E1064A
H1069Q
R1115H
N1270S
R778L
R778Q
Không gắn ATP
Không gắn ATP
Không thủy phân ATP
Tăng nhẹ gắn ATP
Giảm thủy phân ATP
Giảm tương tác với ATOX1
Tăng tương tác với ATOX1
Tăng tương tác với ATOX1
17
Trong chu trình vận chuyển đồng, ảnh hưởng của đồng tới việc hình
thành trung gian acylphosphat đã được chứng minh, điều này cho thấy 6
MBSs có vai trò điều tiết sự hình thành trung gian acylphosphat. Tuy nhiên,
đột biến của vùng MBSs này chỉ ảnh hưởng nhẹ đến tốc độ và mức độ
phosphoryl hóa. Các đột biến tập trung chủ yếu ở vùng N và vùng xuyên
màng. Có rất nhiều đột biến xảy ra ở vùng N, trong số chúng đột biến
H1069Q là đột biến điển hình nhất[18,31]. Khi đột biến này xảy ra đồng
nghĩa với việc mất đi vị trí gắn của ATP vào ATP7B. Theo một nghiên cứu
của Kuppala cho thấy đột biến H1069Q là phổ biến nhất trong các bệnh nhân

19
Bảng 1.3. Kiểu gen bố mẹ và tỉ lệ bị bệnh di truyền lặn
nhiễm sắc thể thường ở thế hệ con
Kiểu gen của bố mẹ Tỉ lệ con bị bệnh và kiểu gen
Bố hoặc mẹ Mẹ hoặc bố AA Aa Aa
AA AA 1 0 0
AA Aa ½ ½ 0
AA Aa 0 1 0
Aa Aa ¼ ½ ¼
Aa Aa 0 ½ ½
Aa Aa 0 0 1
(AA – đồng hợp tử lành, Aa – lành mang gen, aa – đồng hợp tử bệnh)
Bệnh nhân Wilson có thể mang một gen bệnh của người bố hoặc
một gen bệnh của người mẹ hoặc cả hai gen bệnh của người bố và người
mẹ. Bố, mẹ của bệnh nhân có thể mang gen đồng hợp lặn hoặc gen dị hợp.
Các anh chị em của bệnh nhân có thể mang gen bệnh hoặc không. Những
người mang gen bệnh đều có khả năng di truyền cho con cháu. Có một
điểm khác biệt so với nhiều bệnh di truyền khác là người mang gen dị hợp
cũng biểu hiện bệnh và thường kèm theo dạng đột biến khác[17,40].
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT
BIẾN GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON
1.4.1. Phản ứng PCR
Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép DNA.
Enzym Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn DNA mạch
đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA mới bổ trợ và cần phải có các mồi
oligonucleotid để khởi đầu quá trình tổng hợp.
Các bước cơ bản của phản ứng PCR được mô tả bởi hình 1.6. Mỗi chu
kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và được điều hòa bởi nhiệt độ:
+ Giai đoạn 1: Phân tử DNA được xử lý ở nhiệt độ cao để tách DNA
khuôn dạng kép thành hai sợi đơn, thường là 94 – 95

khác nhau. Cấu tạo của một máy tự động gồm hai phần chính yếu, đó là: phần
điện di với gel polyacrylamid và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di
poluacrylamid có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần
21
phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm ti laser đi
qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di,
mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia sáng laser thì vạch điện di sẽ
phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu
lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Tù biểu đồ của các đỉnh
cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để
cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank
(National Center for Biotechnology Information – NCBI).
Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều
nghiên cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thên
nucleotid trên gen. Do phần lớn các đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson là
đột biến điểm như trên đã trình bày nên cho đến nay phương pháp giải trình tự
gen ATP7B vẫn được coi là một tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến
của gen gây bệnh.
22
Hình 1.7. Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP

23
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.2. Nhóm bệnh
n = 5 bệnh nhân (bn) được chẩn đoán bệnh WD do thiếu enzym P-
ATPase . Bệnh nhân được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng
và hóa sinh đặc hiệu.

- Ống đong, bình nón
- Khay đổ gel
- Cân điện tử
- Tủ sấy
- Lò vi sóng
- Máy Votex
- Máy ly tâm lạnh, máy ly tâm thường
- Máy lắc nhiệt
- Máy điện di
- Máy chụp ảnh gel
- Máy đọc huỳnh quan
- Máy đo OD
- Máy PCR
- Máy giải trình tự gen tự động
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi
Các mẫu DNA được tách chiết từ máu ngoại vi theo phương pháp
Phenol/chloroform
Nguyên tắc cơ bản bao gồm các bước: Loại hồng cầu và phá vỡ màng tế
bào → Phá vỡ màng nhân → Loại protein → Tủa DNA → Rửa tủa → Hòa
tan DNA
Quy trình cụ thể:
− 0,5ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer) + 0,5ml máu toàn phần
chống đông EDTA (1mg EDTA/1ml máu toàn phần)
+ Trộn đều, ủ 10 phút trong đá
+ Ly tâm 8000v/phút x 10 phút/4ºC
+ Loại dịch nổi thu cặn A
− Cặn A + 0,5ml dung dịch hỗ trợ phá màng tế bào và cố định nhân (dung
dịch K)
+ Trộn đều, để 10 phút ở nhiệt độ phòng