BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1
GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHãA 2008 - 2012
HÀ NỘI – 2012
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1
GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHãA 2008 - 2012
Giáo viên hướng dẫn: GS.TS. TẠ THÀNH VĂNHÀ NỘI – 2012
2
Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
***
LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội
Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các
số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất
cứ công trình nghiên cứu nào khác.
Hà nội, ngày 27 tháng 06 năm 2012

4
đột biến trên bệnh nhân mắc bệnh xương bất toàn là cần thiết cho việc phát
hiện sớm, để có những can thiệp, hỗ trợ kịp thời, nâng cao chất lượng cuộc
sống cho bệnh nhân, động thời giảm bớt gánh nặng cho gia đình. Ngoài ra,
một mục tiêu quan trọng nữa của việc phát hiện đột biến đó là xác định người
lành mang gen bệnh, tạo tiền đề quan trọng giúp chẩn đoán trước sinh đối với
những đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh, để đưa ra những lời khuyên
cần thiết.
Với những ý nghĩa trên, đề tài “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen
COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn” được thực hiện nhằm mục tiêu:
Phát hiện đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn
bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.
5
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh OI
1.1.1. Trên thế giới
Theo nghiên cứu của Lowenstein E.J. ở Ai Cập thì bệnh OI đã xuất
hiện từ 1000 năm trước công nguyên [21]. Tuy nhiên đến năm 1788 những
mô tả khoa học đầu tiên về bệnh OI mới được Olaus Jakob Ekman đưa ra.
Trong thế kỷ 20, những biến đổi lâm sàng đáng kể với mức độ nghiêm
trọng khác nhau của bệnh OI được xác định. Looser đã tiến hành phân loại
bệnh OI đầu tiên năm 1906, sau đó là Silence đề xuất phân loại OI thành 4 týp
năm 1979. Tuy đã được chỉnh sửa nhiều lần nhưng cách phân loại này vẫn
được áp dụng tới ngày nay [36].
Về mặt dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh OI vào khoảng 6-7/100,000. Tỷ lệ này
khác nhau ở các týp khác nhau: týp I và týp IV chiếm hơn một nửa trong số
tất cả các trường hợp. Với týp II, tỷ lệ mắc là 1-2/100,000 và đều tử vong
sớm. Týp III có tỷ lệ mắc tương đương týp II, còn týp IV là loại hiếm gặp
[36].
Năm 1974, những bất thường trong collagen của xương lần đầu tiên

OI týp II-A và II-B.
- Týp III: Là thể tương đối nặng, chỉ đứng sau týp II, trẻ thường sinh ra
đã có gãy xương, biến dạng tiến triển xương dài, xương sọ, cột sống… Gãy
xương tái phát nhiều lần gây hậu quả là chi ngắn và biến dạng tăng dần, mặt hình
tam giác và có bướu trán. Củng mạc mắt thường quá trắng hoặc có màu xám, màu
xanh, giảm chức năng hô hấp, giảm thính lực và bất thường về răng.
7
- Týp IV: Là thể trung gian giữa týp I và III. Gãy xương xuất hiện ở
tuổi nhỏ, các biến dạng xương ở mức nhẹ đến trung bình, tần suất gãy xương
thay đổi. Củng mạc mắt có thể bình thường hoặc xám; có hoặc không có tạo
răng bất toàn; thường giảm thính lực ở tuổi trưởng thành và tiền sử gia đình
có người điếc [5].
Xếp theo thứ tự từ nhẹ đến nặng sẽ là týp I, týp IV, týp III, týp II. Một
số nghiên cứu mới đã phân loại thêm týp V, VI, VII, VIII.
Bảng 1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh OI [36]
Týp
Đặc điểm
I II-A II-B III IV
Di truyền
Trội trên
NST thường
Trội trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Mức độ nghiêm trọng Nhẹ

bệnh OI tới 89%. Siêu âm hai chiều là kỹ thuật hình ảnh đáng tin cậy trong
OI týp II và III. Việc chẩn đoán có thể được thực hiện sớm nhất ở tuần 17 của
thai kỳ với OI týp I và tuần 13 với OI týp II. Đối với OI týp III, chiều dài chi
thường bắt đầu biến đổi sớm nhất ở khoảng tuần 17 đến 18 của thai kỳ. OI týp
III hoặc týp IV có thể có hoặc không có gãy xương, biến dạng xương hay
giảm khoáng hoá xương; nếu có thì sự biến đổi chỉ nhìn thấy được ở 3 tháng
cuối thai kì. Vì vậy cần siêu âm định kỳ khi có nghi ngờ OI týp III hoặc týp
IV [14].
Chẩn đoán bệnh OI ở người trưởng thành dựa vào: biểu hiện lâm sàng,
phim chụp X quang, tiền sử gãy xương và tiền sử gia đình.Với những trường
hợp không có tiền sử gia đình hoặc gãy xương không có kết hợp với những
bất thường ngoài xương thì chẩn đoán cần kết hợp thêm xét nghiệm số lượng
và cấu trúc phân tử collagen týp I qua nuôi cấy nguyên bào sợi từ da bệnh
nhân và kết hợp phân tích gen [5].
9
Hình 1.1. Sơ đồ chẩn đoán phân loại bệnh OI. [36]
1.2.3. Điều trị
Hiện nay, chưa có phương pháp thay thế cấu trúc collagen bị tổn
thương hay kích thích cho cơ thể tăng tổng hợp số lượng collagen, vì vậy
chứng bất toàn trong tạo sinh xương vẫn được xem là một rối loạn di truyền
không thể chữa khỏi được. Liệu pháp tác động lên gen và tế bào chỉ có tác
dụng hỗ trợ [17].
Các phương pháp chính điều trị OI gồm: Hóa dược trị liệu, vật lý trị
liệu (phục hồi chức năng), phẫu thuật chỉnh hình, điều trị răng, điều trị điếc
[2], [36].
10
a. Hóa dược trị liệu
Một trong những hoá dược điều trị OI được coi là hiệu quả nhất hiện
nay đó là thuốc ngăn cản quá trình huỷ xương nhóm bisphosphonate [2].
Bisphosphonate dùng để uống hoặc tiêm tĩnh mạch, được sử dụng rộng

Vật lý trị liệu để ngăn ngừa sự co cứng và biến dạng cột sống trên bệnh
nhân OI týp III và IV. Một số biện pháp: tập thể dục, bơi lội, dinh dưỡng, thực
hiện một lối sống lành mạnh (không hút thuốc lá, tránh uống cà phê, rượu,
tránh dùng các loại thuốc chống viêm có corticosteroid) [2].
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều thử nghiệm điều trị và bước đầu đã
có kết quả khả quan như: liệu pháp điều trị gen, ghép tủy xương [5].
1.3. Cơ sở phân tử của bệnh OI
1.3.1. Cấu trúc, chức năng của protein Collagen typ I
1.3.1.1. Thành phần, cấu trúc
Phân tử collagen týp I là protein gồm 3 chuỗi polypeptide (2 chuỗi α1
và 1 chuỗi α2); trong đó gen COL1A1 mã hóa cho hai chuỗi procollagen - α1,
gen COL1A2 mã hóa cho một chuỗi procollagen - α2. Các chuỗi propeptide
liên kết với nhau (2 chuỗi procollagen - α1 và 1 chuỗi procollagen - α2) tạo
thành chuỗi bậc ba helix. Vùng trung tâm của chuỗi xoắn dài 1012 acid amin,
trong đó có 338 tripeptide G-X-Y lặp lại liên tục (với G là Glycin, X thường
là Proline, Y thường là Hydroxyproline) [16], [32], [36].
12
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử collagen bình thường và bất thường [32]
(A): Cấu trúc gen COL1A1 gồm 3 phần chính:
(1) Vùng promoter hay vùng hoạt hóa (màu vàng) chứa trình tự TATA (hộp TATA
màu đen) (4) là nơi bám dính của các protein liên kết với hộp TATA, để tạo phức hợp RNA
polymerase khởi động quá trình phiên mã (transcription). Hộp TATA cách mã mở đầu của
gen khoảng 50 nucleotide.
(2) Vùng chứa 51 exon và các intron của gen COL1A1 (màu xanh lá cây).
(3) Đuôi poly A (poly Adenin) màu hồng, nằm ở vùng 3’-UTR (untranslated
region): là chuỗi lặp lại nhiều ribonuceleotide dạng Adenine ở đầu 3’ của mRNA (sau khi
phiên mã). Sự polyadenyl hóa được thực hiện nhờ enzyme đặc biệt là poly(A) polymerase
sử dụng Adenine như một cơ chất để gắn và kéo dài chuỗi Adenine vào đầu 3’. Chuỗi poly
A là nơi bám dính đặc hiệu của protein đặc hiệu PABP (poly A binding protein). Protein
này hoạt hóa cùng với phức hợp eIF (Eukaryotic initiation factors), cụ thể là eIF-4, để hoàn

1.3.2.2. Cấu trúc và chức năng
Gen COL1A1 gồm 51 exon với chiều dài 18kb, mã hóa 5kb cho chuỗi
procollagen -α1 (procollagen týp I alpha 1) tham gia cấu trúc phân tử collagen
týp I. Các exon từ 6 tới 49 mã hóa chuỗi xoắn kép alpha. Hầu hết các exon
này có chiều dài khoảng 45 bp, 54 bp hoặc bội số của 45 hoặc 54 bp [31].
Hình 1.4. Cấu trúc của gen COL1A1 [31]
Gen COL1A1 mã hóa chuỗi procollagen - α1 gồm 1464 acid amin [31].
Cấu trúc gen chia thành 3 vùng chính: Vùng promoter, vùng chứa exon và
intron, đuôi poly A.
Để tổng hợp chuỗi procollagen, đầu tiên gen COL1A1 sẽ thực hiện
phiên mã tổng hợp phân tử mRNA tiền thân. Phân tử mRNA này trải qua quá
trình cắt các intron và nối chính xác các exon với nhau để tạo ra phân tử
mRNA hoàn chỉnh đảm bảo đúng trình tự. Phân tử mRNA hoàn chỉnh được
sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp chuỗi procollagen - α1.
1.3.3. Các dạng đột biến trên gen COL1A1
Hiện nay có đến 90% các trường hợp mắc bệnh OI là do đột biến gen
trội nằm trên gen COL1A1 hoặc COL1A2; còn lại 10% gây nên bởi các đột
biến gen lặn trên một trong các gen hiện nay đã biết (CRTAP, LEPRE1, PPIB,
SERPINH1, FKBP10, PLOD2, SP7, SERPINF1) hoặc trên các gen chưa
đươc phát hiện [36], [39].
15
Hình 1.5. Tỷ lệ các gen đột biến gây bệnh OI.
()
Các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI gồm: đột biến thay thế, đột
biến lặp, đột biến cắt nối, đột biến mất, đột biến thêm nucleotide. Trong đó
dạng đột biến thay thế là phổ biến nhất, chiếm khoảng 82% các đột biến trên
gen COL1A1 (Hình 1.6).
Hình 1.6. Tỉ lệ các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI.
()
16

E8 c.2470G>C p.Gly824Arg 37
H4 c.2533G>C p.Gly845Arg 37
H5 c.2542G>C p.Gly848Arg 37
B1 c.2596G>A p.Gly866Ser 38
B7 c.2623G>A p.Gly875Ser 39
c.863A>T p.Glu288Ala 13
E5 c.2650G>A p.Gly884Ser 39
G2 c.2650G>A p.Gly884Ser 39
E3 c.2687G>A p.Gly896Asp 40
C5 c.2839G>T p.Gly947Cys 41
c.2563A>C p.Asn855His 38
G3 c.2930G>A p.Gly977Asp 41
B3 c.3001G>T p.Gly1001Cys 42
B2 c.3065G>T p.Gly1022Val 43
F3 c.3065G>T p.Gly1022Val 43
B5 c.3164G>A p.Gly1055Asp 44
18
G8 c.3280G>A p.Gly1094Ser 46
C6 c.3299G>A p.Gly1100Asp 46
c.436C>A p.Pro146Thr 5
D6 c.4237G>A p.Asp1413Asn 51
Thêm, lặp đoạn
H6 c.3148_3156dupGCTCCTGGT p.1050_1052dupAlaProGly 44
Cắt nối intron
C4 c.957+5G>A IVS14+5G>A Mất exon 14
A5 c.2509_2559+9del Mất exon 37
B6 c.3261+1G>A IVS45+1G>A Mất exon 45
H8 c.3423+2T>A IVS47+2T>A Mất exon 47
A2 c.3424-1G>C IVS47-1G>C Mất exon 48
1.3.4. Đặc điểm bệnh học phân tử của OI:

đến vị trí bám của các hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucloeprotein) thì
cần thêm bước khuếch đại sản phẩm cDNA bằng phương pháp RT-PCR đế
biết exon nào bị mất từ mRNA. Tuy nhiên mẫu bệnh phẩm phải được lấy ở
vùng có sự biểu hiện protein collagen týp I (da, xương).
Như vậy để phát hiện đột biến trên gen COL1A1 cần chú ý tới 3 kỹ
thuật chính là: PCR, RT-PCR và giải trình tự gen.
1.4.1. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):
PCR là kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm. Nguyên tắc của
phản ứng PCR dựa trên đặc điểm của quá trình tự sao chép DNA trong tế bào:
cần có DNA ở dạng sợi đơn, cần các đoạn mồi và các loại enzym xúc tác.
Kỹ thuật PCR sử dụng Taq polymerase (enzym chịu nhiệt) tổng hợp
một mạch DNA mới từ mạch DNA đơn làm khuôn với nguyên liệu là 4 loại
nucleotide. Phản ứng đòi hỏi phải có mặt của cặp mồi đặc hiệu (mồi xuôi, mồi
ngược) có trình tự bổ sung với 2 đầu của trình tự DNA khuôn.
21
PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai
đoạn nhiệt độ khác nhau (Hình 1.9):
- Giai đoạn 1 (Biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độ
cao (cao hơn nhiệt độ Tm) mà tại đó phân tử từ dạng sợi kép thành
sợi đơn (94
0
C - 95
0
C trong vòng từ 30-60s).
- Giai đoạn 2 (Bắt cặp): Nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy
Tm (temperature melting) của các mồi (khoảng 40
0
C - 70
0
C tùy

hiệu. Sau đó, quá trình PCR được sử dụng để khuếch đại lượng cDNA tạo
thành với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen cần khuếch đại.
Thực chất RT-PCR là sự kết hợp hai quá trình: phiên mã ngược (RT) và
PCR.
Quá trình phiên mã ngược: sử dụng enzym sao mã ngược xúc tác sinh
tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi RNA ban đầu. Enzym sao mã ngược phải
có họat tính RNase H nhỏ (chỉ cắt RNA trong sợi lai RNA/DNA), độ bền
nhiệt cao, độ nhạy cao. Các enzym RT được sử dụng hiện có: enzym nguyên
thủy có nguồn gốc các virus (AMV-RT hoặc MMLV-RT) hay vi khuẩn
(enzym Tth từ vi khuẩn Thermus thermophilus là một enzym DNA
polymerase bền nhiệt và có hoạt tính RT khi có mặt Mn
2+
). Loại thứ hai là
enzym tái tổ hợp của AMV-RT và MMLV-RT có hoạt tính RNase H yếu hoặc
không còn, có độ bền nhiệt cao hơn (60
o
C).
Quá trình PCR khuếch đại sản phẩm cDNA thu được từ quá trình phiên
mã ngược.
24
1.4.3. Điện di trên gel
Điện di trên gel là phương pháp điện di sử dụng gel agarose hoặc
polyacrylamide với các nồng độ khác nhau để phân tách các phân tử có kích
thước, trọng lượng khác nhau.
Mục đích:
- Kiểm tra kích thước phân tử DNA/RNA.
- Ước lượng nồng độ DNA/RNA trong sản phẩm PCR.
- Đánh giá chất lượng sản phẩm DNA/RNA: độ tinh sạch, độ nguyên
vẹn.
Nguyên tắc: Trong dung dịch các phân tử DNA tích điện âm (-) vì vậy