BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA
Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số: 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Becker Muscular Dystrophy

BVSKTE

Bảo vệ sức khoẻ trẻ em

CK

Creatine Kinase

DMD

Duchenne Muscular Dystrophy

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

FISH

Fluorescent In Situ Hybridization

ICSI

Intracytoplasmic Sperm Injection

IVF

In Vitro Fertilization


Reverse Transcription PCR

STR

Short Tandem Repeat


MỤC LỤC
CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


8

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày càng gia
tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng. Ra đời vào những năm 1970 của thế
kỷ trước, có thể nói phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm “in vitro
fertilization - IVF” đã trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vô sinh
mong muốn có đứa con [1]. Vào năm 2010 bác sỹ Robert G.Edwards đã vinh
dự trao giải thưởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn và
hiệu quả mà phương pháp này mang lại [2]. Phương pháp này đã mang lại

truyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng [18]. Theo thống kê của tổ
chức hemophilia A thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh
hemophilia A và chỉ có khoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu [19]. Tại Việt
Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000
người mang gen bệnh hemophilia A [20]. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy
máu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảy
máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ biểu hiện
trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong huyết tương.


10

Việc tầm soát trước sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quan
trọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh. Việc xác định
đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩn đoán
trước sinh bệnh hemophilia A đã được nghiên cứu khá nhiều ở Việt Nam.Việc
quản lý bệnh nhân và người mang gen của bệnh lý này là tiền đề vững chắc để
triển khai thành công quy trình chẩn đoán trước làm tổ trong sàng lọc phôi.
Phương pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho người mẹ khi
mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khi
chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng mang
gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh ở cộng đồng. Cùng với sự phát triển
của sinh học phân tử phát hiện các đột biến gây bệnh hemophilia A, kỹ thuật
microsatellite DNA là kỹ thuật sử dụng các primer gắn huỳnh quang để
khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn (short tandem repeat-STR) và phân tích
kích thước của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen
để xác định các alen đột biến. Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là dễ dàng phát
hiện alen đột biến mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ
giảm được chi phí cho gia đình bệnh nhân. Hiện nay kỹ thuật này còn khá
mới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền. Xuất

này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau.
1.1.3. Dịch tễ bệnh học
Theo thống kê của tổ chức hemophilia thế giới (WFH), hiện nay có
khoảng 500.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có khoảng 1/3 được
chẩn đoán [23]. Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A gần giống nhau ở các vùng địa
lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000
dân.Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000 ÷ 1/5.000 trẻ trai [24]. Tại
Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000 bệnh
nhân hemophilia. Số liệu điều tra những năm 1994 ÷ 1996 về tình hình bệnh
hemophilia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là


13

25 ÷ 60/1.000.000 dân. Tại mít tinh hưởng ứng ngày hemophilia thế giới (174-2016), hội rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương đã công bố có 6000 người bị bệnh chảy máu di truyền [25].
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A
1.1.4.1. Đặc điểm chảy máu trong bệnh hemophilia A
Bệnh đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy
máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có thể tự nhiên
hoặc sau chấn thương nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu dưới da,
tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp.
Chảy máu khớp thường gặp nhất ở bệnh nhân hemophilia A. Đây là loại
chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp
[26]. Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương. Nếu điều
trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sưng và việc điều trị
bị kéo dài tới vài ngày. Trẻ lớn có thể nhận biết được chảy máu khớp trước khi
đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp. Điều trị sớm
sẽ dự phòng được tình trạng đau mạn tính và biến dạng khớp.


15

1.1.4.3. Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán xác định [21]
- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu.
- Dựa vào tiền sử gia đình
- Dựa vào xét nghiệm máu:
+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (Prothrombin Time: thời gian
prothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated Partial
Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài
> 1,5 giá trị bình thường.
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%.
+ Yếu tố Von Willebrand bình thường
+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.
Chẩn đoán mức độ bệnh
Nồng độ yếu tố VIII
Mức độ

(%) (hoạt tính

Biểu hiện chảy máu

(UI/ml))
Nặng
(Chiếm 70%)

Trung bình
(Chiếm 15%)
Nhẹ
(Chiếm 15%)

con trai sẽ bị bệnh, nếu truyền cho con gái thì người con gái sẽ trở thành
người mang gen bệnh.

Hình 1.3. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau
1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh
(XHXh) và 100% con trai bình thường (XHY).
2/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thường: trong một gia đình có bố bình
thường (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (người truyền bệnh) thì 50% số con
gái sẽ là người mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thường (XX), 50%
con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thường (XHY).
3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (X hXh) đồng
hợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50% con
trai bình thường (XHY). Như vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen


17

bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi mang
dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XHXh).
4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc
từ người mẹ: thường chiếm khoảng 1/3 các trường hợp hemophilia A. Tỉ lệ đột
biến gây bệnh hemophilia xẩy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trong
một thế hệ [31]. Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam cao
hơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ. Gần đây, người ta đã chứng
minh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến. Đột biến đảo
đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bào
mầm sinh dục nữ. Hiện tượng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thể
thứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phân
bào giảm nhiễm ở nam.
1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A


Gen mã hóa yếu tố VIII có chuỗi nặng với đầu cuối là N, gồm các
domain A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A 3-C1-C2 và
vùng B. Khi thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và
threonin. Vùng B không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình
dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII.
1.2.2.2. Protein yếu tố VIII

Hình 1.6. Cấu trúc gen và protein FVIII [29]
Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3-Cl-C2,
gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước 200 kD, chuỗi nhẹ
là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD. Cấu trúc của phức hợp này được giữ
ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ nước với yếu tố von
Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tố VIII) và Ca 2+.
Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các vùng A 1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là


20

C, gồm các vùng A3-C1-C2. Vùng B được mã hóa bởi một exon lớn và không
có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết. Khi thủy phân hoàn toàn domain
B tạo thành asparagin, serin và threonin. Vùng B không cần cho chức năng
của yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của
yếu tố VIII.

Hình 1.7. Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng
(Nguồn w.w.w. nature.com/revieus/genetics)
Vùng A (A1, A2, A3) là nơi bám của các ion Ca2+, Cu2+ và các yếu tố IX, X
trong quá trình đông máu. Vùng C (C1, C2) là vị trí bám cho yếu tố vWF, X
và của các phân tử phospholipid một khi FVIII được hoạt hóa. Vùng B chứa

50% các thể bệnh nặng. Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu mút
telomere, nhiễm sắc thể X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tự
tương đồng đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1).
Quá trình tái tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùng
int22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26)
cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tố VIII [32].
Đột biến mất đoạn và thêm đoạn của gen yếu tố VIII
Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng.
Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen. Cơ chế phân tử của dạng đột biến
này đã được kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tượng lặp lại Alu
[17]. Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tượng Alu làm đứt gãy gen F8 và gây


22

bệnh hemophilia A thể nặng. Xóa đoạn và thêm đoạn nhỏ cũng thường thấy
trong hemophilia A thể nặng, trong đó thay đổi 1-55 nucleotid. Phổ biến nhất
là xóa hoặc thêm nucleotid Adenin vào exon 14, thường xảy ra trong vùng từ
c.3637 đến c.4379 [33].
1.3. NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A
Hemophilia A là bệnh rối loạn di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc
thể giới tính X, gây nên do đột biến yếu tố VIII. Việc chẩn đoán người lành
mang gen bệnh là rất quan trọng để ngằn ngừa sự ra đời của những đứa trẻ bị
bệnh hemophilia A [34].
1.3.1. Đặc điểm chung người mang gen bệnh
Người lành mang gen bệnh là người mang một nhiễm sắc thể X có đột
biến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình thường. Biểu hiện lâm sàng có thể
nặng hoặc nhẹ.
Người lành mang gen bệnh có triệu chứng như một người bị hemophilia A
thể nhẹ. Những người mang gen bệnh hemophilia A có hoạt tính yếu tố VIII

kể thời gian học hoặc làm việc do rong kinh. Đó cũng có thể là nguyên nhân
của tình trạng thiếu sắt, thiếu máu và làm giảm chất lượng cuộc sống ở phụ nữ
mang gen bệnh. Chảy máu nặng trong kỳ kinh nguyệt đầu tiên của một người
lành mang gen bệnh có thể dẫn đến phải nhập viện [35].
+ Chảy máu bất thường âm đạo (băng huyết)
Băng huyết liên quan đến chảy máu bất thường xảy ra ngoài chu kỳ
kinh nguyệt bình thường. Chảy máu bất thường xảy ra đôi khi trong khoảng
thời gian giữa phần cuối của một chu kỳ kinh nguyệt với kỳ kinh bắt đầu tiếp
theo. Nếu chảy máu nặng nề cần nghỉ ngơi tại chỗ hoặc nhập viện để theo dõi.
+ Đau bụng kinh
Người mang gen bệnh hemophilia A có nhiều khả năng có đau bụng
giữa chu kỳ kinh nguyệt hơn những người không mang gen bệnh (đau bụng
do xuất huyết lúc rụng trứng).
+ U nang buồng trứng
Trong quá trình rụng trứng, một lượng nhỏ máu bị chảy có thể xảy ra
khi trứng được giải phóng khỏi nang (túi chứa đầy dịch, trong đó một quả
trứng phát triển). Chảy máu này có thể gây ra một loại u hình thành trên
buồng trứng, gọi là u nang thể vàng. Người mang gen bệnh hemophilia A có
nhiều khả năng bị chảy máu đáng kể và kéo dài lúc rụng trứng, gây ra đau
bụng vùng hạ vị. Hơn nữa, một u nang buồng trứng có nguy cơ bị vỡ vào kỳ
kinh nguyệt, gây ra chảy máu trong và đau đột ngột ở vùng bụng dưới, trường
hợp này gọi là u nang buồng trứng xuất huyết.


25

+ Chảy máu ổ bụng (hemoperitoneum)
Máu có thể chảy vào các mô xương chậu và dây chằng, đôi khi vào ổ
bụng và vùng chậu, gọi là chảy máu ổ bụng, là một cấp cứu ngoại khoa có thể
đe dọa đến tính mạng.

1.3.4. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh
Người phụ nữ mang gen bệnh ngoài việc sinh ra những đứa trẻ bị bệnh
và những đứa con mang gen bệnh, những đứa con mang gen bệnh này lại có
khả năng sinh ra những đứa con bị bệnh. Vì vậy, nếu không quản lý hay phát
hiện được những người phụ nữ mang gen bệnh thì thế hệ tiếp theo sẽ gia tăng
tỷ lệ những đứa con mang bệnh và mang gen bệnh. Vì vậy, việc xác định sớm
những người phụ nữ mang gen bệnh sẽ giúp cho họ có định hướng, chủ động
trong việc kết hôn và sinh ra những đứa con khỏe mạnh.