Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
trờng đại học y h nội[\

Trần kiêm Hảo

xác định một số đột biến gen cyp21 gây bệnh tăng sản
thợng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase
v phát hiện ngời lnh mang gen bệnh tóm tắt luận án tiến sĩ y học

Chuyên ngành : Nhi khoa
Mã số : 3.01.43

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Trờng Đại học Y Hà Nội
- Th viện Thông tin Y Trung ơng
- Th viện Bệnh viện Trung ơng Huế
- Th viện Đại học Y khoa Huế Một số công trình liên quan đến luận án
1. Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thu Nhạn,
Nguyễn Thị Phợng, Vũ Chí Dũng, Bùi Phơng Thảo (2005),
Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm bệnh tăng sản thợng thận bẩm
sinh ở trẻ gái, Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 35(2), tr. 99-104.
2. Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phợng, Võ Thị Thơng Lan
(2005), Một số đột biến gen CYP21 và liên quan giữa kiểu gen-
kiểu hình của bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh, Hội nghị khoa
học toàn quốc 2005, Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản,
hớng 8.2, Bộ Khoa học Công nghệ, tr. 8-11.
3. Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Trần Kiêm Hảo
(2005), Kết quả điều trị bệnh TSTTBS trong 10 năm 1993-2002
tại BV Nhi Trung ơng, Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 38(5), tr.
195-9.
4.
Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phợng, Võ Thị Thơng Lan
(2006), ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện một số đột biến gen
CYP21 gây bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh do thiếu 21-

chuỗi trùng hợp PCR để xác định các đột biến gen CYP21 gây bệnh
TSTTBS thiếu 21-OH chỉ mới đợc đề cập qua 2 công trình nghiên cứu

2
của V. T. Kim Huệ và T. T. Nam. Do vậy, cần phải tiếp tục nghiên cứu
sâu hơn vấn đề này.
Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Xác định một số đột biến
gen CYP21 gây bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh thiếu enzym
21-hydroxylase và phát hiện ngời lành mang gen bệnh" với các
mục tiêu sau:
1. Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh TSTTBS bằng kỹ
thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR.
2. Đối chiếu, tìm hiểu mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình
của bệnh nhân TSTTBS do thiếu enzym 21-hydroxylase.
3. Phát hiện ngời lành mang gen bệnh cho các thành viên của gia
đình bệnh nhân thiếu enzym 21-hydroxylase. Chơng 1
tổng quan ti liệu
1.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng gen CYP21
1.1.1. Vị trí, cấu trúc gen CYP21
Gen CYP21 là thành viên của nhóm Cytochrome P450c21. Gen
CYP21 gồm 2 bản sao, một bản có chức năng (CYP21 hay CYP21B)
và bản sao còn lại không có chức năng (CYP21P hay CYP21A).
Gen CYP21 và CYP21P nằm bên trong phức hợp hoà hợp mô chủ
yếu MHC trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, vùng 21.3 (6p21.3), cách
nhau khoảng 30 kb, gần kề và xen kẽ với các gen C4B và C4A mã hoá
thành phần C4 bổ thể.
Gen CYP21 gối vào gen tenascin-X (TNXB) ở sợi ADN đối diện và

3
5
2 3 4 5 87 10 69
Vùng
tăng
cờng
Yếu tố
đặc hiệu
mô
ATG - mã bắt đầu
TAA, TGA, TAG
- mã kết thúc
Vùng không sao mã
Vùng không sao mã

4
1.2. Sinh lý bệnh của TSTTBS
Enzym 21-OH xúc tác phản ứng chuyển progesteron thành 11-
deoxycorticosteron (DOC) và 17-Hydroxyprogesteron (17-OHP) thành
11-deoxycortisol. Hình 1.7. Sơ đồ rối loạn sinh tổng hợp hormon vỏ thợng thận do
thiếu enzym 21-OH.

yp
re
g
nenolon
DHEA
17-Hydroxyprogesteron



Androstenedion
11-Deoxycortisol
Cortisol
Testosteron
Dih
y
drotestosteron
Estron
Estradiol
21-OH

5
Ngoài ra, bệnh nhân còn có xạm da, trẻ gái có thể phì đại âm vật và
trẻ trai có thể to dơng vật.
1.3.2. Nam hoá đơn thuần
Thiếu enzym 21-OH ở mức độ vừa phải (1-3%) nên quá trình tổng
hợp cortisol, aldosteron vẫn còn.
Trẻ gái biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài. Biểu hiện nam
hoá thờng có ngay sau khi đẻ, âm vật to, các môi có thể dính với
nhau. Chiều cao và tuổi xơng phát triển nhanh. Từ 10-11 tuổi, trẻ
ngừng lớn và đạt chiều cao cuối cùng 140-150 cm. Khi trởng thành

khiến cho hoạt tính 21-OH chỉ còn 1-2% và đợc tìm thấy đặc trng ở
thể NHĐT.
Nhóm thứ ba (nhóm C) bao gồm những đột biến nh Val281Leu,
Pro30Leu và Pro453Ser tạo nên enzym 21-OH với hoạt tính 20-60%;
những đột biến này liên quan đến thể bệnh không cổ điển.
Nhóm thứ t (nhóm D) bao gồm các đột biến cha đợc sắp xếp
còn lại và các đột biến mới.
1.5. Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)
Phản ứng PCR do Kary Mullis và cs phát minh năm 1985. PCR cho
phép nhân một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong genome đạt đến số
lợng mong muốn khi biết trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn ADN đó.
Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép ADN.
Các bớc cơ bản của phản ứng PCR đợc mô tả bởi hình 1.9. Mỗi chu
kỳ phản ứng đòi hỏi 3 bớc:
+ Biến tính (denaturation): Phân tử ADN đợc xử lý ở nhiệt độ cao
để tách ADN khuôn dạng kép thành hai sợi đơn, thờng là 94-95
0
C.
+ Gắn mồi (annealing): Nhiệt độ hạ thấp dới nhiệt độ nóng chảy
Tm của các mồi, cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn
ADN khuôn theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung.
+ Tổng hợp bởi Taq-polymerase (synthesis): Taq sử dụng 4 loại
dNTP để kéo dài sợi mồi, tổng hợp sợi ADN mới.

7
3 bớc cơ bản tạo thành 1 chu kỳ trong phản ứng PCR. Khi các chu
kỳ đợc lặp lại, các đoạn ADN vừa đợc tổng hợp ở các chu kỳ trớc
trở thành khuôn cho chu kỳ sau. Số lợng phân tử ADN tạo ra tăng gấp
đôi sau mỗi chu kỳ. Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thờng
không quá 60.

- Thể mất muối: có biểu hiện suy thợng thận cấp, có phì đại âm
vật ở trẻ gái và có thể có phì đại dơng vật ở trẻ trai.
- Thể nam hoá đơn thuần: có hội chứng cờng androgen nh dậy thì
sớm ở trẻ trai, chuyển giới bộ phận sinh dục ngoài ở trẻ gái. Phát triển
thể lực nhanh và xuất hiện các dấu hiệu dậy thì sinh dục phụ.
Sinh hoá:
- Nồng độ progesterone > 1,1 nmol/l và 17-OHP máu > 6 nmol/l.
- Nồng độ testosterone máu > 1 nmol/l và 17-CS nớc tiểu > 14
mol/24giờ.
- Điện giải đồ rối loạn ở thể MM, natri máu < 133 mmol/l và kali
máu > 5,2 mmol/l. Điện giải đồ bình thờng ở thể NHĐT.
2.1.2. Thành viên gia đình bệnh nhân

9
Chọn 5 gia đình có con bị bệnh đã đợc thực hiện PCR phát hiện
đột biến gen CYP21, các thành viên này gồm bố mẹ anh chị em ruột.
2.2. Phơng pháp
2.2.1. Phát hiện các đột biến gen CYP21 bằng kỹ thuật PCR
2.2.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm gồm 6-10 sợi tóc có chân trắng ở gốc.
2.2.1.2. Chiết tách ADN
ADN hệ gen đợc chiết tách bằng cách ủ 5-10 đoạn tóc có chứa
chân tóc với dung dịch Chelex 10% ở 100
0
C trong 10 phút, nhằm phá
vỡ màng tế bào và giải phóng ADN ra khỏi nhân.
Sau khi ly tâm 5 phút, sẽ thu đợc ADN khuôn cho phản ứng PCR.
2.2.1.3. Quy trình thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng PCR sử dụng một số cặp mồi đặc hiệu đối với một số đột
biến gen CYP21 hay gặp. Trình tự các cặp mồi đợc thiết kế dựa vào trình


10
Bảng 2.1. Trình tự các mồi và điều kiện khuếch đại PCR
Mồi Trình tự (5'-3') Điều kiện PCR
A1 CTCCTGCAGACAAGCTGGTG
A2 GAACTCCTGGGTCAGCTGCT
94
0
C/3'; 40 chu kỳ ì (94
0
C/30,
60
0
C/1', 72
0
C/1'); 72
0
C/5'.
B1 TTTTGTTCTTCAGGCGATTCA
B2 TCCAGAGCAGGGAGTAGTTCTC
94
0
C/3'; 45 chu kỳ ì (94
0
C/30,
54
0
C/1', 72
0
C/3'); 72

P9
Agcccccaactcctcctgca
P10
tgtgggctttccagagc
94
0
C/3'; 40 chu kỳ ì (94
0
C/30,
60
0
C/30", 72
0
C/2'); 72
0
C/10'.
(nucleotide đã sửa đổi đợc gạch dới).
Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi P1/P2 và P7/P8 đợc cắt bởi enzyme
giới hạn HhaI và sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 đợc cắt bởi
enzyme giới hạn AciI.
Sản phẩm PCR cuối cùng sẽ đợc điện di trên thạch agarose/nu-
sieve 3:1 nồng độ 4%. Tuỳ độ dài các băng ADN thu đợc sẽ cho biết
BN có đột biến gen CYP21 hay không (Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Kích thớc các đoạn ADN đợc cắt bởi enzym giới hạn.
Kích thớc đoạn ADN (bp)
Đột biến Enzym giới hạn
Bình thờng Đột biến

158 150
Mất 8 bp

enzym 21-OH. 10 bố mẹ của 5 gia đình BN TSTTBS.
Qua phân tích số liệu, chúng tôi thu đợc kết quả sau:
1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu
1.1. Các thể lâm sàng của bệnh TSTTBS cổ điển
MM gồm 31 BN, tỉ lệ 72,1%. NHĐT gồm 12 BN, tỉ lệ 27,9% tổng
số 43 đối tợng nghiên cứu, thấp hơn có ý nghĩa, p < 0,05.
1.2. Giới tính
Nam 20 BN, tỉ lệ 46,5% và nữ 23 BN, tỉ lệ 53,5% trên tổng số 43
BN, p > 0,05. Tức tỉ lệ mắc bệnh của nam và nữ tơng đơng, phù hợp
đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS, gen lặn nhiễm sắc thể thờng.
1.3. Tuổi bệnh nhân lúc vào viện lần đầu
Trung bình đối với BN TSTTBS là 1,5 tháng (5 ngày - 80 tháng).

12
Thể MM là 1,3 tháng (5 ngày-19 tháng); sớm hơn có ý nghĩa so với
NHĐT là 22,0 tháng (2 tuần-80 tháng), p < 0,001.
1.4. Tiền sử sản khoa và tiền sử gia đình
- 31/34 = 91,2% BN có tuổi thai đủ tháng 38 tuần.
- Cân nặng lúc sinh của BN thể MM (3080 427 gr) tơng đơng
thể NHĐT ( 3166 280 gr), p > 0,05.
- 48,8% là con thứ hai (21 BN).
- 20,9% BN có tiền sử gia đình có con mắc bệnh tơng tự.
2. Kết quả phát hiện các đột biến gen CYP21 trên BN
Với một số cặp mồi đặc hiệu cho một số đột biến gen CYP21, thực
hiện PCR kết hợp enzym cắt giới hạn, chúng tôi đã phát hiện đợc 24
trờng hợp đột biến gen CYP21; chiếm 55,8%. 19 trờng hợp cha
phát hiện đợc kiểu đột biến gen; chiếm 44,2%. Cụ thể nh sau:
2.1. Đột biến điểm ở intron 2 (I2g)
A.


biến điểm I2g. Trên thế giới, đột biến này đã đợc tìm thấy từ năm 1988
bởi Higashi và cộng sự (cs).
Nhiều tác giả phát hiện đột biến điểm I2g với tỉ lệ tơng tự kết quả
của chúng tôi, theo Bachega và cs ở Brazil, tỉ lệ I2g là 20,6%. Hay
Tukel và cs ở Thổ Nhĩ Kỳ, là 22,5%. Tại Tây Ban Nha là 20%.
2.2. Mất đoạn 8bp ở exon 3 (

8bp) Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi A1/A2 trên thạch
agarose/nu-sieve.
. Cột 2, 5, 8 chỉ hiển thị 1 băng ADN 150 bp, tức đồng hợp tử

8bp
. Cột 1, 3, 6, 10, 11, 12 hiển thị cả 2 băng ADN 158 bp và 150 bp với
đậm độ đồng nhất, tơng ứng cá thể không bị đột biến

8bp;
. Cột 4, 7, 9 nghi ngờ dị hợp tử

8bp do đậm độ băng ADN 158 bp
giảm so với băng 150 bp. M-marker ADN 174/Hae III.
Với phơng thức này, phát hiện 9 trờng hợp đồng hợp tử đột biến
mất đoạn 8bp; chiếm 20,9% số BN nghiên cứu.
Đối với những trờng hợp nghi ngờ dị hợp tử mất đoạn 8bp, chúng
tôi kiểm tra mẫu ADN khuôn bằng cách thực hiện phản ứng nested-

Bằng phơng thức bổ sung này, phát hiện thêm 6 trờng hợp dị hợp
tử mất đoạn 8bp, chiếm 13,9% tổng số 43 BN.
Nh vậy, tỉ lệ allen mất đoạn 8bp là [(9ì2)+(6ì1)]/(43ì2) = 27,9%.
Tỉ lệ này cao hơn hẳn kết quả nghiên cứu ở một số quốc gia. Hầu
hết các tác giả đều nhận thấy đột biến mất đoạn 8bp rất ít gặp so với
các đột biến khác. Thậm chí Kharrat ở Tunisie hay Baumgartner ở áo
đã không tìm thấy mất đoạn 8bp gây thiếu 21-OH.
Một nghiên cứu ban đầu ở miền Bắc cũng cho thấy tỉ lệ cao đột biến
mất đoạn 8bp tơng tự chúng tôi (31,9%). Nên có lẽ đây là kiểu đột
biến gen CYP21 phổ biến nhất gây TSTTBS thiếu 21-OH ở Việt Nam.
Chúng tôi cha thể giải thích vì sao mất đoạn 8bp xảy ra với tỉ lệ cao
nh thế. Một số tác giả cho rằng việc chọn mẫu BN sẽ ảnh hởng đến tỉ lệ
đột biến gen. Ngoài ra, còn do yếu tố quần thể, mỗi dân tộc, mỗi quốc gia
mang một tỉ lệ bệnh TSTTBS và tỉ lệ các đột biến gen CYP21 khác nhau.
Trình tự nucleotide của mất đoạn 8bp (707-714 GAGACTAC) cũng
đã đợc phân tích bằng máy đọc tự động ABI 377, kết quả nh sau:

89 b
p

81 b
p

1 2
3 4
5
6
7
8
M

Tỉ lệ allen đột biến Pro30Leu là (1ì1)/(43ì2) = 1/86 = 1,2%.
Nghiên cứu TSTTBS thể cổ điển tại Nhật Bản, Koyama nhận thấy tỉ
lệ allen đột biến Pro30Leu là 1,1%, hay theo Lobato ở Tây Ban Nha là
0,8%. Các tỉ lệ này cũng tơng tự kết quả của chúng tôi.

196 b
p

153 b
p

1 2
3 4
5

6
7
10
9
M
8

16
Đột biến Pro30Leu tạo nên enzym 21-OH với hoạt tính 30-60%
bình thờng nên biểu hiện lâm sàng nhẹ nhàng. Điều này giúp giải
thích một phần vì sao Pro30Leu ít gặp ở BN thể cổ điển.
2.5. Các đột biến khác cha đợc xác định
Trong nghiên cứu này, tỉ lệ BN cha đợc phát hiện đột biến gen
CYP21 còn cao, 44,2%. Lý do là chúng tôi chỉ mới tiến hành phản ứng
PCR với những cặp mồi tơng ứng với các đột biến đã đợc phát hiện.

2 1
3
ĐHT 7 1 8
8bp đơn thuần
DHT 1 1 2
Pro30Leu DHT
1

1
Đột biến khác
Cha rõ kiểu gen
12
7 19
Tổng số

31 12
43
(ĐHT: đồng hợp tử, DHT: dị hợp tử,

: mất đoạn gen).

17
- Bảng 3.8 cho thấy có 7/8 trờng hợp đột biến I2g và 8/10 trờng
hợp mất đoạn 8bp có kiểu hình MM, tức hầu hết các đột biến gen I2g
và mất đoạn 8bp (nhóm A) liên quan với thể MM. Kết quả này phù
hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả nh White, Speiser, Wedell,
Wilson Mất đoạn 8bp và I2g là những kiểu đột biến gen CYP21 trầm
trọng gây mất hoạt tính enzym 21-OH, bệnh cảnh MM.
- Chúng tôi gặp 2 trờng hợp mất đoạn 8bp và 1 trờng hợp I2g có
kiểu hình NHĐT, không phù hợp với dự đoán từ kiểu gen bị đột biến

DHT
1 nữ
Khác
5 nam
7 nữ

Tổng
n=31
18 nam
13 nữ

Phì đại DV 1 3 - - 3 - - 2 9
Bìu thâm 2 3 1 - 2 - - 5 13
Phì đại ÂV - 1 - 1 2 1 1 6 12
Týp Prader - III - III IV IV IV II-IV II-IV
Nôn 3 3 1 2 7 1 1 12 30
Bỏ bú - - 1 - 2 - - 3 6
Tiêu chảy 3 2 - - 2 1 - 4 12
Mất nớc 2 3 - 2 6 1 1 12 27
Giảm cân 1 2 - 1 1 - 1 2 8
Xạm da 3 3 1 1 5 1 1 11 26

18
Hình 3.11.A. BN nữ Nguyễn Thế Nh. (MSBA 223460), thể MM.
Biểu hiện suy thợng thận cấp, mất nớc, giảm thể tích tuần hoàn. Bộ
phận sinh dục nữ bất thờng, nam hoá và phì đại âm vật.
Bảng 3.11. Đặc điểm lâm sàng thể NHĐT của các đột biến gen CYP21
I2g + 8bp 8bp
Kiểu gen
Lâm sàng

19
Hình 3.12. BN Phạm Thị H (MSHS 260099), thể NHĐT. Phát
triển thể lực và cơ bắp. Xuất hiện dấu hiệu dậy thì sớm, tuyến vú B2,
mọc lông mu P3, âm vật giống dơng vật, không có tinh hoàn.
- So sánh các biểu hiện lâm sàng, chúng tôi nhận thấy BN nữ ở cả 2
thể MM và NHĐT biểu hiện mức độ phì đại âm vật nặng hơn khi có
kiểu gen đột biến mất đoạn 8bp (Prader týp IV) và nhẹ hơn (Prader týp
III) khi có kiểu gen đột biến I2g hoặc I2g+8bp. Điều này cho thấy
rằng mất đoạn 8bp có lẽ là đột biến trầm trọng nhất.
Pinto, Torres và cs cũng nhận thấy thể bệnh và mức độ nam hoá bộ
phận sinh dục ngoài có liên quan với độ trầm trọng của đột biến gen.
Bảng 3.13. Biến đổi điện giải đồ của các kiểu đột biến gen CYP21
Xét nghiệm
Kiểu gen
Natri
(mmol/l)
Kali (mmol/l) Clo (mmol/l)
Đờng
(mmol/l)
I2g (n=8)
117,6 15,2 6,6 1,3 92,9 12,6 3,8 0,7
8bp (n=10)
120,2 14,5 6,5 1,6 95,7 8,7 5,7 0,8
I2g + 8bp (n=5)
129,6 10,9 5,3 1,3 97,6 8,4 4,6 1,8

Bảng 3.15. Biến đổi hormon của các đột biến gen CYP21
Hormon
Kiểu gen
Progest

hay dị hợp tử, p > 0,05.
- 5 trờng hợp dị hợp tử kép I2g+8bp có kiểu hình cả MM và
NHĐT. Kiểu gen I2g+8bp gây TSTTBS thể MM đã đợc mô tả bởi
Dain, Torres và cs. Ngợc lại, Tukel, Wilson đã phát hiện kiểu gen
I2g+8bp gây bệnh cảnh NHĐT. Nh vậy, kết quả nghiên cứu của
chúng tôi là hoàn toàn phù hợp.
Speiser cho rằng BN dị hợp tử kép 2 đột biến khác nhau thờng có
kiểu hình tơng ứng với kiểu gen bị đột biến ít trầm trọng hơn. Điều
này nói lên rằng dị hợp tử kép I2g+8bp có thể gây bệnh cảnh MM
hay NHĐT tùy thuộc vào hoạt tính enzym 21-OH đợc tổng hợp.
- Một BN đợc phát hiện dị hợp tử đột biến Pro30Leu có kiểu hình
MM. Về mặt lý thuyết, đột biến Pro30Leu vẫn duy trì một phần hoạt
tính enzym và gây bệnh cảnh TSTTBS thể KCĐ. ở đây, Pro30Leu gây
bệnh cảnh MM nên cũng khó lý giải một cách thật rõ ràng liên quan
kiểu gen kiểu hình.
Tác giả Dolzan, Weintrob đã tìm thấy kiểu gen Pro30Leu ở thể
NHĐT và KCĐ. Kharrat tìm thấy kiểu gen Pro30Leu+I2g ở thể MM.
4. Tình hình mang gen bệnh của một số thành viên gia đình
bệnh nhân TSTTBS
Gia đình số 1:

Hình 3.14. Gia hệ và kiểu gen các thành viên gia đình số 1.
I/
II/
II-9
II-8
(I2g+

Gia đình số 2:

Hình 3.15. Gia hệ và kiểu gen các thành viên gia đình số 2.
II-1
II/
I/
II-2

8bp
DHT I2
g

ĐHT 8bp
(I2g+8bp)
I/
II-1
II/
II-3
II-2
ĐHT I2g + 8bp
(

)
I2
g
I/
II-1 II-2
I2
g

DHT I2
g

(

)
II-1 II-2

I/
II/
(

)
(

)
(

)
(

)
(

)