VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN
GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN
TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO
THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN
GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN
TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM
SINH DO THIẾU HỤT 11 BETA
HYDROXYLASE
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. BS. Vũ Chí Dũng, trưởng
khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền và TS. BS. Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa
Di truyền và Sinh học phân tử đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện và chia sẻ những
kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận án.

i


Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng, tình yêu thương vô bờ bến đối với bố
mẹ, gia đình, Minh Anh và bạn bè tôi, đã ủng hộ và cổ vũ cho tôi trong suốt
thời gian học tập và làm việc.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và tình yêu thương sâu sắc tới chồng
tôi, BS. Đào Trung Dũng và hai con gái, Phương Linh-Minh Châu. Tình yêu,
sự chia sẻ, ủng hộ và những hy sinh thầm lặng của họ là chỗ dựa vững chắc,
giúp tôi thêm nghị lực để hoàn thành luận án này.
Lời cuối cùng, tôi xin dành tặng tới Người. Người đã cho tôi thấy tôi là
ai, con đường tôi đang đi và sẽ đi, để tôi thấy trong tôi luôn có một tình yêu
thương vô điều kiện và nhiệt huyết trong cuộc sống và công việc.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2018

Nguyễn Thị Phương Mai

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:

1.1.3. Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase………
1.2.

Định nghĩa, cơ sở hóa sinh và sinh lý bệnh học của TST

do thiếu hụt 11β-hydroxylase……………………………

1.2.1. Định nghĩa TSTTBS và các enzyme tham gia tổng h

cortisol………………………………………………

1.2.2. Cơ sở hóa sinh của bệnh TSTTBS…………………

1.2.3. Sinh lý bệnh TSTTBS do thiếu 11β-hydroxylase…
1.3.

Di truyền phân tử của bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase

1.3.1. Gen CYP11B1……………………………………………

1.3.2. 11β-hydroxylase……………………………………
1.4.

Đặc điểm lâm sàng bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……

1.4.1. Thể cổ điển…………………………………………

1.4.2. Thể không cổ điển……………………………………

1.4.3. Người mang gen/dị hợp tử…………………………

2.4. Phương pháp nghiên cứu………………………………………
2.4.1. Quy trình thu thập và tách chiết mẫu nghiên cứu………..
2.4.2. Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1…………………...
2.4.3. Phương pháp phân tích đột biến mới……………………..
2.4.4. Các phương pháp tin sinh học…………………………….
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………..
3.1. Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1……………………......
3.1.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu…………………..
3.1.2. Kết quả khuếch đại gen CYP11B1………………………..
3.1.3. Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1…………………
3.1.4. Mối tương quan kiểu gen- kiểu hình các đột biến mới…...
3.1.5. Mối tương quan kiểu gen p.R43Q- kiểu hình…………….
3.2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới trên gen
CYP11B1 tới hoạt tính enzyme CYP11B1……………………
3.2.1. Đột biến p.R51K………………………………………….
3.2.2. Đột biến p.E147D-p.N152K……………………………...
3.3. Phân tích sự ảnh hưởng của đột biến mới trên gen CYP11B1
tới cấu trúc enzyme CYP11B1………………………………..
3.3.1. Kết quả mô hình cấu trúc 3 chiều của enzyme CYP11B1..
3.3.2. Ảnh hưởng của đột biến mới tới cấu trúc của enzyme
CYP11B1………………………………………………….
v


3.3.3. Đột biến vùng trượt gen IVS6+5G>T…………………….
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ………………………………
4.1. Các đột biến phát hiện trên gen CYP11B1 ở các bệnh nhân
nghiên cứu………………………………………………………
4.2. Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt tính enzyme
CYP11B1………………………………………………………..

21OH
21OHD
3D
ACTH
AD
Cl
CMO
CMO I
CMO II
CRH
CVS
CYP
DHEA
DHEAS
DMEM


DMSO
DNA
dNTPs
DOC
E.Coli
EDTA
F
FBS
ffDNA
FSH
GC-MS
HGMD
Hc11B1

TEMED
THS
TSTTBS
WT

ix


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu
enzyme vỏ thượng thận……………………………………….
Bảng 1.2. Phân loại các đột biến trên gen CYP11B1 dựa trên các nghiên
cứu in-vitro……………………………………………………
Bảng 1.3. Các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hoá sinh và đặc điểm di
truyền của các bệnh liên quan tới thiếu hụt isozyme 11βhydroxylase……………………………………………………
Bảng 2.1. Trình tự đoạn Oligonucleotides………………………………
Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm RF1, RF2……………………….
Bảng 2.3. Thành phần gel tách/gel cô polyacrilamide…………………..
Bảng 3.1. Kiểu đột biến gen CYP11B1 phát hiện trên các bệnh nhân
nghiên cứu…………………………………………………….
Bảng 3.2. Kiểu gen- kiểu hình của các bệnh nhân có đột biến mới……..
Bảng 3.3. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-010…………
Bảng 3.4. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-011…………
Bảng 3.5. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-006 và MS.
CYP11B1-008………………………………………………..
Bảng 3.6. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-004…………
Bảng 3.7. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-012…………
Bảng 3.8. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-005…………
Bảng 3.9. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-002…………

Hình 3.13.
Hình 3.14
Hình 3.15.
Hình 3.16.
Hình 3.17.
xi


Hình 3.18.
Hình 3.19.
Hình 3.20.
Hình 3.21A.
Hình 3.21B.
Hình 3.21C.
Hình 3.21D.
Hình 3.22.
Hình 3.23.
Hình 3.24.
Hình 4.1.
Hình 4.2.
Hình 4.3.
Hình 4.4.

xii


1

MỞ ĐẦU
Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một nhóm các bệnh di

và tăng huyết áp. Các xét nghiệm hoá sinh thường dựa trên mức độ tăng lên
của 11-deoxycortisol và 11-deoxycorticosterol huyết thanh kết hợp với sự gia
tăng nồng độ của adrogen thượng thận.
TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase có các dấu hiệu đặc trưng nhưng
cũng còn nhiều thách thức trong vấn đề chẩn đoán và điều trị. Sự đa dạng về
kiểu hình, tỷ lệ phát hiện thấp là những lý do làm chậm chẩn đoán 11βhydroxylase. Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam còn ít nghiên cứu về sự
ảnh hưởng của các loại đột biến tới chức năng hoạt động của 11βhydroxylase. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến
gen CYP11B1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt
11

beta hydroxylase” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng

tỏ nguyên nhân gây bệnh rối loạn chuyển hoá 11β-hydroxylase ở người Việt
Nam. Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học giải thích
được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh hiệu quả, đúng
hướng để nâng cao chất lượng cuộc sống. Hơn nữa, kết quả nghiên cứu cũng
được ứng dụng phòng bệnh thông qua thực hành tư vấn di truyền, là cơ sở cho
chẩn đoán và điều trị trước sinh khi có chỉ định.
Mục tiêu của đề tài:
1.

Sàng lọc các đột biến trên gen CYP11B1 trên các bệnh nhân TSTTBS do
thiếu 11β-hydroxylase.


3

2.

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt lực 11βhydroxylase trong tế bào động vật nuôi cấy.

lâm sàng là TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase trong đó có 05 đột biến
mới p.R51K, p.E147D, p.N152K, IVS6+5G>T, p.Y395X

2.

Các đột biến mới p.R51K, p.E147D, p,N152K làm giảm hoạt tính của 11βhydroxylase tương ứng là 29%, 48% và 36%.

3.

Dự báo đột biến IVS6+5G>T có khả năng ảnh hưởng tới cấu trúc mRNA
bằng phần mềm MaxEnt.

4.

03 đột biến mới p.R51K, p.E147D, p.N152K đều có ảnh hưởng đến liên
kết hydro với axit amin bên cạnh trong mô hình cấu trúc ba chiều của 11βhydroxylase.


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 1951, các nhà khoa học đã nhận thấy có một số lượng bệnh nhân
TSTTBS có dấu hiệu như tăng huyết áp, có các triệu chứng của thiếu hụt
aldosterone, tăng natri, hạ kali máu. Các bệnh nhân này sau đó được phát hiện
có sự thiếu hụt 11 - hydroxylase. Đây là các dấu hiệu phân biệt giữa bệnh
nhân TSTTBS do thiếu hụt 11 - hydroxylase với các bệnh nhân TSTTBS do

chiều cao và cân nặng hơn 97 bách phân vị, nam hoá hoàn toàn (Prader type
IV, lỗ đái thấp, phì đại âm vật). Bốn anh chị của bệnh nhân đã tử vong ngay
sau đẻ (Helmberg và cs, 1992). Năm 1995, Al-Jurayyan báo cáo 78 trẻ Ả rập
mắc TSTTBS trong vòng 10 năm. Trong số đó, có 20 (25,6%) bệnh nhân từ
11 gia đình có tiền sử mắc TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase. Hiện tượng
dậy thì sớm giả ở trẻ nam và các mức độ nam hoá ở trẻ gái đã dẫn đến 7 bệnh
nhân bị chẩn đoán nhầm về giới tính (58,3%). 3 trẻ sơ sinh ở thể mất muối
trước khi được điều trị (Al-Jurayyan, 1995). Năm 2000, Clark đã mô tả 2
bệnh nhân mắc TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thể không cổ điển (P.
A. Clark, 2000) với tỷ lệ nam hoá bào thai và cao huyết áp thấp hơn so với thể
cổ điển. Bệnh nhân đầu tiên là trẻ trai 6 tuổi có triệu chứng dậy thì sớm ngoại
biên. Bệnh nhân có chiều cao trung bình so với tuổi và có huyết áp
ở

giới hạn trên của bình thường. Bệnh nhân thứ 2 là trẻ gái 1 tháng tuổi với

triệu chứng âm vật phì đại nhưng không có bìu chẻ đôi. Bệnh nhân có huyết
áp bình thường so với tuổi và có nồng độ 11-deoxycortisol tăng.


6

1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Từ những năm 2000, một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân
tử để sàng lọc các đột biến trên gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS như tác giả
Võ Kim Huệ, Thái Thiên Nam đã ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc đột biến
mất 8bp ở các bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam cũng như các thành viên
trong gia đình của bệnh nhân này (Thái Thiên Nam, 2002, Võ Kim Huệ,
2000). Năm 2006, tác giả Trần Kiêm Hảo cũng ứng dụng kỹ thuật PCR để
sàng lọc một số đột biến phổ biến trên các bệnh nhân TSTTBS tại Bệnh viện

Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, et al, 2015). Những nghiên cứu này là rất cần
thiết và sẽ cung cấp các thông tin toàn diện hơn về các thể bệnh TSTTBS do
thiếu các enzyme khác nhau đang lưu hành tại Việt Nam.
1.1.3. Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase
Tỷ lệ mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase thống kê trong các quần thể
còn rất hạn chế. Thông thường, tỷ lệ thiếu hụt 11β-hydroxylase chiếm khoảng
5-8% tổng số các bệnh nhân mắc hội chứng TSTTBS (Merke và Bornstein,
2005, White và Speiser, 2000, Zachmann và cs, 1983). Nghiên cứu tại Anh
(Arlt và cs, 2010) cho thấy chỉ có 3/203 bệnh nhân TSTTBS mắc bệnh thiếu
hụt 11β-hydroxylase (1,5%), và các bệnh nhân này chỉ chiếm khoảng 3-5% ở
thể cổ điển. Tuy nhiên, nghiên cứu quốc gia tại Thuỵ Điển nghiên cứu trên
90% các bệnh nhân TSTTBS, chỉ có 1/612 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt
11β-hydroxylase (0,2%) (Gidlof và cs, 2013, Strandqvist và cs, 2014). Sự
khác biệt về tỷ lệ có thể do cách chọn mẫu hoặc do đặc trưng của quần thể
nghiên cứu. Tần suất bệnh TSTTBS ở trẻ sơ sinh khoảng 1/200.000 (White và
cs, 1994). Tần suất bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thay đổi từ
0,8-8% trong các nghiên cứu trên các phụ nữ mắc hội chứng rậm lông và
cường androgen (Azziz và cs, 1991, Eldar-Geva và cs, 1990). Tần suất trẻ
mắc bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase cao nhất được tìm thấy ở
Israel trên người Do Thái di cư từ Morocco. Tần suất mắc bệnh ở nhóm người
này khoảng từ 1/5000-7000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ người mang gen từ 1,2-1,4%
(Rosler và cs, 1992, Rosler và White, 1993).


8

Bảng 1.1. Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu enzyme vỏ thượng thận
Enzyme thiếu hụt

Tỷ lệ mới mắc và


CYP17A

17,20-lyase

10q21-22

(P4450c17)


10

Steroidogenic
regulatory
(StAR)

acute STAR
protein 8p11.2