1
Bộ khoa học và công nghệ
Bệnh viện K BáO CáO TổNG KếT

nghiên cứu xác định đột biến gen bcra1, bcra2
trong ung th vú

Thuộc đề tài:
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ cao trong chẩn đoán và điều
trị một số bệnh ung th thờng gặp
Mã số: KC 10.14/06.10

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phạm Duy Hiển
Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS. Tạ Văn Tờ
TS. Nguyễn Văn Định

Cơ quan chủ quản: Bệnh viện K


Những phụ nữ có đột biến gen BRCA1 và BRCA2 sẽ có nguy cơ mắc
ung thư vú cao hơn so với những người không mang gen đột biến này. Ở Mỹ
tính trung bình 1 phụ nữ có khả năng mắc ung thư vú là 12% nếu họ sống đến
tuổi 90 và ung thư buồng trứng là 1,8%. Nhưng nếu một phụ nữ có đột biến
gen BRCA có thể tăng khả năng mắc ung thư vú lên đến 85% [21].
Tại châu Á, từ nă
m 1995 các nghiên cứu về đột biến gen BRCA1 và
BRCA2 trong ung thư vú và ung thư buồng trứng đã được tiến hành tại
Philipine [10], Mông Cổ [15], Thái Lan [38], và Singapor [26]. Những năm
gần đây, nhờ có sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học
đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được nhiều đột biến điểm trên gen
BRCA1 và BRCA2. Những đột biến nguyên khởi liên quan đến ung thư vú

3
được nghiên cứu ở nhiều tộc người khác nhau và có liên quan mật thiết với
căn bệnh ung thư vú là đột biến 185delAG, 5382insC trên gen BRCA1 và
6174delT trên gen BRCA2. Các đột biến này đã được thống kê là xuất hiện
với tần suất giao động giữa các quốc gia. Việc phát hiện người bệnh mang đột
biến nguyên thủy trong các gia đình bệnh nhân ung thư vú sẽ rất có ý nghĩa
trong việc phòng bệnh, tiên lượng và điều tr
ị dự phòng. Mặt khác việc phát
hiện người lành mang gen đột biến cũng giúp các nhà tư vấn di truyền đưa ra
lời khuyên hoặc lời cảnh báo về một nguy cơ ung thư vú cho những thành
viên trong gia đình họ.
Theo hiểu biết của chúng tôi, hiện nay nước ta mới chỉ có nhóm tác giả
Lê Thị Minh Chính nghiên cứu đột biến gen này trên bệnh nhân ung thư vú
với số mẫu 24 bệnh nhân tại bệnh viện K. Kết quả không phát hiệ
n thấy đột
biến 185delAG ở gen BRCA1 và 6174delT ở gen BRCA2 [2]. Một câu hỏi
đặt ra liệu tần suất đột biến 2 gen này ở phụ nữ Việt Nam có thực sự thấp
Hình 1.1. Sơ đồ nhiễm sắc thể 17 và vị trí của gen BRCA1
(Nguồn:www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps)
- Cấu trúc gen BRCA1: Gen BRCA1 gồm 24 exon và 2 intron, có kích thước
khoảng 80 kb, từ cặp nucleotide 92500 - 173688, tương đương 81188 bp.
Trong đ
ó, exon 11 lớn nhất, chiếm 55% chiều dài gen BRCA1. Kích thước
phiên mã của mARN là 7,8 kb, mã hoá cho phân tử protein gồm 1863 aa [8].

5

Hình 1.2. Cấu trúc gen BRCA1 [41]
- Chức năng gen BRCA1: Gen BRCA1

là một loại gen được biết đến như là
gen ức chế tạo u, nó có chức năng ngăn ngừa sự phát triển và phân chia nhanh
chóng hoặc không kiểm soát được của các tế bào. Mặt khác gen BRCA1 còn
sản sinh ra 1 loại protein tham gia trực tiếp vào việc sửa chữa trong quá trình
tái bản DNA, duy trì sự ổn định thông tin di truyền của tế bào. Ngoài ra
BRCA1 còn có chức năng điều hòa sự phát triển của biểu mô tuyến vú. Các
nghiên cứu đã phát hiện h
ơn 1000 đột biến ở gen BRCA1, trong số đó nhiều
đột biến làm tăng nguy cơ ung thư vú [37].
1.2 Vị trí, cấu trúc và chức năng gen BRCA2
Gen BRCA2 do GS Michael Stratton và TS Richard Wooster (Viện
nghiên cứu ung thư Anh) phát hiện năm 1995 [51].

thành phố Melbourne - Australia: loại gen có tên gọi là BRCA1 bị biến đổi,
nó sẽ chiếm tới 65% nguyên nhân gây ung thư vú ở phụ nữ. Phát hiện này
được đánh giá là bước đột phá, đặt nền móng quan trọng trong quá trình điều
trị hiệu quả căn b
ệnh nguy hiểm này [24].

7
Năm 1993 Easton và cs cho rằng gen BRCA1 rất dễ bị tổn thương, ước
tính tỷ lệ đột biến gen BRCA1 là 1/700 phụ nữ, chiếm khoảng 71% trong số
các đột biến gen và nguy cơ ung thư vú trong số này là 62%, ung thư buồng
trứng là 11% ở tuổi 60 [14].
Năm 1996 Marcus và cs cho thấy ung thư vú do đột biến gen BRCA1
thường biểu hiện ở tuổi trẻ hơn và giai đoạn sớm hơn so với ung thư vú nói
chung (tuổi trung bình là 42,8 so v
ới ung thư vú chung là 62,9). Những u này
thường biểu hiện tỷ lệ tăng sinh cao, độ mô học cao và thường ở dạng dị hợp
tử [30]. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Tavani và cs (1999),
phụ nữ có đột biến gen BRCA1 thì nguy cơ phát triển ung thư vú đối bên là
64% và nguy cơ ung thư buồng trứng là 44 - 63% [48]. Roa và cs (1996) lại
cho rằng đột biến gen BRCA1 chiếm 8% ung thư vú trước tuổi phu; 5% sau
tuổi 30 và 41% sau tuổi 50 [44].
N
ăm 2000 Foulkes và cs cho thấy có 13,6% bệnh nhân ung thư vú
mang đột biến trong gen BRCA1. Nhưng một điều đáng quan tâm hơn là
những bệnh nhân mang đột biến BRCA1 có tỷ lệ tử vong cao hơn rất nhiều so
với những bệnh nhân không mang đột biến này (50% / 89,6%) [22].
Năm 2002 Maria và cs ước tính sự phổ biến của các đột biến trong gen
BRCA1 ở những trường hợp mắc ung thư vú được chọn lựa ngẫu nhiên tại
Philippin là 5,1% [31].
1.3.1 Tần su

UTV
≤50 tuổi
UTBT
tuổi bất kỳ
Đột biến

UTV
≤50 tuổi
UTBT
tuổi bất
kỳ
185delAG 15/103 3/103 3884insA 1/103 1/103
C61G 8/103 0 3889delAG 2/103 0
448delAG 2/103 1 3977del4 1/103 1/103
E143X 7/103 3 E908X 4/103 0
816delGT 6/103 1/103 E1060X 1/103 0
1135insA 1/103 2/103 Q563X 2/103 0
1205delGA 0/103 1/103 Q780X 1/103 1/103
1294del40 4/103 2/103 4280delTC 3/103 0
1374delG 3/103 1/103 R1443X 1/103 0
1832del5 4/103 2/103 R1835X 3/103 1/103
2072del4 1/103 2/103 4601delAA 1/103 0
2190delA 1/103 0 Y1563X 2/103 0

9
2329delCA 1/103 2/103 5296del4 4/103 1/103
2576delC 3/103 2/103 5382insCT 0/103 1/103
3600del11 1/103 1/103 5382insC 11/103 6/103
3604delA 1/103 4/103 W1837X 5/103 1/103
3875del4 3/103 1/103

10
Bảng 1.4. Các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA1 [28]
Các đột biến Exon Codon Các đột biến Exon Codon
185 delAG 2 23 2804delAA 11c 895
C61G 5 61 3166ins5 11c 1016
331+1G>A 5 intron 3600del11 11d 1161
1135insA 11a 339 E1250X 11d 1250
1294del40 11a 392 3875del4 11d 1252
1675delA 11b 519 4184del4 11d 1355
Q563X 11b 23
IVS12-
1632del13835
12 intron
Q780X 11b 61 R1443X 13 1443
2800delAA 11c intron 5382insC 20 1756

1.3.2 Tần suất đột biến 185delAG và 5382insC trên gen BRCA1.
Tuy có rất nhiều đột biến xảy ra trên gen BRCA1, nhưng những đột
biến xuất hiện với tần số cao hơn các đột biến khác và có liên quan mật thiết
đến ung thư vú là đột biến 185delAG và 5382insC.
David B. Berman (1996), nghiên cứu 163 cá thể bị ung thư vú và hoặc
ung thư buồng trứng (ung thư buồng trứng ở các lứa tuổi, ung thư vú dưới
tuổi 50) người Ashkenazi. Kết qu
ả cho thấy đột biến 185delAG chiếm tỷ lệ
khá cao 13/163 (7,9%) [9].
Roa và cs (1996), nghiên cứu 3000 bệnh nhân bị ung thư vú người Do
Thái, các mẫu này được chọn lựa một cách ngẫu nhiên. Kết quả cho thấy đột
biến 185delAG và 5382insC là những đột biến thường xuyên xảy ra trên gen
BRCA1 lần lượt chiếm tỷ lệ 1,09% và 0,13% [103].
Ellen và cs (1999), nghiên cứu 412 bệnh nhân người Do Thái bị ung

ư vú nói chung và những gia đình có tiền sử ung
thư vú và hoặc ung thư buồng trứng nói riêng.
Ewa và cs (2000), phân tích một số đột biến dòng mầm: 5382insC,
185delAG, C61G và 4153delA trong gen BRCA1 ở 148 gia đình bị ung thư
vú người Ashkenazi. Kết quả cho thấy đã phát hiện 15 gia đình mang đột biến
dòng mầm trong gen BRCA1, trong đó có các đột biến là: 5382insC,
185delAG và C61G. Đột biến 185delAG có 2/15 (13,3%) trong tổng số các

12
gia đình có đột biến, đột biến 5382insC là đột biến dòng mầm hay xảy ra nhất
11/15 (73%) trên gen BRCA1 [17].
Ewa và cs (2002), nghiên cứu 47 gia đình bị ung thư vú /ung thư buồng
trứng người Ba Lan - Upper Silesia. Kết quả phát hiện thấy 11 (23,4%) gia
đình mang đột biến 5382insC. Tần suất của các đột biến thông thường này có
thể so sánh với những kết quả nghiên cứu trước ở người Do Thái Ashkenazi,
người Aixơlen và người Nga là tương đối cao. Tuy vậy tầ
n suất này cũng
không thể đại diện cho toàn dân số Ba Lan [18].
Lilian và cs (2004), nghiên cứu 18 đột biến thường xảy ra trong gen
BRCA1 ở 5 Exon (2,5,11,13 và 20) và 2 Intron (5 và 12) trong 63 gia đình bị
ung thư vú và/hoặc ung thư buồng trứng người Chi lê (bảng 5). Trong 18 đột
biến này, nhóm tác giả đi sâu nghiên cứu 5 đột biến gen BRCA1 đó là
185delAG (Exon 2), 1675delA (Exon 11b), E1250X (Exon 11d), R1443X
(Exon 13) và 5382insC (Exon 20). Qua 98 người có quan hệ họ hàng trong 63
gia đình bị ung thư vú và / hoặc ung thư buồng trứng. Kết quả cho thấy 5 gia
đình có đột biế
n ở gen BRCA1 (chiếm 7.93%), nhưng chỉ có 3 gia đình
(chiếm 4.76%) mang hai đột biến 185delAG ở Exon 2 và 5382insC ở Exon
20. Đột biến 185delAG là loại đột biến xảy ra với tần số cao nhất trong gen
BRCA1 [28].

1.4 Tình hình nghiên cứu gen BRCA2 trên thế giới
Các đột biến trong gen BRCA2 chiếm một lượng đáng kể trong các
trường hợp bị ung thư vú di truyền [25]. Một nghiên cứu mới đây về ung thư
vú gia đình cho thấy nguy cơ gây ung thư vú của gen BRCA2 chiếm khoảng
60-65% ở tuổi 70, 83-87% ở tu
ổi 80 người Ashkenazi [34]. Sự biến đổi ở gen
BRCA2 không phải chỉ có một mà có thể tới hàng chục thậm chí hàng vài
trăm đột biến và những đột biến trên gen BRCA2 không chỉ liên quan đến
ung thư vú mà còn liên quan đến ung thư buồng trứng [33].
1.4.1 Tần suất các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA2
Trên thế giới, các đột biến được tìm thấy trên gen BRCA2 xuất hiện
với tần suất rất khác nhau. Khi giải trình tự gen BRCA2 thấ
y có những thay
đổi rất lớn ở những gia đình có quan hệ huyết thống tại nhiều nước và các

14
miền dân số khác nhau, trong đó ở Anh là 9%; Pháp là 18%; Canada là 16%;
Mỹ là 25%; Ở Thụy Điển và Hunggary thì tỷ lệ đó là 35% [13].
Thomas và cs (1998) phát hiện 31 đột biến gen BRCA2 của bệnh nhân
UTV và hoặc UTBT tại các phòng khám của Mỹ [50].
Bảng 1.5. Các đột biến được phát hiện ở gen BRCA2 [50].
Đột biến Tần suất Đột biến Tần suất Đột biến Tần suất
314delTT 1/53 3972del4 2/53 E1953X 2/53
886delGT 2/53 4706del4 4/53 7172del4 0
983del4 4/53 5466insT 0 7297delCT 0
1982delA 2/53 5950delCT 3/53 7990delA 2/53
2041insA 2/53 6174delT 4/53 8141del5 1/53
2041insA 3/53 6426delTT 4/53 9132delC 2/53
Q321X 2/53 6503delTT 2/53 9558ins3del5 0
2157delG 1/53 6696delTC 1/53 R3128X 1/53

11 2 11,8 3386T>G 11 1 5,9
6503delTT
11 1 5,9
3036delACAA
11 1 5,9
6174delT
11 1 5,9
Tổng số
18
6137C>A
11 2 11,8
295G>T
2 4 100
5950delCT
11 2 11,8
Tổng số
4
5368delATTT
11 1 5,9
9138insA
23 1 100
5056insG
11 3 17,6
Tổng số
1
4859insA
11 2 11,8
860–1G>A
8 2 100
4329insA

6174delT chi
ếm tỷ lệ 28,6% (6/21). Ở nhóm ung thư vú tỷ lệ bệnh nhân mang
đột biến 6174delT chiếm 4,5% (8/178). Nhóm bệnh nhân ung thư cả 2 vú thì
tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến này lại là rất cao 7,1% độ tuổi dưới 40; 3,3% ở
tuổi 40-50; 4,5% ở tuổi trên 50 [12]. Trong khi đó nghiên cứu của Antoniou
(2003) thì tỷ lệ bệnh nhân người Do Thái mang đột biến 6174delT là 9.4% ở
tuổi 40; 10.8% ở tuổi 50; 21.6% ở tuổi 60 và 58.1% ở tuổi 70 [6].
Flora và cs (1998), nghiên cứu 268 phụ nữ Do Thái ung th
ư vú không
liên quan đến tiền sử gia đình. Kết quả cho thấy 8/268 (3%) bệnh nhân mang
đột biến 6174delT trên gen BRCA2 [20].
Theo Pak Cheung và cs (1999), nghiên cứu 66 phụ nữ người Do Thái bị
ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng. Kết quả phát hiện ra 3/66 (4,5%)
bệnh nhân mang đột biến 6174delT trên gen BRCA2 [36].
Ellen và cs (1999), nghiên cứu 412 bệnh nhân người Do Thái bị ung
thư vú. Kết quả đã phát hiện 15/412 (3,6%) bệnh nhân mang đột biến
6174delT gen BRCA2. Độ tuổi TB của những bệnh nhân này là 46,4 [16].
Foukes và cs ( 2000), bằng việc gi
ải trình tự gen BRCA2 của 118 bệnh
nhân ung thư vú người Do Thái Ashkenazi có độ tuổi dưới 65. Kết quả cho
thấy có 3/118 (2,5%) cá thể mang đột biến 6174delT trong gen BRCA2 [22].
17
1.5. Tình hình nghiên cứu gen BRCA1 và BRCA2 ở Việt Nam.
Lê Thị Minh Chính và cs (2004), đã tiến hành nghiên cứu đột biến gen
BRCA1 và BRCA2 ở 24 bệnh nhân ung thư vú được thu thập ngẫu nhiên tại
bệnh viện K Hà Nội. Kết quả cho thấy không phát hiện thấy đột biến
185delAG và 6174delT (những đột biến khá phổ biến ở các bệnh nhân ung
Hình 1.5. Hình ảnh minh họa giải trình tự một đoạn DNA
(Nguồn: Sanger cequencing read display.gif)
1.6.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR được Karl Mullis người Mỹ thực hiện vào năm 1985. Từ
đó đến nay kỹ thuật này được sử dụng rất phổ biến và ứ
ng dụng rất nhiều
trong các thí nghiệm về sinh học phân tử.
a, Nguyên tắc của phản ứng PCR.
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi
tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA
polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) với nguyên liệu là 4 loại
deoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Enzym DNA - polymerase
xúc tác tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi
sự có m
ặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu
của trình tự DNA khuôn.
Taq-polymerase là một loại DNA - polymerase (tách chiết từ vi khuẩn
chịu nhiệt Thermus aquaticus), còn mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có
khả năng bắt cặp với một đầu của mạch khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài
mồi để hình thành đoạn mới. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụ
ng
để làm khuôn cho các phản ứng tiếp theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng phân tử
DNA tăng gấp đôi, vậy sau n chu kỳ số lượng sản phẩm PCR là 2
n
, đủ số

cách giữa hai đoạ
n gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định
bởi đầu tận 5' của 2 đoạn gen mồi.
Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5-3%, chạy cùng với
marker để so sánh đối chiếu độ lớn của đoạn DNA cần quan tâm.
20

Hình 1.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR
(Nguồn: Vierrstraete, 1999)
c, Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng để phát hiện đột biến gen BRCA.
* PCR đơn mồi (monoplex PCR): Đây là kỹ thuật PCR kinh điển nhất. Mỗi
phản ứng PCR sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một

21
alen đột biến không có vị trí đặc hiệu cho enzyme cắt, nghĩa là độ lớn của
alen bình thường và alen đột biến chênh nhau khoảng 20 bp sau khi sử dụng
enzyme cắt. Qua điện di gel agarose 3% ta có thể dễ dàng phát hiện các alen
đột biến [12].
a b
Hình 1.7. Điện di đồ phát hiện ĐB 6174delT và 185delAG (Dvora 1997)
a, Phân tích giới hạn (BbrPI) của đột biến 6174delT; b, Phân tích giới hạn
(HinfI) của đột biến 185delAG; H: Dị hợp tử; N: bình thường; u: Không cắt
Năm 2004 Lilian Jara và cs cũng sử dụng enzyme cắt HinfI và DdeI để
phát hiện đột biến 185delAG gen BRCA1 và 5382insC gen BRCA2 của 63
gia đình người Chi Lê. Sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel agarose 3%, so
sánh với chỉ thị DNA để phát hiện alen đột bi
ến [28].
*PCR đa mồi (multiplex PCR): PCR đa mồi là phương pháp PCR sử dụng
đồng thời nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau để nhân các đoạn DNA đặc trưng
khác nhau trên một phân tử DNA hoặc trên các phân tử DNA khác nhau
[36,37].

4 Đột biến 185delAG 9 Đột biến 5382insC và 6174delT
CÁC BƯỚC TRONG QUY TRÌNH CHUẨN CỦA KÝ THUẬT PCR ĐA THÀNH PHẦN
Bước 1: Chọn chuỗi mồi
- GC = 30%
- Kích thước 20 bp hoặc dài hơn
- Sản phẩm khuếch đại được điện di riêng rẽ
trên gel
Bước 2: Thử nghiệm/ghép đôi
các cặp mồi
- mồi xuôi với mồi ngược
- Chạy chương trình Blast để kiểm tra lại
trình tự các mồi
Bước 3: PCR ở từng vị trí
- Khuếch đại từng vị trí một trong cùng điều
kiện
- Dùng Buffer 1x, không có các thành phần
phụ
- Chỉ điều chỉnh điều kiện của chu kỳ
Bước 4: PCR đa thành phần:
Trộn các mồi với tỷ lệ tương đương
- 0,1-0,4 µM với mỗi mồi
- Sử dụng chương trình PCR từ bước 3
- Chỉ điều chỉnh điều kiện của chu kỳ
Bước 5 A. Nếu các băng xuất hiện mờ thì:
a, Tăng thời gian bắt cặp
b, Giảm nhiệt độ xuống còn 62-68
o
C
c, Giảm nhiệt độ thực hiện phản ứng thành từng
bước nhỏ (2

e, Kết hợp Ca, Cb, Cc, Cd
Bước 5 D. Nếu xuất hiện băng không đặc hiệu
a, Với băng dài: tăng nồng độ Buffer lên 1,4-2x
b, Với băng ngắn: Giảm nồng độ Buffer xuống còn 0,7-
0,9x
c, Tăng dần nhiệt độ thực hiện quy trình
d, Giảm nồng độ DNA và enzyme
e, Tăng nồng độ MgCl
2
lên 3, 6, 9 và 12 mM nhưng giữ
nguyên nồng độ dNTP ở mức 200 µM đối với mỗi băng
f, Kết hợp Da, Db, Dc, Dd, De
Bước 5 E. Không có các trường hợp trên thì:
a, Sử dụng các thành phần khác: BSA 0,1-0,8 µg/µl
b, Sử dụng các thành phần khác 5% (v/v) DMSO hoặc glycerol
c, Kiểm tra lại mối tương quan giữa các mồi
d, Tha
y
đổi tất cả các
p
hươn
g

p
há
p
và sử dụn
g
nồn
g

24CHƯƠNG 2
Hình 1.9. Phát hiện các đột biến 158delAG, 5382insC và 6174delT bằn
g

Real-Time PCR (Scort và cs, 2006).
1,
Số chu kỳ của phản ứng PCR; 2, Chu kỳ nhiệt các đột biến và dạng bình
thường 25
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu gồm 150 bệnh nhân nữ ung thư vú được chẩn

Mỹ
6 Bể ổn nhiệt Eppendorf Đức
7 Nồi khử trùng Cooperation Mỹ
8 Quang phổ kế Dioderray
spectophotometer 8452A
Thermo
Mỹ
9 Máy ly tâm lạnh Hitachi Nhật