VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN
GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN
TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH
DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2018


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU……………………………………………………………...

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………….....

4

1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase………..

4

1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới……………………….


16

1.3.1. Gen CYP11B1…………………………………………………

16

1.3.2. 11β-hydroxylase…………………………………………

18

1.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase………...

22

1.4.1. Thể cổ điển………………………………………………

22

1.4.2. Thể không cổ điển……………………………………….

26

1.4.3. Người mang gen/dị hợp tử……………………………….

27

1.4.4. Một số các đặc điểm lâm sàng khác……………………..

27


37

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

39

2.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………..

39

2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân………………………………

39

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ………………………………………..

40

2.2. Đạo đức trong nghiên cứu……………………………………...

40

2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu………………………………..

41

2.3.1. Hóa chất nghiên cứu……………………………………...

41


54

3.1.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu…………………..

54

3.1.2. Kết quả khuếch đại gen CYP11B1………………………..

54

3.1.3. Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1…………………

56

3.1.4. Mối tương quan kiểu gen- kiểu hình các đột biến mới…...

58

3.1.5. Mối tương quan kiểu gen p.R43Q- kiểu hình…………….

68

3.2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới trên gen
CYP11B1 tới hoạt tính enzyme CYP11B1……………………

73

3.2.1. Đột biến p.R51K………………………………………….


4.1. Các đột biến phát hiện trên gen CYP11B1 ở các bệnh nhân
nghiên cứu………………………………………………………

84

4.2. Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt tính enzyme
CYP11B1………………………………………………………..

88

4.2.1. Đột biến p.R51K………………………………………….

88

4.2.2. Đột biến p.E147D/p.N152K……………………………...

89

4.2.3. Đột biến Y395X…………………………………………..

91

4.3. Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới cấu trúc enzyme
CYP11B1………………………………………………………..

92

4.3.1. Đột biến thay thế axit amin……………………………….

93


Phụ lục 3. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch các mẫu DNA tách từ
máu ngoại vi của các bệnh nhân…………………………..

6

Phụ lục 4. Kiểu gen và kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu……………..

7

vi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

11βOH

11β-hydroxylase, enzyme
CYP11B1, 11-beta-hydroxylase

11βOHD

11β-hydroxylase deficiency

Thiếu hụt 11β-hydroxylase


Ba chiều

ACTH

Adrenocorticotrophin hormone

Hormone kích thích vỏ
thượng thận

AD

Andreostenedione

Cl

Cloride

CMO

corticosterone methyloxidase

CMO I

Corticosterone

CMO II

18-hydroxycorticosterone




DMSO

Dimethysulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxy-NTPs

DOC

11-Deoxycorticosterone

E.Coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenedinitrilotetraacetic acid

F

Cortisol



Human CYP11B1

Trình tự CYP11B1 ở người

Hc11B2

Human CYP11B2

Trình tự CYP11B2 ở người

HPTLC

High performance thin layer

Sắc ký lớp mỏng cao áp

chromatography
K

Kali

LDL

Low-density lipoprotein

LH

Luteinizing hormone


Non-classic

Thể không cổ điển

NHĐT

Simple virilization

Nam hoá đơn thuần

Pc11B1

Pig CYP11B1

Trình tự CYP11B1 ở lợn

POR

P450 oxidoreductase

PWM

Position weight matrix

Rc11B1

Rat CYP11B1

Trình tự CYP11B1 ở chuột


Steroidogenic acute regulatory

Protein điều hòa sản xuất

protein

steroid cấp tính

T

Testosterone

TART

Testicular adrenal rest tumors

Vùng bảo thủ

U tinh hoàn xuất phát từ tế

bào có nguồn gốc thượng
thận
Taq

Thermus aquaticus

TEMED

N,N,N’,N’tetramethylethylenediaminel


Phân loại các đột biến trên gen CYP11B1 dựa trên các nghiên
cứu in-vitro……………………………………………………

Bảng 1.3.

8
19

Các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hoá sinh và đặc điểm di
truyền của các bệnh liên quan tới thiếu hụt isozyme 11βhydroxylase……………………………………………………

33

Bảng 2.1.

Trình tự đoạn Oligonucleotides………………………………

42

Bảng 2.2.

Thành phần dung dịch đệm RF1, RF2……………………….

48

Bảng 2.3.

Thành phần gel tách/gel cô polyacrilamide…………………..

50


64

Bảng 3.6.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-004…………

67

Bảng 3.7.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-012…………

69

Bảng 3.8.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-005…………

71

Bảng 3.9.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-002…………

73

Bảng 4.1.

Một số đột biến thay thế amino acid trên gen CYP11B1 dẫn

Hình 1.2.

Các phản ứng xúc tác bởi enzyme CYP11B1………………

15

Hình 1.3.

Vị trí gen CYP11B1 và gen CYP11B2 trên NST số 8………

17

Hình 2.1.

Sơ đồ nghiên cứu…………………………………………...

44

Hình 2.2.

Sơ đồ nhân đoạn gen CYP11B1…………………………….

46

Hình 2.3.

Cấu trúc của vector pSVL………………………………….

47


Hình 3.6.

Đột biến p.E147D và p.N152K ở bệnh nhân MS.
CYP11B1-011………………………………………………

60

Hình 3.7.

Bệnh nhân MS. CYP11B1-011……………………………..

61

Hình 3.8.

Đột biến IVS6+5G>T bệnh nhân MS. CYP11B1-006……..

63

Hình 3.9.

Bệnh nhân MS. CYP11B1-006…………………………….

64

Hình 3.10.

Đột biến IVS6+5G>T ở bệnh nhân MS. CYP11B1-008…...

65


Hình 3.16.

Bệnh nhân MS. CYP11B1-002……………………………..

72

Hình 3.17.

Đột biến p.R51K biểu hiện trong tế bào động vật COS-1….

74

xi


Hình 3.18.

Phân tích hoạt tính của 11-hydroxylase có đột biến p.R51K
ở tế bào động vật COS-1……………………………………

Hình 3.19.

Đột biến p.E147D và p.N125K biểu hiện trong tế bào động
vật COS-1…………………………………………………..

Hình 3.20.

74



81

Hình 3.23.

Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.E147D………………..

82

Hình 3.24.

Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.N152K……………….

83

Hình 4.1.

Vị trí đột biến p.R43Q trên mô hình protein CYP11B1……

85

Hình 4.2.

Vị trí các đột biến trên gen CYP11B1 đã được công bố trên
thế giới……………………………………………………...

Hình 4.3.

Hình 4.4.


đổi sinh lý do bệnh gây ra.
Khoảng 90-95% các trường hợp mắc TSTTBS là do thiếu hụt 21hydroxylase; 5-8% trường hợp TSTTBS bắt nguồn từ sự suy giảm 11βhydroxylase (Zachmann và cs, 1983). Còn lại là các trường hợp TSTTBS do
sự suy giảm các enzyme hiếm gặp khác như 17- hydroxylase (17-OH), 3βhydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) và 20/22 Desmolase. Bệnh
TSTTBS với các dấu hiệu suy thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong ở thể
mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ
trai gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chức năng sinh dục,
sinh sản và tâm lý (Arlt và Krone, 2007, Merke và Bornstein, 2005, Ogilvie
và cs, 2006, White và Speiser, 2000).


2

TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase là bệnh hiếm gặp di truyền lặn
trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh do sự thiếu hụt hoặc mất hoàn toàn hoạt tính
của enzyme 11β-hydroxylase (CYP11B1) dẫn đến sự thiếu hụt các hormone
tuyến thượng thận. Đặc điểm lâm sàng phổ biến nhất của hội chứng thiếu hụt
11β-hydroxylase là bất thường bộ phận sinh dục ngoài, tăng nhanh sự phát
triển xương dẫn đến tình trạng lùn của trẻ, dậy thì sớm ngoại biên, hạ kali
máu và tăng huyết áp. Các xét nghiệm hoá sinh thường dựa trên mức độ tăng
lên của 11-deoxycortisol và 11-deoxycorticosterol huyết thanh kết hợp với sự
gia tăng nồng độ của adrogen thượng thận.
TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase có các dấu hiệu đặc trưng nhưng
cũng còn nhiều thách thức trong vấn đề chẩn đoán và điều trị. Sự đa dạng về
kiểu hình, tỷ lệ phát hiện thấp là những lý do làm chậm chẩn đoán 11βhydroxylase. Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam còn ít nghiên cứu về sự
ảnh hưởng của các loại đột biến tới chức năng hoạt động của 11βhydroxylase. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến
gen CYP11B1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt
11 beta hydroxylase” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng
tỏ nguyên nhân gây bệnh rối loạn chuyển hoá 11β-hydroxylase ở người Việt
Nam. Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học giải thích
được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh hiệu quả, đúng



4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 1951, các nhà khoa học đã nhận thấy có một số lượng bệnh nhân
TSTTBS có dấu hiệu như tăng huyết áp, có các triệu chứng của thiếu hụt
aldosterone, tăng natri, hạ kali máu. Các bệnh nhân này sau đó được phát hiện
có sự thiếu hụt 11- hydroxylase. Đây là các dấu hiệu phân biệt giữa bệnh
nhân TSTTBS do thiếu hụt 11- hydroxylase với các bệnh nhân TSTTBS do
thiếu hụt 21 hydroxylase

(Eberlein và Bongiovanni, 1955, Shepard và

Clausen, 1951, Wilkins và cs, 1952, Wilkins và cs, 1951).
Năm 1956, Eberlein và Bongiovanni đã miêu tả hiện tượng TSTTBS có
kèm theo triệu chứng cao huyết áp (Eberlein và Bongiovanni, 1955). Glenthoj
và cộng sự đã chẩn đoán 3 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase
mà trước đó, 3 bệnh nhân này đã được chẩn đoán TSTTBS do thiếu hụt 21hydroxylase (Glenthoj và cs, 1979). Năm 1982, Rosler và cộng sự đã báo cáo
26 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase ở 18 gia đình Do Thái
từ Morocco, Tunis, Thổ Nhĩ Kỳ và Iran. Trong đó có 7 gia đình kết hôn cận
huyết. Các bệnh nhân có triệu chứng tăng huyết áp nặng. Các bệnh nhân nữ
có triệu chứng lâm sàng đa dạng, từ âm vật phì đại đến thể nam hoá nặng.
10/14 bệnh nhân nữ được nuôi dưỡng giống như các trẻ trai và việc chẩn đoán
muộn ở giai đoạn dậy thì (Rosler và cs, 1982). Triệu chứng tăng huyết áp dẫn
đến tình trạng tử vong do bệnh tim mạch chỉ xuất hiện ở các bệnh nhân nam

ở giới hạn trên của bình thường. Bệnh nhân thứ 2 là trẻ gái 1 tháng tuổi với
triệu chứng âm vật phì đại nhưng không có bìu chẻ đôi. Bệnh nhân có huyết
áp bình thường so với tuổi và có nồng độ 11-deoxycortisol tăng.


6

1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Từ những năm 2000, một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân
tử để sàng lọc các đột biến trên gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS như tác giả
Võ Kim Huệ, Thái Thiên Nam đã ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc đột
biến mất 8bp ở các bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam cũng như các thành
viên trong gia đình của bệnh nhân này (Thái Thiên Nam, 2002, Võ Kim Huệ,
2000). Năm 2006, tác giả Trần Kiêm Hảo cũng ứng dụng kỹ thuật PCR để
sàng lọc một số đột biến phổ biến trên các bệnh nhân TSTTBS tại Bệnh viện
Nhi trung ương (Trần Kiêm Hảo, 2006). Năm 2017, tác giả Vũ Chí Dũng
công bố chẩn đoán phân loại thể thiếu các enzyme đặc hiệu khác nhau trên
715 bệnh nhân TSTTBS bao gồm 375 (52%) trẻ trai và 340 (48%) trẻ gái tại
bệnh viện Nhi trung ương (Bùi Phương Thảo Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc
Khánh, Cấn Thị Bích Ngọc, 2015). Trong đó, thể thiếu 21-hydroxylase là 703
(98,3%) bệnh nhân; thiếu 11β-hydroxylase là 9 (1,3%) bệnh nhân; và thiếu
3β-hydsroxysteroid dehydrogenase type 2 là 3 (0,4%) bệnh nhân. Nghiên cứu
cho thấy, số bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam là rất lớn. Đa số các bệnh
nhân mắc bệnh TSTTBS thể thiếu 21-hydroxylase. Tuy nhiên, còn rất ít các
nghiên cứu TSTTBS thể hiếm gặp. Gần đây, đã có một số nghiên cứu
TSTTBS thể hiếm gặp bằng các phương pháp sinh học phân tử và phân tích
sự ảnh hưởng của các đột biến mới. Năm 2012, tác giả Lê Bắc Việt mô tả một
bệnh nhân mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase. Bệnh nhân có đột biến dị hợp
tử kép R43Q và A386V (Lê Bắc Việt, 2012). Đột biến A386V là đột biến làm
thay đổi axit amin Alanine thành Valine. Đột biến này xảy ra tại vị trí axit

mắc bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase cao nhất được tìm thấy ở
Israel trên người Do Thái di cư từ Morocco. Tần suất mắc bệnh ở nhóm người
này khoảng từ 1/5000-7000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ người mang gen từ 1,2-1,4%
(Rosler và cs, 1992, Rosler và White, 1993).


8

Bảng 1.1. Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu enzyme vỏ thượng thận
Enzyme thiếu hụt

Tỷ lệ mới mắc và

Gen/NST

chủng tộc

Triệu chứng lâm sàng

21-hydroxylase

CYP21A2

Cổ điển 1:16000

(P450c21)

6p21.3

Thể không cổ điển Phì đại âm vật, suy thượng


ngoài

Dấu ấn sinh học

các

triệu

chứng như trên, còn có tăng
động, đau liên hoàn, sai khớp
đa chỗ, thiếu hụt đường giữa
bao gồm cả khả năng có thể


9

bất thường cấu trúc tim mạch
11β-hydroxylase

CYP11B1/8q24.3 1:200000 ở chủng tộc Thể cổ điển: 46,XX; phì đại DOC

(P450c11β)

da trắng; 1/7000 ở âm vật, tăng huyết áp ở hầu 11-deoxycortisol
Moroccan Jews

hết các bệnh nhân, hạ kali AD; T
máu, nam hoá sau sinh
Thể không cổ điển: cường


10q21-22

Phổ biến hơn ở Brazil (46,XX hoặc 46,XY nhưng corticosterone;

(P4450c17)

và Châu Á

nam hoá kém), tăng huyết áp, và FSH
hạ kali máu, thiểu năng sinh

LH


10

dục, nam hoá kém, tinh hoàn
trong ổ bụng
Một phần: 46,XY mơ hồ giới
tính theo các mức độ khác
nhau. 46,XX phát triển đặc
tính sinh dục ở các mức độ
khác nhau.
Steroidogenic
regulatory
(StAR)

acute STAR
protein 8p11.2

thận, có thể không có tuyến
thượng thận, mất muối
Thể không cổ điển: 46,XY mơ
hồ giới tính ở các mức độ
khác nhau, suy thượng thận
Thiếu

P450- POR

oxydoreductase (POR) 7q11.2

Hiếm, phổ biến hơn ở Giảm thể tích tuần hoàn, dị tật Mức độ cao khác
Nhật Bản và Hàn xương (Antley-Bixler); nam nhau, thiếu hụt một
Quốc

hoá ở mẹ.

phần nhiều steroid

46,XX: nam hoá nhẹ đến
trung bình.
46,XY: nam hoá kém
(Nguồn: Hannah Shmouni và cs, 2017; Turcu và Auchus 2015)


12
1.2. ĐỊNH NGHĨA, CƠ SỞ HOÁ SINH VÀ SINH LÝ BỆNH HỌC CỦA
TSTTBS DO THIẾU HỤT 11Β-HYDROXYLASE

1.2.1. Định nghĩa TSTTBS và các enzyme tham gia tổng hợp cortisol

steroid thượng thận, cholesterol đi vào trong ty thể nhờ protein vận chuyển
StAR. Thêm vào đó, đột biến bất hoạt gen POR mã hoá enzyme cho điện tử
P450 oxidoreductase cũng gây ra các biểu hiện của TSTTBS với các triệu
chứng kết hợp của thiếu P450cc17 và P450c21 (Krone và Arlt, 2009, Miller
và Auchus, 2011, Speiser và cs, 2010, Turcu và Auchus, 2015) (Hình 1.1;


13

Bảng 1.1). Thiếu hụt enzyme 21-hydroxylase và 11β-hydroxylase chỉ gây tổn
thương tổng hợp steroid thượng thận, trong khi thiếu 17α-hydroxylase và 3βhydroxysteroid dehydrogenase type 2 cũng gây tổn thương tổng hợp steroid ở
tuyến sinh dục.
1.2.2. Cơ sở hoá sinh của bệnh TSTTBS
Sinh tổng hợp steroid được bắt đầu từ nguyên liệu cholesterol không
ester hoá, đây là một phân tử gồm 27 carbon có nguồn gốc từ lipoprotein
trọng lượng phân tử thấp (LDL) lưu hành trong tuần hoàn (Higashijima và cs,
1987). Cholesterol được vận chuyển từ bào tương vào màng trong của ty thể
thông qua protein StAR (Miller, 2007). Enzyme tách nhánh bên P450
(CYP450scc) có tên gen là CYP11A1 xúc tác chuyển hoá cholesterol thành
steroid trung gian là pregnenolone bằng cách hydroxyl hoá carbon 20 và 22,
sau đó tách liên kết giữa hai carbon hydroxyl hoá này (Parker và Schimmer,
1995). Pregnenolone vì không phải là cơ chất trong ty thể nên đi ra lưới nội
bào và tại đây được chuyển thành các steroid đặc hiệu phụ thuộc vào enzyme
và các yếu tố đồng vận đặc hiệu.
Tuyến thượng thận có vai trò thiết yếu cho sự sống sẽ sản xuất ra các
steroid tại phần vỏ. Vỏ thượng thận được chia thành 3 lớp riêng biệt, khác
nhau về cấu trúc mô học là lớp cầu ngoài cùng, lớp bó (lớp giữa) và lớp lưới
(lớp trong cùng). Mỗi lớp này sở hữu những enzyme khác nhau để tổng hợp
các steroid đặc hiệu. Sản xuất steroid thượng thận bị kích thích bởi hormone
thuỳ trước tuyến yên là ACTH. Hormone giải phóng corticotropin (CRH)

Khi thiếu hụt enzyme đặc hiệu tổng hợp cortisol thì nồng độ thấp của
cortisol kích thích sản xuất quá mức CRH ở vùng dưới đồi và ACTH của
tuyến yên, và kích thích liên tục tuyến thượng thận gây tăng sinh mô của
tuyến. Tuỳ thuộc vào enzyme nào bị thiếu hụt mà việc tổng hợp các hormone
steroid bị thiếu hụt khác nhau.

Hình 1.2. Các phản ứng xúc tác bởi enzyme CYP11B1
(Nguồn: Cerny et al. 2015)

TSTTBS thiếu 11β-hydroxylase là do đột biến trên gen CYP11B1. Gen
CYP11B1 mã hoá cho 11β-hydroxylase (enzyme CYP11B1). Đây là enzyme
biểu hiện chủ yếu ở vùng bó vỏ thượng thận, có chức năng chuyển hoá 11deoxycortisol thành cortisol và deoxycorticosterone thành corticosterone dưới