1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGÔ THỊ THU HƯƠNG
PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN
ĐỘT BIẾN CYP21A2 VÀ CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH CHO BỆNH TĂNG SẢN
THƯỢNGTHẬN BẨM SINH THỂ THIẾU
ENZYM 21-HYDROXYLASE
Chuyên ngành: Nội tiết – Chuyển hóa
Mã số: 62.72.16.45
ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN
CỨU SINH
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Arg Arginine
ARN Acid ribonucleic
Asn Asparagine
CYP Cytochrome P450
CYP21 Cytochrome P450 21( steroid 21- hydroxylase)
CYP21 Gen steroid 21 - hydroxylase
DNA Acid deoxyribonucleic
E Exon
Gln Glutamine
I Intron
Ile Isoleucine
I2g Đột biến điểm ở intron 2 ( 656A/C →G)
HLA Human leukocyte antigen
KCĐ Không cổ điển
Lys Lysine
Met Methionin
mới mắc và được điều trị tại khoa và tính tới hết tháng 6 năm 2010 số bệnh
nhân lên đến 512 trẻ [27].
Bệnh không được chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn đến cơn
suy thượng thận cấp đe dọa tử vong cho trẻ, nếu không được điều trị hay dùng
liều thuốc chưa thích hợp sẽ gây dậy thì sớm giả ở trẻ trai, nam hóa ở trẻ gái.
Bệnh có thể điều trị được bằng liệu pháp hormon thay thế suốt đời. Liệu pháp
gen cũng đã được nghiên cứu nhưng chưa được ứng dụng. Bệnh có thể dự
phòng bằng phương pháp tư vấn di truyền như sàng lọc phát hiện người lành
mang gen bệnh để chẩn đoán trước sinh. Trên thế giới tỷ lệ người lành mang
gen ước tính khoảng 1/60 tùy theo từng chủng tộc [16]. Từ những năm 1970
-1980 nhờ sự phát triển kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) người ta đã xác định
được nguyên nhân gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH là do đột biến
4
gen CYP21A2 [4],[28] do vậy, trong trường hợp cả hai bố mẹ đều có mang
gen đột biến bệnh thì khả năng sinh con bị bệnh là 25% việc chẩn đoán trước
sinh cho các bà mẹ mang gen đột biến trong gia đình khi mang thai là thực sự
cần thiết để chẩn đoán sớm trước sinh cho con, đặc biệt khi thai bị bệnh là
giới nữ, để giúp trẻ phát triển bình thường, không bị nam hóa từ trong bào
thai, tránh cho trẻ không phải chịu cuộc phẫu thuật chỉnh hình sau sinh. Ngoài
ra, khi biết bà mẹ mang thai trẻ bị bệnh là giới nam các bác sĩ cần lập kế
hoạch chăm sóc điều trị ngay sau sinh để phòng tránh cơn suy thượng thận
cấp và đem lại sự phát triển bình thường về sau cho trẻ [1],[10]. Do vậy chẩn
đoán trước sinh có vai trò rất quan trọng. Để góp phần điều trị sớm bệnh và tư
vấn di truyền cho các gia đình mang gen bệnh chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài này với hai mục tiêu:
1. Phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình bệnh
nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH.
2. Nghiên cứu áp dụng quy trình chẩn đoán trước sinh cho một số thai
phụ mang gen đột biến gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH và tư
vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân.
Hình 1.1 Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí các gen CYP21[16]
Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả gen CYP21A2P, cả hai cùng
nằm bên trong phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC trên cánh ngắn của NST
số 6 vùng 6p21.3. Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P nằm xen kẽ
với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ
thể [15], [37].
7
Hình 1.2 Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 [15]
Gen mã hóa cho enzym 21-OH của vỏ thượng thận là gen CYP21A2,
có kích thước 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional
pseudogene), CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3),
trong vùng phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex-
MAC) cạnh gen HLA. Gen CYP21A2 và gen tương đồng của nó CYP21A2P,
nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B. Mỗi gen CYP21A2
và CYP21A2P bao gồm 10 exon trình tự nucleotide của hai gen này tương
đồng 98% trong các exon và khoảng 96% trong các intron do vậy trong quá
trình phân bào giảm nhiễm có thể do sự đột biến mất đoạn giữa hai allen hoặc
nhân đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấu trúc của gen CYP21A2 bị
thay thế một đoạn của giả gen CYP21A2P hoặc gây mất đoạn của gen
CYP21A2P. Các thay đổi này gây nên sự bất hoạt của gen CYP21A2 bình
thường và gây nên bệnh lý [16],[22],[38].
Chức năng gen CYP21
8
Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21-OH gồm 494 acid amin, có vai trò
phiên mã tổng hợp ARNm tiền thân. Phân tử này trải qua quá trình cắt các
intron nối chính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh.
Phân tử này sẽ được sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH [17]
Hình 1.3 Quá trình tổng hợp enzym 21-OH từ gen CYP21A2 [17]
2.1.4 Một số đột biến gen CYP21
2.1.5 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh
10
11-βOH
17- OHP
17,20 lyase
DOC
ACTH
Cholesterol
Pregnenolon
Progestero
n
Corticosteron
Aldosteron
450
SCC
17-OH (NST 10p24-25))
3β-HSD
18-OH
21-OH (NST6, CYP21)
17-OH
17OH-Pregnenolon
DHEA
Δ4 androstenedion
11-deoxycortisol
Testosteron
Cortisol
Ostradiol
3β-HSD (NST 1p13)
11-βOH (NST 8q22)
21-OH
(AA) là 25%. Trong quần thể trường hợp này hay gặp nhất.
+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường (AA) kết hôn với người
mang gen dị hợp tử (Aa) thì khả năng sinh ra con bình thường (AA) là 50%,
con bị dị hợp tử (Aa) là 50%.
+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường kết hôn với người bị bệnh
(aa) thì khả năng sinh con mang gen dị hợp tử (Aa) là 100% .
Nguy hiểm của bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường là có người
lành mang gen bệnh, bề ngoài là người hoàn toàn bình thường, khỏe mạnh
nhưng khi xây dựng gia đình sinh con thì truyền bệnh cho con theo tỷ lệ phân
ly gen bệnh của qui luật Mendel. Bệnh truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.
12
AA
I
IIII
IIII
AA
AA
Aa
Aa
AA
Aa
Aa
Aa
AA
Aa
AA
AA
AA
Aa
Aa
hiệu về lâm sàng hoặc sinh học nhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì. Tuy
vậy có thể phát hiện dị hợp tử bằng phương pháp sinh hóa. Người ta định
lượng 17-OHP cho những người là thành viên của gia đình người bệnh, với
17-OHP <300ng/ml thì là bình thường và 17-OHP >300 - 1499ng/ml thì là dị
hợp tử sau nghiệm pháp kích thích bằng corticotropin (Lee HH el al 2000).
13
Do thiếu hụt enzym 21-OH có liên quan đến typ HLA, nên có thể xác định
đột biến gen CYP21A2 hoặc phát hiện người lành mang gen bằng cách phân
loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và tế bào ối thai
nhi hoặc đối tượng có nguy cơ cao. Nếu kết quả typ HLA giống nhau và có
thể chẩn đoán thai nhi bị bệnh TSTTBS thể thiếu hụt enzym 21-OH hoặc
người lành mang gen với độ tin cậy cao [2],16].
Hình 1.4 Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các
thể bệnh và người mang gen dị hợp tử [33]
Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc người mang gen được tiến hành ở gia
đình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao để
quản lý người mang gen và người bệnh. Qua sàng lọc này để có thể đưa ra lời
khuyên di truyền phù hợp nhằm tránh khả năng kết hôn cùng dòng họ cũng
như tránh kết hôn giữa những người mang gen bệnh (Aa x Aa) hoặc giữa
người mang gen bệnh với người bị bệnh (Aa x aa). Nếu kết hôn phải quản lý
thai nghén về phương diện di truyền [2].
2.3 Chẩn đoán trước sinh
2.3.1 Khái niệm về chẩn đoán trước sinh (Prenatal diagnosis)
Chẩn đoán trước sinh là sử dụng các phương pháp xét nghiệm siêu âm,
sinh hóa, di truyền tế bào, di truyền phân tử để xác định xem thai nhi có bị
14
Nồng độ
17-OHP sau
nghiệp pháp
kích thích
cho quan sát thai và định khu rau thai [7].
- Chẩn đoán tế bào gai rau: năm 1960 phương pháp sinh thiết gai rau đã được
sử dụng nhưng đến năm 1983 nhờ có siêu âm chỉ dẫn nên phương pháp này
mới được sử dụng rộng rãi giúp cho chẩn đoán thai sớm 3 tháng đầu khi mà
phương pháp chẩn đoán bằng tế bào ối được tiến hành muộn hơn là 3 tháng
giữa. Kỹ thuật sinh thiết gai rau tiến hành qua đường bụng hoặc đường âm
đạo dưới sự hướng dẫn của siêu âm. Thường tiến hành thủ thuật vào thai tuần
thứ 8 đến tuần thứ 11[16],[34].
- Phương pháp di truyền phân tử để phát hiện gen đột biến bằng phương pháp
PCR. Từ những năm 1970 -1980 nhờ kỹ thuật khuyếch đại gen (PCR) mà
người ta đã xác định được một số gen đột biến gây dị tật ở thai nhi [4],[28].
- Phương pháp xác định tế bào và DNA của thai từ máu mẹ: mặc dù tỷ lệ
DNA con trong máu mẹ thấp, có thể chiết tách DNA có nguồn gốc từ thai
trong máu mẹ cho các xét nghiệm phân tử trong chẩn đoán trước sinh.
Phương pháp này rất tốt để chẩn đoán trước sinh TSTTBS vì rất cần kết quả
sớm từ khi thai 5 – 6 tuần để điều trị cho thai nhi nữ nhưng so với sinh thiết
gai rau và chọc ối phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế [10].
Do vậy, để chẩn đoán bệnh trước sinh cho bệnh TSTTBS, có thể sử
dụng một số phương pháp giúp chẩn đoán như định lượng nồng độ 17-OHP
trong nước ối, xác định týp HLA của tế bào gai rau và tế bào nước ối, phân
tích di truyền phân tử của các tế bào gai rau và tế bào nước ối để tìm đột biến
gen CYP21A2 [16].
Năm 1975, người ta đã phát hiện nồng độ 17-OHP nước ối tăng cao ở
phụ nữ có con mắc bệnh TSTTBS thể mất muối. Năm 1976, chẩn đoán trước
sinh bệnh này được tiến hành ở Pháp bằng phương pháp đo 17- OHP trong
nước ối vào thời kỳ 3 tháng giữa của thai sản [26]. Trong nghiên cứu có 274
16
phụ nữ mang thai có nguy cơ sinh con mắc bệnh TSTTBS đã được chẩn đoán
trước sinh bằng các phương pháp khác nhau cho phép kết luận: việc phân tích
steroid trong nước ối là một phương pháp chính xác nhưng cho kết quả muộn
lọc sơ sinh còn giúp điều trị để ngăn ngừa nồng độ androgen tăng cao và theo
dõi các biểu hiện lâm sàng để giúp cho trẻ có sự phát triển và dậy thì bình
thường, cải thiện chiều cao cuối cùng. Vì vậy sàng lọc sơ sinh bị bệnh
TSTTBS rất có ích và được khuyến cáo cho tất cả trẻ mới ra đời [1],[27].
Ở các nước phát triển, sàng lọc bệnh TSTTBS bằng phương pháp đo
nồng độ 17-OHP trong máu trên giấy thấm máu ở gót chân vào ngày thứ 2 - 3
sau sinh tăng cao. Ở trẻ đẻ non, trẻ mắc bệnh lý hay stress giá trị 17-OHP có
xu hướng tăng cao hơn những trẻ đủ tháng và thường gặp dương tính giả.
Ngưỡng cắt của nồng độ 17-OHP được khuyến cáo tùy theo cân nặng, đối với
trẻ < 1300 gram là từ 165 ng/ml và đối với trẻ > 2200gram là từ 40ng/ml tại
Wisconsin (Miền tây Hoa Kỳ). Tại Thụy Điển, ngưỡng cắt 17-OHP là
400nmol/l đối với trẻ đẻ non trước 35 tuần và 150 nmol/l đối với trẻ 35-36
tuần. Kết quả sàng lọc dương tính cần được khẳng định bằng định lượng lần 2
nồng độ 17-OHP máu, các steroid nước tiểu hay phân tích gen CYP21A2
[17].
Sàng lọc di truyền phân tử, phân tích gen CYP21A2 không những cần
thiết cho chẩn đoán mà còn có ích giúp khẳng định bản chất của đột biến,
giúp tư vấn di truyền và thiết lập chẩn đoán trong những trường hợp nghi ngờ.
2.5 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trong nước
Năm 1990, Nguyễn Thị Nhạn và cộng sự đã tổng kết 36 bệnh nhân mắc
hội chứng sinh dục thượng thận trong giai đoạn 1981-1990, chiếm tỷ lệ 1,9%
tổng số bệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong là 5,5% [6].
18
Năm 1993, Nguyễn Thị Phượng đã nghiên cứu về phương diện di truyền
trên 31 bệnh nhân hội chứng sinh dục thượng thận tại Bệnh viện Nhi Trung
ương từ năm 1980 – 1990. Tác giả đã nhận thấy bệnh mang đủ các đặc tính di
truyền lặn nằm trên NST thường [7].
Năm 1994, Nguyễn Thị Nhạn tổng kết các dấu hiệu lâm sàng, cận lâm
sàng chung của 55 bệnh nhân TSTTBS điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương
với phác đồ điều trị cấp cứu cơn suy thượng thận hiện nay, gần 95% bệnh
Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: Các bà mẹ hoặc chị (hoặc em
gái) ruột của bệnh nhân TSTTBS đã được phát hiện là người lành mang gen
đột biến CYP21A2 hiện tại đang mang thai ở tuần thứ 6 trở lên.
Tiêu chuẩn loại trừ:
Gia đình không hợp tác để tiến hành sàng lọc và chẩn đoán trước sinh
3.2 Địa điểm nghiên cứu
20
- Khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương nơi
chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân TSTTBS.
- Trung tâm Gen và Protein Trường Đại học Y Hà Nội nơi tiến hành các
kỹ thuật di truyền phân tử.
3.3 Thời gian nghiên cứu
Thời gian từ tháng 9 năm 2011 đến 9 năm 2015.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mô tả
Mỗi đối tượng nghiên cứu sẽ có một hồ sơ nghiên cứu bao gồm các
thông tin về bệnh nhân: lâm sàng, chẩn đoán, kết quả đột biến gen và phả hệ
của gia đình, các thông tin về anh, chị, em ruột của bệnh nhân
3.4.2 Cỡ mẫu nghiên cứu
+ Dự kiến cỡ mẫu = 50 gia đình (tương ứng 150 cha, mẹ, anh, chị, em
bệnh nhân)
+ Dự kiến cỡ mẫu để chẩn đoán trước sinh =5- 10 bà mẹ mang thai.
3.4.3. Các nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu cho mục tiêu 1:
- Lập phả hệ gia đình bệnh nhân TSTTBS.
- Xét nghiệm 17-OHP cho bố, mẹ, anh, chị, em bệnh nhân.
- Kết quả phân tích đột biến gen CYP21A2 cho bố, mẹ, anh, chị, em
bệnh nhân TSTTBS đã tìm thấy đột biến.
Nội dung nghiên cứu cho mục tiêu 2:
17- OHP trong máu đồng thời lấy máu ngoại vi để chiết tách DNA theo
phương pháp Phenol/ chloroform. Tiến hành phát hiện đột biến điểm bằng kỹ
thuật giải trình tự gen và đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật MLPA Theo quy
trình sau: [11]
3.4.4.1. Chiết tách DNA
22
Lấy 2ml - 5ml máu ngoại vi của các thành viên trong gia đình bệnh
nhân, sử dụng kít tách chiết DNA của QUIAGEN. Đo và kiểm tra nồng độ
DNA bằng máy đo nồng độ Nano Drop 1000, chỉ những mẫu DNA có độ tinh
sạch 1,8-2 mới được sử dụng để phát hiện đột biến.
3.4.4.2 Giải trình tự gen CYP21A2 và phân tích kết quả.
Phương pháp phát hiện chính xác các đột biến điểm của gen CYP21A2.
Kết quả được phân tích bằng phần mềm Chromas và Chromas Pro, sau đó
được so sánh với trình tự chuẩn của Gene Bank.
- Sử dụng hai mẫu DNA đã được khuếch đại: Mẫu DNA thứ nhất có trình tự
bao gồm cả vùng promoter và toàn bộ gen (cặp mồi A). mẫu DNA thứ hai
(cặp mồi B) bao gồm exon 1 đến exon 6.
- Các mồi xuôi của A và mồi ngược của B là những mồi đặc hiệu. Còn các
mồi ngược của A và mồi xuôi của B có thể bắt gặp được với cả gen
CYP21A2 và gen CYP21A2P.
- Giải trình tự gen của cả hai mẫu DNA trên có thể nhận biết được các chuyển
đoạn lớn, nhỏ.
Quy trình thực hiện
1. Tinh sạch sản phẩm PCR.
2. Phân tích 0,1 thể tích DNA trên gel agarose chứa 1µg/ml ethidium
bromide.
3. Pha trộn hỗn hợp trong ống Eppendof gồm: hỗn hợp mastemix,
Terminator Ready Reaction mã, Primer và sản phẩm PCR. Mỗi phản ứng
PCR sequencing sử dụng duy nhất một mồi. Chạy mẫu với chu trình nhiệt tối
ưu. Tinh chế sản phẩm bằng ABI phenol/ chloroform. Thu tủa DNA bằng ly
đặc trưng cho gene của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối
chứng trong đó có 3 probe trên NST số 6 nhưng ngoài vùng 6p21.3. Kỹ thuật
25
Copyright: Tài liệu đại học ©