ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)
là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các
chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai.
Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ,
biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu
thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại
vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối
loạn hô hấp [62], [146].
DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen
dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều
dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau. Đây là gen lớn
nhất của người được phát hiện cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA 14kb
và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin. Protein này có mặt ở
màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn
định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen
bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của
bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109].
Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định.
Dạng đột biến mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60%. Đột biến điểm
đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn,
khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiờn cứu cho thấy đột biến mất
đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung
tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì
vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến mất
đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho
19-25 exon trong vùng hay xảy ra mất đoạn [7], [20], [69].
1
Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử,
nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu
và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD. Tuy nhiên
có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Tuy nhiên, những kết quả trên chỉ
mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sức
thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền.
Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến mất đoạn gen
dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát
hiện người lành mang gen bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Xác định đột biến mất đoạn gen trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne ở mức độ mRNA.
2. Phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong gia
đình của bệnh nhân đã được xác định đột biến mất đoạn gen ở trên.
3. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những người mẹ dị hợp
tử mang gen dystrophin bị đột biến mất đoạn.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD
- Tháng 12-1851, Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả chi tiết về
8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnh
loạn dưỡng cơ Duchenne. Ông cho rằng nguyên nhân của bệnh là do giảm các
yếu tố dinh dưỡng [49].
- Năm 1861, Duchenne, một nhà thần kinh học người Pháp đã có công
mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai. Năm
1868, Duchenne thực hiện một nghiên cứu quy mô về bệnh lý này, ông đưa ra
những tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh dựa trên kết quả giải phẫu bệnh và kích
thích điện. Duchenne nhận thấy có sự thay thế mô cơ bằng những mô xơ hoặc
mô liên kết trên tiêu bản sinh thiết cơ. Sau đó ụng đó sử dụng thủy trị liệu kết
hợp với xoa bóp để điều trị cho bệnh nhân và nhận thấy có sự cải thiện bệnh ở
một số bệnh nhân. Chính nhờ sự phát hiện quan trọng này mà sau đó bệnh
được mang tờn ụng [34].
- Năm 1879, Gowers đã thu thập bệnh án 220 bệnh nhân và mô tả một
lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng
nề do bệnh gây ra [92], [109].
1.2. Đặc điểm của bệnh DMD
1.2.1. Biểu hiện lâm sàng của DMD
Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp
ngã nhưng chưa có biểu hiện teo cơ.
5
- Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệu
Gowers rõ. Khi trẻ đang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốn
ngồi dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống
nạng đỡ lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lần
lượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các
động tác như vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến.
- Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi.
Sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được. Cuối cùng trẻ
thường tử vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96].
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng
1.2.2.1. Định lượng hoạt độ CK toàn phần
CK được Lohman phát hiện vào năm 1934. CK là enzym xúc tác sự tạo
năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong
tế bào cơ. Năm 1959, Ebashi và CS là những người đầu tiên áp dụng việc
định lượng hoạt độ CK huyết thanh trong chẩn đoán bệnh lý tổn thương cơ.
Các tác giả nhận thấy hoạt độ CK tăng cao gấp hàng chục lần ở bệnh nhân
loạn dưỡng cơ tiến triển. Manhoney (1977), Edward (1984) phát hiện CK tăng
trong máu của các thai nhi bị bệnh DMD [48], [104].
Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thanh thường tăng rất cao trước
khi có dấu hiệu lâm sàng, thậm chí tăng từ thời kỳ sơ sinh. Hoạt độ CK huyết
thanh ở bệnh nhân DMD khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường dưới
160 UI/L). Theo Matsuo (2002), hoạt độ CK huyết thanh bình thường có thể
7
1.2.2.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (MDHQ)
Protein dystrophin định vị ở màng sợi cơ. Bởi vậy với phương pháp
miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản sinh thiết, đường viền các sợi cơ bình
thường xuất hiện sự phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; trong
khi đó ở tiêu bản sinh thiết cơ của những bệnh nhân DMD không có sự bắt
màu, không thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ, phản ánh sự vắng mặt của
protein dystrophin trên màng tế bào cơ của bệnh nhân DMD [62], [89].
Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker
(BMD). Triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân BMD xuất hiện muộn hơn so với
ở bệnh nhân DMD, mức độ biểu hiện nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm
hơn. Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể trên màng tế
bào sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD [28].
Người bình
thường Bệnh nhân BMD Bệnh nhân DMD
Hình 1.1. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein dystrophin
(Nguồn: Matsuo, 2002)
1.2.2.5. Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến
Sự thành công của Kunkel và CS (1985) trong việc phát hiện sự mất
đoạn lớn của NST X ở 1 bệnh nhân nam DMD đã khởi đầu cho một loạt
những nghiên cứu xác định gen ở bệnh nhân DMD. Hiện nay, có rất nhiều kỹ
thuật sinh học phân tử giúp xác định đột biến gen dystrophin như kỹ thuật
PCR, Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR), Fluorescence in situ Hybridization
8
(FISH), Southern blot, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
(MLPA) [90], [91], [107]. Các kỹ thuật này sẽ được trình bày ở phần 1.4.
1.2.3. Tần số của bệnh
DMD là một bệnh di truyền phổ biến, có tần suất cao trong nhóm bệnh
loạn dưỡng cơ tuần tiến với tỉ lệ 1/3500 trẻ trai [34].
Tần số con với các genotyp khác nhau
Trai Gái
Cha Mẹ X
D
Y
lành
X
d
Y
bệnh
X
D
X
D
lành
X
D
X
d
lành mang
gen bệnh
X
d
X
d
bệnh
X
D
Y
lành
bệnh
X
D
X
D
lành
1 0 0 1 0
X
d
Y
bệnh
X
D
X
d
lành mang
gen bệnh
1/2 1/2 0 1/2 1/2
X
d
Y
bệnh
X
d
X
d
bệnh
0 1 0 0 1
Theo nghiên cứu của White (2002), Hung (2006), khoảng 30% bệnh
nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình
BMD. Ở bệnh nhân DMD, đột biến gen dystrophin đã tạo ra mã kết thúc sớm
hoặc làm thay đổi toàn bộ khung dịch mã, kết quả là protein dystrophin không
được sản xuất. Sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh nhõn, các nhà
khoa học đã chọn lọc xúa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị đột
biến nhằm tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen nhưng vẫn duy trì được
khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần. Phương pháp này đã
được áp dụng để điều trị trên người và thu được những kết quả ban đầu đáng
khích lệ [93], [144].
11
1.2.5.3. Liệu pháp điều trị tế bào
- Chuyển ghộp nguyờn bào cơ: kỹ thuật này được thực hiện bằng
cách nuôi cấy in vitro cỏc nguyên bào cơ lấy từ cơ trưởng thành của một
người thân không mắc bệnh DMD, thường là người cha. Các tế bào hình sao
hiện diện trong cơ được xem là những nguyên bào cơ có nguồn gốc phôi thai
nhưng ở trạng thái ngủ. Trong quá trình sửa chữa cơ bị tổn thương, dưới các
tác động khác nhau, tế bào hình sao sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào
cơ. Nguyên bào cơ nuôi cấy được tiêm vào cơ loạn dưỡng của người bệnh.
Các tế bào cơ không thiếu protein dystrophin sẽ thay thế các tế bào cơ bệnh
lý, nhờ đó chức năng của cơ được tái lập. Trước khi thực hiện chuyển ghộp
nguyờn bào cơ, bệnh nhân phải được điều trị ức chế miễn dịch để ngăn cản
phản ứng thải ghép tương tự như trong điều trị ghép tạng và vì vậy liệu pháp
này có thể có nhiều tác dụng phụ như nhiễm khuẩn, ung thư, [34]. Hiện nay,
phương pháp này vẫn chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD một cách
rộng rãi.
- Phương pháp sử dụng tế bào gốc: trong những năm gần đây, tế bào
gốc từ tủy xương được nghiên cứu rất nhiều do không gặp phải cản trở về vấn
đề đạo đức và nguồn cung cấp dễ dàng. Trong tủy xương, ngoài dòng tế bào
tạo mỏu cũn có nhiều dòng tế bào khác và các tế bào đó có khả năng biệt hóa
thành nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào cơ hệ vận động, tế bào cơ tim,
tế bào nội mạc, tế bào thần kinh, Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy, khi
được sao mã thành mRNA tiền thân, nhưng bị loại bỏ trong quá trình tạo
mRNA trưởng thành [136], [139].
1.3.1.3. Chức năng của gen dystrophin
Gen dystrophin có chiều dài khoảng 2400 kb, gen sao mã ra mRNA
trưởng thành có chiều dài 14 kb. Phân tử mRNA này tổng hợp nên protein
tương ứng là dystrophin [136].
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của protein dystrophin
1.3.2.1. Cấu trúc của protein dystrophin
Là protein được mã hóa bởi gen dystrophin có trọng lượng phân tử 427
kD với khoảng 3685 acid amin. Protein dystrophin nằm ở màng bào tương
của tế bào cơ và được chia làm 4 vùng:
1. Vùng N-tận gồm 240 acid amin, là vùng gắn với actin.
2. Vùng trung tâm rod có 2700 acid amin.
3. Vùng giàu cystein gồm 280 acid amin
4. Vùng C-tận chứa 420 acid amin, có chức năng liên kết với màng tế bào.
Vùng 5’-tận, vùng giàu base cystein và vùng C-tận là những vùng
tương đối quan trọng đối với chức năng của dystrophin. Những vùng này là vị
trí bám của actin và phức hợp dystrophin-glycoprotein (Dystrophin-
Glycoprotein Complex-DGC). Trong khi đú vùng rod được coi là vựng ớt
chức năng nhất [65], [107].
14
Hình 1.4. Cấu trúc mô phỏng của protein dystrophin và một số protein
tương tác với nó (Nguồn: www.jennyndesign.com)
1.3.2.2. Chức năng của protein dystrophin
Protein dystrophin có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ xương, đúng
vai trò quan trọng trong cấu trúc của cơ. Nhiều protein màng tế bào liên kết
với protein dystrophin tạo thành phức hợp DGC (Dystrophin-Glycoprotein
Complex). Phức hợp này cho phép nối những sợi actin với khung xương
ngoài tế bào xuyên qua màng sợi cơ [109]. Đầu amin tận của protein
dystrophin gắn với F-actin và đầu carboxyl tận gắn với phức hợp DGC tại
khụng gây lệch khung dịch mã có thể tạo ra protein dystrophin bị cắt ngắn ở
giữa nhưng còn một phần chức năng và gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ hơn là
BMD. Tuy nhiên, khả năng gây lệch khung dịch mã được xác định trên 90% các
trường hợp có đột biến mất đoạn [90], [106].
Đột biến mất đoạn của gen dystrophin chiếm tỷ lệ 2/3 các trường hợp
DMD/BMD và tập trung chủ yếu ở hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm và
đầu 5’ của gen dystrophin [106]. Các đột biến mất đoạn gen được phát hiện
bằng phân tích Southern blot và hầu hết (90-95%) được phát hiện bởi phương
pháp PCR với việc sử dụng các cặp mồi tập trung vào hai vùng “hotspot” [63], [75].
16
1.3.4.2. Đột biến điểm
Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 25-30%. Hầu
hết đột biến điểm trong bệnh DMD tạo ra mã kết thúc sớm và gây thể bệnh
nặng. Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo ra trở ngại lớn trong
việc xác định đột biến. Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gen
dystrophin đã được xác định [106], [112].
1.4.3.3. Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn
Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn là nguyên nhân gây nên DMD trong hầu
hết các trường hợp còn lại. Prior (2005) cho rằng 80% đột biến lặp đoạn xảy
ra ở đầu tận 5’ và 20% ở vùng trung tâm [107]. Ngoài ra, một tỷ lệ nhỏ bệnh
nhân DMD có đột biến nhỏ rải rác khó phát hiện [107].
1.4. Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin
Có nhiều phương pháp sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để phát
hiện bất thường của gen dystrophin.
1.4.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis
phát minh vào năm 1985 [121].
1.4.1.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi
tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA
làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản
phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đụi cú chiều dài
bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm
được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [94].
Hình 1.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR
(Nguồn: Vierstraete, 1999)
18
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA
ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi
lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ, một DNA đớch đó nhân bản
thành 2
n
bản sao. Đó là số lượng DNA đủ để có thể tách ra khi điện di và có
thể phát hiện được sau khi nhuộm, đủ để có thể tạo dòng hoặc giải trình tự
[6], [17], [81].
1.4.1.2. Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh DMD
* PCR đơn mồi (monoplex PCR): đõy là kỹ thuật PCR kinh điển nhất.
Mỗi phản ứng PCR sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại
một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA của tế bào [22], [138].
Trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen dystrophin, các tác giả đã sử
dụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của gen dystrophin bằng phản
ứng PCR, sau đó điện di sản phẩm trên gel agarose. Mẫu bệnh nhân được tiến
hành song song với mẫu đối chứng. Nếu mẫu đối chứng xuất hiện vạch DNA
tương ứng với kích thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫu bệnh
nhân không xuất hiện vạch thì bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon đó. Ở
Việt Nam, Nguyễn Đức Bách (2003), Đặng Thị Diễm Hồng (2004) đã sử
dụng phương pháp PCR đơn mồi để xác định đột biến mất đoạn gen ở bệnh
nhân DMD. Năm 2006, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã khuếch đại 22 exon (1, 3,
4, 6, 8, 11, 12, 13, 17, 19, 20, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 và 60) của
84 bệnh nhân DMD và phát hiện được 32 bệnh nhân (chiếm 38%) có đột biến mất
phản ứng PCR [6], [18], [74].
* Kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR): trước hết, mRNA được chuyển
thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược. Mồi được sử dụng hoặc là
oligonucleotid oligodT (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), hoặc là các
20
hexanucleotid (trình tự gồm 6 nucleotid) để bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự
ngắn trên RNA. Sau đó, cDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzym
Taq polymerase [110].
Đối với bệnh DMD, RT-PCR đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá
trình xác định đột biến. Như đã trình bày gen dystrophin là một trong những
gen lớn nhất của cơ thể (dài 2400 kb), có cấu trúc gồm 79 exon, sao mã ra
phân tử mRNA dài 14 kb; trong cấu trúc DNA, các exon nằm xen kẽ với các
intron có kích thước rất lớn [26]. Do vậy, để khuếch đại 79 exon mang chức
năng mã hóa protein từ DNA, người ta phải thiết kế 79 cặp mồi; nhưng nhờ
phản ứng RT-PCR, phân tử mRNA được chuyển thành cDNA. Trên phân tử
cDNA, 79 exon nằm liên tục với nhau, không bị xen kẽ bởi các intron; vì thế,
chỉ cần thiết kế 15 cặp mồi và sử dụng 15 phản ứng nested PCR (trong đó có
5 cặp mồi dùng cho phản ứng PCR lần 1 và 10 cặp mồi thiết kế cho phản ứng
PCR lần 2), toàn bộ chiều dài của gen dystrophin sẽ được khuếch đại [129].
Với 10 cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR lần 2, 10 đoạn DNA chứa toàn bộ
79 exon được khuếch đại và mỗi đoạn có kích thước khoảng 1000-1400 bp.
Sau khi khuếch đại, các đoạn DNA được điện di trên agarose để xác định đột
biến mất đoạn gen. Mặt khác, 10 đoạn gen này có thể được tạo dòng và giải
trình tự để phát hiện các dạng đột biến khó xác định của gen dystrophin như
đột biến điểm, đột biến lặp đoạn Các tác giả Tay và Lai đã sử dụng phương
pháp này để xác định dạng đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD ở
Singapore [129]. Hiện nay, nhóm nghiên cứu của Tạ Thành Văn ở Trung tõm
Nghiờn cứu Gen-Protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội cũng ứng dụng kỹ
thuật RT-PCR để xác định đột biến điểm và đột biến mất đoạn gen dystrophin
ở mức độ mRNA.
có tỷ lệ đậm độ exon 50:19 giảm 50% so với tỷ lệ này ở đối chứng nữ, như vậy hai người nữ này ở
dạng dị hợp tử. Còn người nữ II-2 thì tỷ lệ đậm độ exon 50:19 tương đương với chứng nữ, chứng
tỏ không mang gen bệnh.
22
1.4.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)
1.4.3.1. Nguyên tắc
Sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, được gọi là mẫu
DNA dò (probe DNA) để phát hiện một trình tự đớch. Cỏc mẫu DNA dò
được đánh dấu huỳnh quang và sẽ lai với DNA đớch trờn NST ở kỳ giữa hoặc
gian kỳ. Nhờ sự lai của mẫu DNA dò với trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện,
định vị được vị trí chuỗi DNA đặc hiệu qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh
quang [5].
1.4.3.2. Ứng dụng trong chẩn đoán DMD
FISH là một kỹ thuật giúp chẩn đoán hiệu quả các bệnh lý di truyền nói
chung và bệnh lý DMD nói riêng. Để chẩn đoán đột biến gen dystrophin,
Ligon (2000) đã sử dụng 2 loại probe:
- Các probe giúp xác định đột biến mất đoạn các exon của gen
dystrophin gọi là cosmid probe có gắn chất huỳnh quang digoxingenin. Khi
có hiện tượng lai đặc hiệu xảy ra, digoxingenin gắn trên probe sẽ phát ra màu đỏ.
- Loại probe thứ hai giúp định vị các NST X (vì gen dystrophin nằm
trên NST X), probe này có gắn biotin. Khi probe lai với NST X thì tâm động
của NST X phát ra màu xanh [84].
Kết quả của nghiên cứu của ba gia đình được thể hiện ở hình 1.9.
Hình 1.9. Hình ảnh xác định đột biến gen dystrophin nhờ phương pháp FISH
(Nguồn: Ligon, 2000)
(A). Bệnh nhân nam, sử dụng cosmid probe đặc hiệu cho exon 3-6. Kết quả cho thấy bệnh
nhân có 1 NST X (tâm động có màu xanh đặc hiệu). Trên NST X không xuất hiện tín hiệu màu
đỏ, chứng tỏ không có hiện tượng lai giữa probe và đoạn gen đặc hiệu, có nghĩa bệnh nhân bị
đột biến mất đoạn exon trong khoảng 3-6
(B). FISH sử dụng probe cosmid đặc hiệu cho exon 12, áp dụng cho con gái của 1 bệnh
và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu
với DNA đớch nờn nú khụng gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác
nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau. Do
đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di [115], [117].
1.4.4.2. Các bước tiến hành phản ứng MLPA
- Mẫu DNA hòa với 5 μl TE được biến tính ở 98°C trong 5’.
- Cho hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe vào.
- Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong vòng 16 giờ (qua đêm). Hai đoạn lai
của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn với DNA đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau.
- Cho enzym ligase vào và ủ ở 54°C trong 15 phút, enzym lipase xúc
tác, nối hai đoạn oligonucleotid của probe lại với nhau (hình 1.10). Phản ứng
nối sẽ chấm dứt bởi sự tăng nhiệt độ lên 98°C trong 5 phút của phản ứng PCR
để khuếch đại các probe.
- Hai đầu 5’ và 3’ của các probe có trình tự nucleotid hoàn toàn giống
nhau, đây cũng là vị trí gắn mồi khi tiến hành phản ứng PCR. Do vậy, chúng
ta chỉ cần dùng duy nhất 1 cặp mồi nhưng khuếch đại được toàn bộ các probe
khác nhau có trong hỗn hợp.
- Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản
sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của
chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di
(thường sử dụng phương pháp điện di mao quản). Số lượng sản phẩm khuếch
25
Copyright: Tài liệu đại học ©