1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)
là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các
chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai.
Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ,
biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu
thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại
vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối
loạn hô hấp [62], [146].
DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen
dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều
dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau. Đây là gen lớn
nhất của người được phát hiện cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA 14kb
và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin. Protein này có mặt ở
màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn
định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen
bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của
bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109].
Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định.
Dạng đột biến mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60%. Đột biến điểm
đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn,
khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiờn cứu cho thấy đột biến mất
đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung
tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì
vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến mất
đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho
19-25 exon trong vùng hay xảy ra mất đoạn [7], [20], [69].


trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường và phòng bệnh bằng phương pháp
phá thai chủ động là sự lựa chọn được nhiều người đồng thuận, từ đó có thể
giảm tỉ lệ mắc bệnh DMD trong cộng đồng [93], [107].
Ở Việt Nam, năm 1996, Nguyễn Thị Trang và CS nghiên cứu về lâm
sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoán
người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu
có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Trong một nghiên cứu khác, năm
2006, Nguyễn Văn Quyệt cho rằng, phối hợp giữa phân tích phả hệ và định
lượng hoạt độ CK có thể phát hiện được 50% bà mẹ dị hợp tử [16]. Tuy
nhiên, những kết quả trên chỉ mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn
thương di truyền và chưa đủ sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền.
Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến mất đoạn gen
dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát
hiện người lành mang gen bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Xác định đột biến mất đoạn gen trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne ở mức độ mRNA.
2. Chẩn đoán người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong
gia đình bệnh nhân đã được xác định đột biến mất đoạn gen ở trên.
3. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những bà mẹ dị hợp tử. 4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD
- Tháng 12-1851, Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả chi tiết về
8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnh
loạn dưỡng cơ Duchenne. Ông cho rằng nguyên nhân của bệnh là do giảm các
yếu tố dinh dưỡng [49].

- Những năm sau 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di
truyền phân tử phát triển mạnh giúp việc phát hiện đột biến gen dystrophin,
tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư
vấn di truyền nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ bị bệnh DMD [29], [38].
- Năm 1987-1988, các nhà nghiên cứu cho biết gen dystrophin gồm 60
exon.
- Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb [47].
- Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện
đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb [106], [112].
- Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng
được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ
lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng
nề do bệnh gây ra [92], [109].
1.2. Đặc điểm của bệnh DMD
1.2.1. Biểu hiện lâm sàng của DMD
Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp
ngã nhưng chưa có biểu hiện teo cơ.

6
- Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệu
Gowers rõ. Khi trẻ đang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốn
ngồi dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống
nạng đỡ lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lần
lượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các
động tác như vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến.
- Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi.
Sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được. Cuối cùng trẻ thường
tử vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96].
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng

Vào thế kỷ 19, Meryon (1852) và Duchenne (1868) đã áp dụng phương
pháp sinh thiết cơ để chẩn đoán bệnh DMD [34]. Trong nhiều năm sau đó,
phương pháp này được xem là công cụ đắc lực để chẩn đoán xác định bệnh
DMD và chẩn đoán phân biệt với các bệnh lý khác.
Sinh thiết cơ có tác dụng chẩn đoán xác định dựa vào những thay đổi
đặc trưng trờn mụ sinh thiết. Biến đổi mô bệnh học đặc trưng bao gồm tăng
sinh tổ chức liên kết của mô bọc sợi cơ, các sợi cơ bị thoái hóa và tái sinh rải
rác. Mô bệnh học cũng cho thấy các ổ thâm nhiễm tế bào viêm đơn nhân, đõy
là hậu quả của phản ứng viêm được khởi động bởi quá trình hoại tử sợi cơ;
song song các sợi cơ có chức năng bình thường cũng biểu hiện những thay
đổi nhẹ về mặt cấu trúc. Ngoài ra, mô sinh thiết còn có rất nhiều sợi đậm đặc;
các sợi cơ co rút thái quá này có thể là hậu quả của sự hoại tử ở một vị trí
khỏc trờn chiều dài của sợi cơ, quỏ trình hoại tử này tạo điều kiện cho canxi
đi vào nội bào qua chỗ tổn thương của màng sợi cơ vân, luồng canxi đi vào sẽ
khởi động quá trình co rút của toàn bộ chiều dài sợi cơ [34]. Vị trí sinh thiết

8
thường sử dụng nhất trong lâm sàng ở cơ rộng ngoài của cơ tứ đầu đùi hoặc
cơ sinh đôi ngoài [62].
1.2.2.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (MDHQ)
Protein dystrophin định vị ở màng sợi cơ. Bởi vậy với phương pháp
miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản sinh thiết, đường viền các sợi cơ bình
thường xuất hiện sự phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; trong
khi đó ở tiêu bản sinh thiết cơ của những bệnh nhân DMD không có sự bắt
màu, không thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ, phản ánh sự vắng mặt của
protein dystrophin trên màng tế bào cơ của bệnh nhân DMD [62], [89].
Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker
(BMD). Triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân BMD xuất hiện muộn hơn so với
ở bệnh nhân DMD, mức độ biểu hiện nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm
hơn. Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể trên màng tế

1.2.4. Di truyền học bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền đơn gen, tuân theo quy luật di truyền lặn liên
kết NST X không có alen tương ứng trên NST Y. Bệnh thường gặp ở trẻ trai
mà rất hiếm gặp ở trẻ gái. Trẻ trai chỉ cần nhận một gen bệnh trên NST X của
người mẹ mang gen (X
D
X
d
) là có biểu hiện bệnh, trong khi đó trẻ gỏi đòi hỏi
phải nhận 2 gen X mang bệnh, một gen bệnh từ mẹ và một gen bệnh từ bố
mới có khả năng biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, trẻ trai bị bệnh DMD thường chết
sớm ở tuổi từ 20 đến 25 nên không có khả năng lập gia đình. Do vậy, trong
sáu trường hợp ở bảng 1.1, khả năng thứ hai là hay gặp nhất, người mẹ mang
gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% số con trai và truyền gen bệnh
cho 50% số con gái của họ [96].
Trong một vài trường hợp, người nữ mang gen có biểu hiện bệnh khi
NST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen
bệnh sẽ biểu hiện bệnh [54], [56].

10
Bảng 1.1. Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con
Genotyp và phenotyp
của cha mẹ
Tần số con với các genotyp khác nhau
Trai
Gái
Cha
Mẹ
X
D

X
D
X
D

lành
1
0
1
0
0
X
D
Y
lành

X
D
X
d

lành mang
gen bệnh
1/2
1/2
1/2
1/2
0
X
D

Y
bệnh
X
D
X
d

lành mang
gen bệnh
1/2
1/2
0
1/2
1/2
X
d
Y
bệnh
X
d
X
d

bệnh
0
1
0
0
1


chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD ở người [53], [96].
Trong vài năm trở lại đây, một hướng điều trị gen mới đã thu được
nhiều thành quả, đó là việc chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹ
BMD. Ở bệnh nhân DMD, đột biến gen dystrophin đã tạo ra mã kết thúc sớm
hoặc làm thay đổi toàn bộ khung dịch mã, kết quả là protein dystrophin không
được sản xuất. Sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh nhõn, các nhà
khoa học đã chọn lọc xúa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị đột
biến nhằm tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen nhưng vẫn duy trì được
khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần. Phương pháp này đã
được áp dụng để điều trị trên người và thu được những kết quả ban đầu đáng
khích lệ [93], [144].

12
1.2.5.3. Liệu pháp điều trị tế bào
- Chuyển ghộp nguyờn bào cơ: kỹ thuật này được thực hiện bằng
cách nuôi cấy in vitro cỏc nguyên bào cơ lấy từ cơ trưởng thành của một
người thân không mắc bệnh DMD, thường là người cha. Các tế bào hình sao
hiện diện trong cơ được xem là những nguyên bào cơ có nguồn gốc phôi thai
nhưng ở trạng thái ngủ. Trong quá trình sửa chữa cơ bị tổn thương, dưới các
tác động khác nhau, tế bào hình sao sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào
cơ. Nguyên bào cơ nuôi cấy được tiêm vào cơ loạn dưỡng của người bệnh.
Các tế bào cơ không thiếu protein dystrophin sẽ thay thế các tế bào cơ bệnh
lý, nhờ đó chức năng của cơ được tái lập. Trước khi thực hiện chuyển ghộp
nguyờn bào cơ, bệnh nhân phải được điều trị ức chế miễn dịch để ngăn cản
phản ứng thải ghép tương tự như trong điều trị ghép tạng và vì vậy liệu pháp
này có thể có nhiều tác dụng phụ như nhiễm khuẩn, ung thư, [34]. Hiện nay,
phương pháp này vẫn chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD một cách
rộng rãi.
- Phương pháp sử dụng tế bào gốc: trong những năm gần đây, tế bào
gốc từ tủy xương được nghiên cứu rất nhiều do không gặp phải cản trở về vấn


Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc của gen dystrophin (Nguồn: Yaffe, 2002)
Gen dystrophin là một phức hợp gồm:
- Bộ phận khởi động (promotor): cho phép gen hoạt động, khi đóng,
khi mở và sản xuất ra các sản phẩm protein đặc hiệu mô tương ứng. Có bảy

14
promotor đặc hiệu là: promotor não, promotor cơ, promotor tiểu não,
promotor Dp260, Dp140, Dp116, Dp71 [139].
- Các exon: gen dystrophin chứa 79 exon, đây là vùng của gen được
phiờn mó có mặt trong mRNA trưởng thành, chứa đựng thông tin di truyền để
tổng hợp ra protein tương ứng.
- Các intron: là những đoạn DNA của gen xen kẽ giữa những exon,
được sao mã thành mRNA tiền thân, nhưng bị loại bỏ trong quá trình tạo
mRNA trưởng thành [136], [139].
1.3.1.3. Chức năng của gen dystrophin
Gen dystrophin có chiều dài khoảng 2400 kb, gen sao mã ra mRNA
trưởng thành có chiều dài 14 kb. Phân tử mRNA này tổng hợp nên protein
tương ứng là dystrophin [136].
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của protein dystrophin
1.3.2.1. Cấu trúc của protein dystrophin

màng sợi cơ (hình 1.4). Các thành phần quan trọng của phức hợp DGC bao
gồm dystroglycan, sarcoglycan, dystrobrevin, syntrophin và NOS. Sự đột biến
xảy ra ở bất cứ vị trí nào trong các thành phần này đều gây ra bệnh loạn
dưỡng cơ di truyền. Phức hợp DGC sẽ bị mất ổn định khi protein dystrophin
vắng mặt. Sự mất ổn định này dẫn đến hoại tử dần dần các sợi cơ và tổn
thương màng. Phức hợp DGC cũn có vai trò như một tín hiệu hóa học. Sự mất
tín hiệu này cũng góp phần gây bệnh [65], [109].
1.3.3. Cơ chế bệnh sinh của DMD
Sự thiếu hụt protein dystrophin làm mất tính ổn định của phức hợp
DGC, từ đó sẽ gây ra bất thường ở màng tế bào với rách màng tế bào khu trú,
tạo điều kiện cho ion Ca
++
đi vào tế bào. Ion Ca
++
vào tế bào sẽ hoạt hóa các
enzym protease, gây phân hủy các protein của sợi cơ và bộ khung tế bào. Do

Khung xương ngoài tế bào
Vùng N tận
Vùng giàu Cystein
Vùng C- tận
Cấu trúc xoắn
giống spectrin
Vùng nối
Phức hợp
Dystroglycan
Phức hợp
Sarcoglycan

Khung xương ngoài tế bào

Đột biến mất đoạn gen là dạng thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD,
chiếm khoảng 60-65% các dạng đột biến gây bệnh DMD. Những đột biến mất
đoạn làm lệch khung dịch mã của mRNA, tạo ra protein dystrophin không có
chức năng và gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng DMD. Những mất đoạn gen
khụng gây lệch khung dịch mã có thể tạo ra protein dystrophin bị cắt ngắn ở
giữa nhưng còn một phần chức năng và gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ hơn là
BMD. Tuy nhiên, khả năng gây lệch khung dịch mã được xác định trên 90% các
trường hợp có đột biến mất đoạn [90], [106].
Đột biến mất đoạn của gen dystrophin chiếm tỷ lệ 2/3 các trường hợp
DMD/BMD và tập trung chủ yếu ở hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm và
đầu 5’ của gen dystrophin [106]. Các đột biến mất đoạn gen được phát hiện
bằng phân tích Southern blot và hầu hết (90-95%) được phát hiện bởi phương
pháp PCR với việc sử dụng các cặp mồi tập trung vào hai vùng “hotspot” [63], [75]. 17
1.3.4.2. Đột biến điểm
Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 25-30%. Hầu
hết đột biến điểm trong bệnh DMD tạo ra mã kết thúc sớm và gây thể bệnh
nặng. Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo ra trở ngại lớn trong
việc xác định đột biến. Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gen
dystrophin đã được xác định [106], [112].
1.4.3.3. Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn
Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn là nguyên nhân gây nên DMD trong hầu
hết các trường hợp còn lại. Prior (2005) cho rằng 80% đột biến lặp đoạn xảy
ra ở đầu tận 5’ và 20% ở vùng trung tâm [107]. Ngoài ra, một tỷ lệ nhỏ bệnh
nhân DMD có đột biến nhỏ rải rác khó phát hiện [107].
1.4. Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin
Có nhiều phương pháp sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để phát
hiện bất thường của gen dystrophin.

lên 72
o
C để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,
Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian
phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30
giây đến nhiều phút [121].
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng
làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản
phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đụi cú chiều dài
bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm
được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [94].

Hình 1.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR
(Nguồn: Vierstraete, 1999) 19
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA
ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi
lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ, một DNA đớch đó nhân bản
thành 2

Do gen dystrophin có số lượng lớn exon (79 exon) nên để phát hiện đột
biến mất đoạn gen dystrophin, các tác giả thường sử dụng phương pháp PCR
đa mồi hơn là phương pháp PCR đơn mồi nhằm tiết kiệm thời gian, công sức
và hóa chất. Trước đây và cho đến hiện nay, phương pháp multiplex PCR vẫn
là phương pháp được ưu tiên sử dụng để phát hiện đột biến mất đoạn gen
dystrophin như trong nghiên cứu của Coutelle (1989), Lee (1993), Prior
(2005), Basak (2006), Sura (2008), Năm 2006, Trần Võn Khỏnh đó sử dụng
phương pháp này để phát hiện đột biến trên 85 bệnh nhân DMD. Kết quả cho
thấy tỷ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin của bệnh nhân DMD ở Việt Nam
là 38% [10], [32], [33], [43], [82], [125]. Hiện nay, phương pháp multiplex
PCR là một trong những phương pháp được sử dụng để chẩn đoán đột biến mất
đoạn gen dystrophin ở Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein của trường Đại học Y
Hà Nội.

Hình 1.7. Phản ứng multiplex PCR xác định đột biến mất đoạn gen
dystrophin (Trung tâm Nghiờn cứu Gen-Protein, Đại học Y Hà Nội)
* Kỹ thuật PCR lồng (nested PCR): nguyờn lý của kỹ thuật nested PCR là sử
dụng 2 cặp mồi có trình tự nucleotid lồng vào nhau để khuếch đại đoạn DNA đích,
nghĩa là cặp mồi thứ 2 có trình tự các nucleotid nằm bên trong cặp mồi thứ nhất.
Sản phẩm PCR được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho
phản ứng PCR lần thứ 2. Phương pháp này làm tăng chất lượng và độ đặc hiệu cho
phản ứng PCR [6], [18], [74].
* Kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR): trước hết, mRNA được chuyển
thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược. Mồi được sử dụng hoặc là
oligonucleotid oligodT (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), hoặc là các
Exon 42
Exon 47

biến mất đoạn gen. Mặt khác, 10 đoạn gen này có thể được tạo dòng và giải
trình tự để phát hiện các dạng đột biến khó xác định của gen dystrophin như
đột biến điểm, đột biến lặp đoạn Các tác giả Tay và Lai đã sử dụng phương
pháp này để xác định dạng đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD ở
Singapore [129]. Hiện nay, nhóm nghiên cứu của Tạ Thành Văn ở Trung tõm
Nghiờn cứu Gen-Protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội cũng ứng dụng kỹ
thuật RT-PCR để xác định đột biến điểm và đột biến mất đoạn gen dystrophin
ở mức độ mRNA.
1.4.2. Phương pháp Southern blot
1.4.2.1. Nguyên tắc
Trong phương pháp này, DNA được phân cắt bằng các enzym đặc hiệu.
Các đoạn DNA trong hỗn hợp sau đó được phân tách bằng điện di trên gel

22
agarose rồi chuyển sang màng lai. Bước tiếp theo, các đoạn DNA cần xác
định nằm trên màng được lai với các oligonucleic đặc hiệu có gắn chất đánh
dấu như phóng xạ, chất màu huỳnh quang, biotin Các phương pháp xác định
hình ảnh tương ứng được sử dụng để chỉ ra các vạch sản phẩm chứa các đoạn
DNA cần phát hiện lai với oligonucleotid đánh dấu trên màng. Phương pháp
này cho phép xác định được những đoạn DNA có kích thước lớn chỉ với một
nồng độ nhỏ trong hỗn hợp vốn khó có thể xác định được bằng các phương
pháp khác như nhuộm ethedium bromide [12], [126].
1.4.2.2. Ứng dụng trong chẩn đoán DMD
Ngoài việc phát hiện được đột biến xóa đoạn, Southern blot còn cho
phép xác định các đột biến lặp đoạn gen dystrophin. Ở bệnh nhân đột biến
mất đoạn, băng lai của các exon bị đột biến và đoạn dò đặc hiệu không xuất
hiện trên phim. Đối với các bệnh nhân đột biến lặp đoạn, có hiện tượng tăng
cường độ phát sáng của băng lai với exon bị lặp đoạn khi so sánh với mẫu đối
chứng. Ngoài ra, Southern blot còn được sử dụng để phát hiện người mẹ và
chị em gái của bệnh nhân ở dạng dị hợp tử. Prior (2005) đã sử dụng phương

1 2
3
Chứng
nữ
Exon 19
Exon 5023
1.4.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)
1.4.3.1. Nguyên tắc
Sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, được gọi là mẫu
DNA dò (probe DNA) để phát hiện một trình tự đớch. Cỏc mẫu DNA dò
được đánh dấu huỳnh quang và sẽ lai với DNA đớch trờn NST ở kỳ giữa hoặc
gian kỳ. Nhờ sự lai của mẫu DNA dò với trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện,
định vị được vị trí chuỗi DNA đặc hiệu qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh
quang [5].
1.4.3.2. Ứng dụng trong chẩn đoán DMD
FISH là một kỹ thuật giúp chẩn đoán hiệu quả các bệnh lý di truyền nói
chung và bệnh lý DMD nói riêng. Để chẩn đoán đột biến gen dystrophin,
Ligon (2000) đã sử dụng 2 loại probe:
- Các probe giúp xác định đột biến mất đoạn các exon của gen
dystrophin gọi là cosmid probe có gắn chất huỳnh quang digoxingenin. Khi có
hiện tượng lai đặc hiệu xảy ra, digoxingenin gắn trên probe sẽ phát ra màu đỏ.
- Loại probe thứ hai giúp định vị các NST X (vì gen dystrophin nằm
trên NST X), probe này có gắn biotin. Khi probe lai với NST X thì tâm động
của NST X phát ra màu xanh [84].
Kết quả của nghiên cứu của ba gia đình được thể hiện ở hình 1.9.
Trong phản ứng MLPA, vấn đề thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các
đoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Thông thường, mỗi probe
chứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau (hình 1.10): Hình 1.10. Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA
(Nguồn: Schouten, 2002)
- Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:
+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai
với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 21-30
nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe.

Sản phẩm khuếch đại của các probe được phân tách bằng điện di, số lượng sản
phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản sao của đoạn DNA đích
Biến tính
PCR
Sản phẩm khuếch đại của các probe được phân tách bằng điện di, số lượng sản
phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản sao của đoạn DNA đích
Biến tính
PCR

25
+ Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid
của đoạn này giống nhau cho tất cả các probe. Đõy là vị trí gắn với mồi Y để
khuếch đại probe khi tiến hành phản ứng PCR.
- Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:
+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,