BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH
LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE
DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: PHẠM NGỌC KHÔI

Niên khoá

: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


Nguyễn Thị Băng Sương (Bộ môn Hóa sinh – Đại học Y khoa Huế), Th.S Ngô
Diễm Ngọc (Bệnh viện Nhi Trung ương), KS. Nguyễn Thị Phương Mai (Bệnh viện
Nhi Trung ương), Th.S Thái Hạnh Quyên (Công ty TNHH BCE Việt Nam) và Ông
Robert Schuit (MRC – Holland, Amsterdam, Hà Lan) đã nhiệt tình góp ý, truyền đạt
những kinh nghiệm quý giá để tôi có thể hoàn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp này.
CN. Phan Thị Thùy Ngân, BS. Nguyễn Minh Đức và Anh Chị tại Trung tâm Y
khoa Phước An (HEPA) đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi vào thời điểm cuối của Khóa luận.
Tập thể lớp DH05SH cùng với những người bạn thân của tôi, những người
bạn đã gắn bó, chia sẻ cùng tôi những buồn vui trong suốt quá trình học tập của tôi
cũng như đã hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện Khóa luận này.
Và trên tất cả là lời ghi ơn sâu sắc nhất xin được dành cho Ba Mẹ đã sinh
thành, dưỡng dục, dạy dỗ để tôi có được như ngày hôm nay, với tất cả sự kính
trọng, niềm tự hào và lòng biết ơn chân thành nhất.
TP.HCM, ngày 25 tháng 08 năm 2009
Phạm Ngọc Khôi

iii


TÓM TẮT
Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một trong
những bệnh thần kinh – cơ di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3500 trẻ
trai đẻ sống. Bệnh DMD có bản chất là do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc
thể giới tính X. Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lặp đoạn gen. Kỹ thuật
MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả.
Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước
chẩn đoán đột biến DMD và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện
đột biến mất đoạn gen DMD.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân
được dùng để xác định giới tính và hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân được chẩn

Results: The multiplex PCR method to determine the sex and the MLPA
protocol to detect the size of DNA fragment lost were optimized. The techniques are
easy, visual, rapid and reproducible. All deleted exons were present in
electropherogram results. The previous set of three multiplex PCR only detects twenty
five exons and some exons can not be found by this set in comparison with MLPA.
Conclusion: The multiplex PCR method determined the sex exactly and
specifically; and the MLPA helps to rapid detect all deletions of DMD gene and has
more advantage than the multiplex PCR.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................................iii
Tóm tắt ....................................................................................................................... iv
Summary ..................................................................................................................... v
Mục lục....................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt........................................................................................... x
Danh sách các hình.................................................................................................... xii
Danh sách các biểu đồ và lưu đồ..............................................................................xiii
Danh sách các bảng.................................................................................................. xiv
Chương 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1.

Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1

1.2.

Yêu cầu nghiên cứu......................................................................................... 2

vi


2.4.4. Hóa mô miễn dịch ........................................................................................ 12
2.4.5. Western blot ................................................................................................. 12
2.5.

Chẩn đoán di truyền phân tử ........................................................................ 13

2.5.1. Multiplex PCR ............................................................................................. 13
2.5.2. Southern blot ................................................................................................ 14
2.5.3. DGGE........................................................................................................... 14
2.5.4. MAPH .......................................................................................................... 15
2.5.5. MLPA........................................................................................................... 15
2.5.6. Phân tích liên kết gen ................................................................................... 17
2.5.6.1. RFLP ............................................................................................................ 17
2.5.6.2. STR .............................................................................................................. 18
2.5.7.

FISH ............................................................................................................. 18

2.5.8.

RT – PCR ..................................................................................................... 18

2.5.9.

PTT............................................................................................................... 20

2.6.

Xác định giới tính bằng multiplex PCR....................................................... 26

3.3.1.1. Mẫu bệnh phẩm............................................................................................ 26
3.3.1.2. Mồi ............................................................................................................... 26
3.3.1.3. Hóa chất cho tách chiết DNA ...................................................................... 27
3.3.1.4. Hóa chất cho phản ứng multiplex PCR........................................................ 27
3.3.1.5. Hóa chất cho điện di trên gel agarose .......................................................... 27

vii


3.3.1.6. Thiết bị – Dụng cụ ....................................................................................... 28
3.3.2.

Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA ................................ 29

3.3.2.1. Mẫu bệnh phẩm............................................................................................ 29
3.3.2.2. SALSA® MLPA® Kit P034 – A2 / P035 – A2 DMD / Becker ................... 29
3.3.2.3. Hóa chất cho điện di mao quản trên máy CEQTM 8000 ............................... 30
3.3.2.4. Thiết bị – Dụng cụ ....................................................................................... 31
3.4.

Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 31

3.4.1.

Xác định giới tính bằng multiplex PCR....................................................... 31

3.4.1.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu .................................................................... 31
3.4.1.2. Phương pháp tách chiết DNA ...................................................................... 32


viii


4.2.3. Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh .............................................................. 55
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................ 57
5.1.

Kết luận ........................................................................................................ 57

5.2.

Đề nghị ......................................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 59
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 62

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BMD

Becker muscular dystrophy

bp

base pair

cDNA


dCTP

2’ – deoxycytidine – 5’ – triphosphate

dGTP

2’ – deoxyguanosine – 5’ – triphosphate

dNTP

2’ – deoxyribonucleotide – 5’ – triphosphate

dTTP

2’ – deoxythymidine – 5’ – triphosphate

EDTA

ethylene diamine tetraacetic acid

FISH

Fluorescent in situ hybridization

HDA

Heteroduplex analysis

kb


OD

optical density

PCR

Polymerase chain reaction

x


PTT

Protein truncation test

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

RNA

ribonucleic acid

RT – PCR

Reverse transcriptase – PCR

STR


Trang
Hình 2.1 Kiểu di truyền của bệnh DMD ..................................................................4
Hình 2.2 Chuyển đoạn Xp21 giữa NST X và NST 21 .............................................5
Hình 2.3 So sánh giữa dạng bình thường với DMD và BMD..................................6
Hình 2.4 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong màng tế bào cơ vân. ...................7
Hình 2.5 Vị trí locus Xp21 .......................................................................................7
Hình 2.6 Chuỗi gen dystrophin.................................................................................9
Hình 2.7 Dystrophin liên kết với phức hệ glycoprotein định vị ở màng bao cơ ....10
Hình 2.8 So sánh kỹ thuật MLPA với các kỹ thuật sinh học phân tử khác............16
Hình 2.9 Quy trình kỹ thuật MLPA........................................................................17
Hình 2.10 Thủ thuật chọc ối .....................................................................................20
Hình 3.1 Bộ ly trích DNA của Roche.....................................................................27
Hình 3.2 Máy ly tâm...............................................................................................28
Hình 3.3 Máy ủ nhiệt ..............................................................................................28
Hình 3.4 Máy định lượng DNA..............................................................................28
Hình 3.5 Máy luân nhiệt .........................................................................................28
Hình 3.6 Bể điện di.................................................................................................29
Hình 3.7 Máy chụp hình gel ...................................................................................29
Hình 3.8 Các bộ hóa chất cho điện di mao quản ....................................................30
Hình 3.9 Máy CEQTM 8000 ....................................................................................31
Hình 3.10 Hệ thống 8 mao quản...............................................................................31
Hình 3.11 Đĩa đựng mẫu ..........................................................................................31
Hình 3.12 Nắp đĩa Buffer .........................................................................................31
Hình 3.13 Wetting Tray............................................................................................31
Hình 3.14 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản CEQTM 8000........36

xii


Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu máu ......39

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát gen SRY của thai nhi làm kỹ thuật FISH ....................41
Bảng 4.5 Danh sách gia đình mắc DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán .............42
Bảng 4.6 Kích thước của 25 exon được khuếch đại trong 3 bộ multiplex PCR .....42
Bảng 4.7 Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán ............43
Bảng 4.8 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P034 – A2....................................44
Bảng 4.9 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 – A2....................................45
Bảng 4.10 Danh sách bệnh nhân DMD bị đột biến mất exon (MLPA)....................50
Bảng 4.11 Tần suất mất đoạn các vùng exon của gen DMD ....................................50

xiv


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một
bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính. Bệnh gây nên bởi sự đột biến gen dystrophin,
gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, và đến bây giờ chúng được biết như là một gen
lớn nhất trong cơ thể người với chiều dài hơn 2400 kb, mã hóa bản phiên mã mRNA
dài 14 kb, bao gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron. Protein mã hóa bởi gen
này là dystrophin với khối lượng phân tử là 427 kDa, có chức năng chính trong việc
duy trì sự ổn định của màng cơ. Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, hầu hết những trẻ trai
mắc bệnh đều có triệu chứng suy yếu cơ tiến triển, cuối cùng dẫn đến tàn phế, mất khả
năng đi lại ở lứa tuổi 12 và tử vong ở lứa tuổi 20 – 25 do tổn thương cơ tim và rối loạn
hô hấp.
Bệnh DMD chiếm tỷ lệ cao nhất trong số nhóm bệnh di truyền về thần kinh cơ
(1/3500 trẻ trai) và gây hậu quả nặng nề cho gia đình người bệnh cùng cộng đồng xã
hội. Cho đến nay bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định hoàn tất
với hai vùng đột biến mất đoạn trọng điểm (hotspot region) là vùng 5’ tận cùng (vùng
exon 3 – 19) và vùng trung tâm (vùng exon 45 – 52) chiếm trên 60% tỷ lệ đột biến, đột

1.2. Yêu cầu nghiên cứu
Khóa luận này được tiến hành với mục tiêu xây dựng quy trình xác định chính
xác giới tính thai nhi và quy trình MLPA phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng protocol cho phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi.
Sử dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán các loại đột biến gen dystrophin gây nên
bệnh DMD, và so sánh kết quả chẩn đoán bằng MLPA với kết quả chẩn đoán trước đó
của Bệnh viện Nhi Trung ương dùng kỹ thuật multiplex PCR với 25 cặp mồi đặc hiệu.
Thiết lập quy trình chẩn đoán bệnh DMD trước sinh.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD
Bác sĩ Edward Meryon người Anh là người đầu tiên đã mô tả chi tiết về 8 trẻ trai
trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà hiện nay gọi là bệnh DMD. Đến năm 1861,
nhà thần kinh học người Pháp Guillaume Benjamin Amand Duchenne mô tả dạng giả
phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phân biệt với các bệnh cơ khác
nhau và sau đó, bệnh được mang tên ông. Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen
dystrophin đã được phát hiện đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb. Đến nay,
cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen
đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt
nhất khắc phục hậu quả nặng nề của bệnh.
2.2. Tổng quan về bệnh DMD
Theo Nguyễn Hữu Công (2006), bệnh DMD nằm trong nhóm bệnh loạn dưỡng cơ
với năm đặc trưng: bệnh có tính di truyền; tất cả các triệu chứng đều là do yếu cơ gây
nên, không có biểu hiện của mất phân bố thần kinh, không rối loạn cảm giác; yếu cơ
tăng tiến không ngừng; các triệu chứng chủ yếu khu trú ở các cơ vân, đôi khi cũng có

lại bất ngờ có một đứa con bị mắc chứng bệnh này: đột biến gen đã xảy ra và lưu hành
trong số các phụ nữ của gia đình trong nhiều thế hệ mà không ai hay biết, không có
một trẻ trai nào của các đời thế hệ trước đó sinh ra mắc bệnh hoặc nếu có mắc bệnh
nhưng lại không hay chưa được chẩn đoán phù hợp; trẻ bị bệnh DMD là do thừa
hưởng một đột biến mới, chỉ nảy sinh từ một trong các tế bào noãn của quá trình tạo
trứng của mẹ.
Khi sinh con ra với chứng DMD, bao giờ cũng có thể có khả năng là trên tế bào
noãn bị đột biến gen dystrophin khiến người mẹ này có nguy cơ cao hơn mức bình
thường về việc truyền gen đột biến cho một đứa con khác nữa. Một khi sự đột biến

4


mới được chuyển qua cho đứa con trai hay con gái, em này có thể chuyển nó cho thế
hệ kế tiếp.
Cá thể nam bị bệnh DMD không thể nào chuyển các gen bất thường cho con trai
vì con trai chỉ nhận NST Y từ bố. Thế nhưng, chắc chắn là ông ta sẽ truyền gen đột
biến cho con gái vì con gái chỉ nhận NST X từ bố. Và như thế những người con gái
này sẽ là người mang mầm bệnh và mỗi người con trai của họ có 50% nguy cơ bị mắc
bệnh và cứ thế tiếp diễn.
Khi một trẻ gái thừa kế gen DMD từ người mẹ, thì đồng thời trẻ cũng có được
gen dystrophin tốt từ người bố, nhờ vậy em có đầy đủ protein để bảo vệ mình không bị
mắc bệnh. Các trẻ trai một khi thừa kế sự đột biến sẽ mắc bệnh ngay vì rằng cơ thể các
em không có gen dystrophin thứ hai để bù đắp cho gen bị khiếm khuyết.
Thực tế lâm sàng cho thấy một số phụ nữ mang gen đột biến cũng bị ảnh hưởng
với biểu hiện lâm sàng ở dạng nhẹ hơn. Ở các phụ nữ này, tình trạng khiếm khuyết
dystrophin có thể làm cho các cơ bị yếu ở vùng lưng, chân và tay khiến rất dễ bị mỏi.
Ngoài ra còn có thể có các triệu chứng về tim như cảm giác bị hụt hơi hay không thể
thực hiện được các động tác thể dục vừa phải, đôi khi có thể trở nên rất nghiêm trọng.


Hình 2.3 So sánh giữa dạng bình thường với DMD/BMD (Nguồn: www.humgen.nl).
2.3. Nguyên nhân gây bệnh
Năm 1986, nguyên nhân bệnh đã được xác định là do sự đột biến tại locus định
vị Xp21 mã hóa cho một loại protein đa chức năng tên là dystrophin. Dystrophin là
một protein nằm ở mặt trong màng tế bào cơ vân và hoạt động như là một yếu tố ổn
định chức năng màng, thiếu dystrophin gây biến đổi thoái hóa cả hệ cơ xương lẫn hệ
cơ tim (hình 2.4).
2.3.1. Gen dystrophin và các sản phẩm của nó
Từ đầu những năm 1980 những hiểu biết về bệnh và thay đổi trong chức năng
bệnh này đã có những tiến bộ rất đáng kể, khởi đầu là việc xác định chính xác locus
DMD ở cánh ngắn p của NST Xp21 (Dvies và cộng sự, 1983).
Đến bây giờ nó được biết như là một gen lớn nhất trong cơ thể người với 2400kb,
gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron. Gen có kích thước lớn này mã cho bản
phiên mã mRNA 14kb với nhiệm vụ kiểm soát sự ghép nối và phiên mã một cách tinh
tế, tổng hợp nên protein dystrophin có khối lượng phân tử là 427 kDa (Brown và
Dickson, 1994) (hình 2.5).

6


Toàn bộ cơ

Bó sợi cơ
Màng sợi cơ (vị trí chất dystrophin)
Protein
Màng tế bào cơ

Dystrophin
Hình 2.4 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong
màng tế bào cơ vân (Theo Muscular Dystrophy Association of NSW).

mRNA 5,6 kb mã cho protein 116 kDa có tên là Dp 116 hay apo-dystrophin-2, chỉ
biểu hiện ở hệ thần kinh ngoại biên của người trưởng thành (Blake và cộng sự, 1995).
Promoter G phiên mã cho ít nhất 2 bản phiên mã mRNA 4,8 và 2,2 kb có tên là
apo-dystrophin-1 và apo-dystrophin-3, chúng có các mẫu biểu hiện đồng nhất và dư
thừa trong não bộ và các mô không phải là mô cơ, nhưng không phát hiện được ở mô
cơ xương đã biệt hóa hoàn toàn (Tinsley và cộng sự, 1994).
Gần đây hai bản phiên mã dystrophin bổ sung 260 kDa (Piller và cộng sự, 1993)
và 140 kDa (Lodov và cộng sự, 1995) đã được sáng tỏ, nó khởi đầu từ các promoter R
mới (retina) và B (brain, CNS). Tuy nhiên, tính phức tạp của sự kiểm soát phiên mã
8


gen dystrophin và sự ghép nối của mRNA thì vượt rất xa những protein khung tế bào
đã biết và có thể còn có những bản phiên mã nhỏ khác nữa cũng đang tồn tại.
(A)
Dystrophin genome: Xp21

(B)
Chiều dài đầy đủ của dystrophin: 427 kDa
Domain cuối N

Gắn actin
Exon 1 – 8

Domain mảnh

Tự dimer hóa
Exon 8 – 64

Vùng bản lề

bao cơ với mức đầy đủ ngay khi thai đang phát triển (Arahata và cộng sự, 1988). Ngay
từ giai đoạn sớm của sự tạo cơ, những nguyên bào cơ chưa biệt hóa bình thường đã có
một lượng dystrophin. Sự xuất hiện dystrophin trùng với việc hòa lẫn một cách tự
động các tế bào tạo cơ đơn nhân để hình thành một hợp bào đa nhân sau giảm phân
(Miranda và cộng sự, 1988). Tuy nhiên, trong loạn dưỡng cơ thì không có hay thiếu
hụt nhiều dystrophin, sở dĩ như vậy là do khi các sợi cơ được tái tạo, thoái hóa hay
hoại tử thì kích cỡ sợi sẽ bị biến đổi (Miranda và cộng sự, 1988). Sự vắng mặt của
dystrophin không làm chết tức thời tất cả các sợi cơ ở bệnh nhân DMD và BMD, các
chức năng của chúng vẫn được duy trì trong các quá trình tiến triển của bệnh. Tuy
nhiên, sự tái sinh của các sợi cơ bị hủy hoại không bù đắp được mức độ thoái hóa sợi
cơ ngày càng tăng và tai hại hơn là có thể dẫn đến sự hóa xơ ở các vị trí bị tác động
nghiêm trọng dẫn đến bất ổn định các sợi cơ (Miller và Hoffman, 1994) (Nguyễn Văn
Kình, 2007).

Hình

2.7

Sơ

đồ

đại

diện

của

dystrophin


kinh, hay bệnh dây thần kinh tổn thương sợi trục. Điện thế của đơn vị vận động: trong
bệnh cơ thì thấp bé và hẹp lại, trong yếu cơ do căn nguyên thần kinh thì cao lớn và
rộng ra (Nguyễn Hữu Công, 2006).
2.4.2. Kiểm tra creatine kinase, CK
Trong giai đoạn đầu của tiến trình chẩn đoán, các bác sĩ thường yêu cầu người
bệnh làm xét nghiệm máu bởi vì định lượng enzyme huyết thanh rất có giá trị trong
chẩn đoán bệnh. Creatine kinase là enzyme thường dùng nhất cho chẩn đoán bệnh
DMD, đây là một enzyme xúc tác sự tạo năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và
quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ. Enzyme này xúc tác phản ứng:
Creatine kinase
Creatine + ATP

Phosphocreatine + ADP

11