CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ

IV.1. KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) do Karl Mullis và
cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng DNA in vitro
không cần có sự hiện diện của tế bào.

IV.1.1. Nguyên tắc
Tất cả các DNA polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn
đều cần sự hiện diện của nhữ
ng mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả
năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymeraza sẽ nối dài mồi
để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một
trình tự DNA thì chỉ đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một
mồi xuôi và một mồ
i ngược so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn
sau (hình 4.1):
IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation):
Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử
DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở
94-95 ºC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn m
ạch đôi tách thành 2 mạch đơn.
IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization):
Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong
thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70 ºC tùy thuộc Tm của các mồi sử
dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1phút. Đây là giai đoạn
quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợ
p (hay kéo dài) (extension):
Nhiệt độ được tăng lên đến 72 ºC. Đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymeraza hoạt

Hình 4.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR

IV.1.2. Ứng dụng
PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen của động vật và
thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu, xác định trình tự
của DNA được nhân bản, nhân bản quần thể mRNA để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc
hiệu từ cDNA để làm mẫu lai, xác định sinh vật chuyển gen. PCR cũng
được dùng để phân
tích tiến hoá, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quần thể.

49
PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, vi-rút, ký sinh
trùng (protozoa hay metazoa) và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở cá và tôm
nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm có: (i) ở cá có vi-rút gây bệnh ở cá nheo
mỹ (channel catfish virus-CCV), vi-rút gây nhiễm trùng và hoại tử cơ quan tạo máu
(infectious hematopoietic necrosis virus-IHNV), vi-rút gây nhiễm trùng và hoại tử tuyến
tụy (infectious pancreatic necrosis virus-IPNV), vi-rút gây xuất huyết và nhiễm trùng
máu (viral hemorrhagic septicemia virus-VHSV), vi-rút gây hoại tử hệ thần kinh (viral
nervous necrosis virus-VNNV) và Renibacterium salmoninarum; (ii) ở tôm có vi-rút đốm
trắng (WSSV), vi-rút đầu vàng (YHV), vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập
biểu mô (infectious hypodermal and haematopoeitic necrosis virus-IHHNV), vi-rút gây
hộI chứng taura (Taura syndrome virus-TSV), nội ký sinh trùng và vi khuẩn đặc biệt là
nhóm Vibrio.

IV.1.3. Phương pháp
IV.1.3.1. Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn
Trong phòng thí nghiệm DNA hoặc RNA được ly trích từ mẫu bệnh phẩm. Mô cơ thể

tự nhỏ hơn 1kb.
Trước đây trong phản ứng PCR người ta thường dùng DNA polymeraza I tách chiết từ
DNA polymeraza thông dụng nhất là Taq polymerse được tách ra từ vi khuẩn chịu nhiệt
Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng 94-100 °C. Enzym này có hoạt tính cao nhất ở
nhiệt độ 70-80 °C, có trọng lượng phân tử
là 94kD, gồm 832 axit amin do gen có 2499
cặp bazơ tổng hợp nên. Saiki (1988) đã chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza giảm
50% sau 130 phút ở nhiệt độ 92,5 °C, sau 40 phút ở 95 °C và sau 5-6 phút ở 97 °C. Mặt
khác, nồng độ ion Mg
2+
và dNTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hưởng rất nhiều đến
hoạt tính của Taq polymeraza.
Bốn loại nucleotit thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/mỗi loại nucleotit,
nếu sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotit xãy ra sẽ dẫn tới các lỗi sao chép của
DNA polymeraza.
Nồng độ ion Mg
2+
cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Tuy nhiên không
có một quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản
ứng qua thử nghiệm.
Trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ. Sở dĩ như vậy là
vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn. Trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tă
ng theo
cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu. Sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm do các
nguyên nhân sau:
- Hoạt tính của polymeraza giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao
- Sự cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
- Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau
- Sự xuất hiện c
ủa các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.

- PCR có thể được thực hiện từ mẫu đúc parafin. Nhưng sản phẩm PCR không phù
hợp cho việc giải trình tự về sau.
- DNA khi đ
ã tiếp xúc với formalin hơn 48 giờ sẽ không còn sử dụng cho PCR
được nữa.
Ưu điểm:
- Phương pháp PCR truyền thống rất nhạy chỉ cần một số lượng DNA nhỏ là có thể
khuếch đại và phát hiện. Phương pháp được sử dụng để phát hiện mầm bệnh ở
mức rất thấp.
- DNA là phân tử sinh học khá bền nên PCR có thể áp dụng với những m
ẫu chết
không thể áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy.
- Thao tác thực hiện nhanh.
- PCR được thực hiện với số lượng mẫu rất nhỏ (tối đa là 25 mg mẫu/phản ứng).
Nhược điểm:
- Dễ bị tạp nhiễm: do tính nhạy cao, lỗi thao tác
- Đòi hỏi thêm phương pháp chẩn đoán khác để xác định tác nhân gây bệnh 52
IV.1.5.2. PCR phiên mã ngược
Nguyên lý: PCR phiên mã ngược (reverse transcriptase PCR) là phương pháp PCR được
sử dụng để khuếch đại, phân lập hay xác định thư viện RNA của mô hay tế bào. Để thực
hiện RT-PCR trước hết RNA sau khi ly trích phải được phiên mã bằng men phiên mã
ngược (
Reverse transcriptase) để chuyển RNA thành cDNA (complementary DNA) rồi
thực hiện PCR truyền thống với cDNA (xem hình 4.2). Hình 4.2. Nguyên lý RT-PCR

(restriction enzyme-RE). Sự di chuyển của DNA từ thạch đến màng thấm và sử dụng mẫu
dò DNA qua phương pháp lai phân t
ử để phát hiện các đoạn DNA với trình tự đặc hiệu.
Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu
dò DNA với các phân tử DNA được lưu giữ trên giá thể để dò tìm các phân tử sinh học
đặc trưng. Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh
học có cấu trúc phân tử phức tạp. Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có
khả nă
ng gắn kết vào giá thể lưu giữ như màng nitrocellulose, màng nylon, màng giấy
cellulose, nhưng vẫn duy trì được khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác.

IV.2.2. Phương pháp
Phương pháp Southern được Giáo sư Edwin M. Southern xây dựng và thử nghiệm thành
công vào năm 1975. Ở đây, quá trình lai phân tử xảy ra khi hai đoạn mạch đơn DNA bắt
cặp và gắn kết với nhau trên nguyên tắc bổ xung cho nhau. Các bước tiến hành trong kỹ
thuật này có thể đượ
c tóm tắt như sau:
- DNA bộ gen được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bằng một hay
nhiều enzym giới hạn (RE) và được phân tách bằng điện di trên bản gel.
- DNA được biến tính ngay trên gel rồi được thấm truyền lên màng lai. Trong quá trình
thấm truyền vị trí các đoạn DNA trên màng lai được giữ nguyên như trên bản gel.

54
- DNA cố định trên màng được đem lai với mẫu dò DNA có đánh dấu bằng phóng
xạ hoặc hoá học. Sau quá trình lai người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò
không bắt cặp.
- Cuối cùng người ta dùng kỹ thuật phóng xạ hoặc hoá học tự ghi để định vị các
phân tử lai và hiển thị trên phim thành từng băng dạng vạch ngang.
Việc phát hiện các phân tử trên màng được tiến hành thông qua kỹ thuậ
t đánh dấu. Phổ


Hình 4.3: Cấu trúc của Alkali-labile Digoxigenin (DIG) - dUTP
Ở phương pháp thứ nhất (hình 4.4a), với DIG-dUTP có trong hỗn hợp phản ứng PCR, sản
phẩm mẫu dò được tạo ra rất đặc hiệu và có độ nhạy cao. Chỉ cần 10 pg đối với DNA plasmit
hoặc 10 ng đối với DNA genom là đủ để tạo ra mẫu dò lai Southern. Phương pháp đánh dấu
DNA bằng PCR đặc biệt thuận lợi trong dò tìm bản gen đơn lẻ trên màng thấm hệ gen.

55
Trong phương pháp thứ hai (hình 4.4b), enzym Klenow sao chép khuôn mẫu DNA với sự
có mặt của các đoạn 6 nucleotit ngẫu nhiên và DIG-dUTP. Trung bình cứ 20-25 nucleotit
trên mạch DNA mới tổng hợp có một phân tử DIG gắn vào. Như vậy, mẫu dò tạo ra được
đánh dấu đồng đều, rất nhạy, có thể dò tìm đích trong 0.10-0.03 pg DNA. Sản phẩm mẫu
dò là tổ hợp của các đoạn có độ dài khác nhau. Không giống như đáng dấu bằng PCR,
phương pháp này
đỏi hỏi phải có khuôn mẫu DNA rất sạch.
Tín hiệu từ mẫu dò sau khi đã lai với axit nucleic trên màng được phát hiện nhờ kỹ thuật
hoá miễn dịch. Đó là phản ứng liên kết giữa kháng thể của Digoxigenin và Digoxigenin
gắn trong mẫu dò. Tiếp theo, các phân tử liên kết này được nhìn thấy nhờ vào phản ứng
với hợp chất tạo sắc hoặc phát quang. Các hợp chất tạo sắc tạo ra ra tín hiệu màu trực
ti
ếp trên màng. Còn các hợp chất phát quang có độ nhạy cao thì sản sinh ra ánh sáng có
thể ghi nhận lại trên phim X-quang giống như ở phương pháp đánh dấu bằng chất phóng
xạ
32
P hay
35
S.

IV.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật lai Southern
Kỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng được sử

định mẫu phân tích mô bệnh học. Mẫu dò trong lai In situ thường được đánh dấu bằng
phương pháp hóa học (chất phát huỳnh quang). Các mẫu dò này đượ
c tổng hợp từ những
nucleotide mang những liên kết hóa học đặc biệt. Các mẫu dò này sau khi lai sẽ được
phát hiện nhờ kháng thể hoặc các protein khác nhận biết các liên kết hóa học của chúng.

IV.3.2. Ứng dụng
Phương pháp lai In-situ phát hiện được sự có mặt và vị trí axit nucleic của mầm bệnh trên
mô giúp thiết lập sự liên quan giữa mầm bệnh và vật chủ.

IV.3.3. Mẫu phân tích
Mẫu mô cố định trong paraffin 57
IV.3.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp
IV.3.4.1. Ưu điểm:
Lai in-situ rất hữu hiệu trong việc xác định sự có mặt của mầm bệnh trên vết thương hay
trong mô của vật chủ bị bệnh. Giúp thiết lập sự liên quan giữa mầm bệnh và vật chủ.
IV.3.4.2. Nhược điểm:
phương pháp lai in-situ khó thực hiện và đòi hỏi thời gian và trình độ chuyên môn để
thiết k
ế qui trình.

IV.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV
1. Shimkets, R. A. (2004). Methods in Molecular Biology.
2. Southern, S. A. and Herrington, C. S. (1998). In-situ hybridization. In: PCR In-Situ
hybridization: A practical approach.
3. Yeary, T. J. (2004). A primer on Diagnostic Virology: Direct and Molecular-Based
Detection of Viral Pathogenesis.