CHƯƠNG V: MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN

V.1. PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT PCR
Quy trình chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên các loài thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật
PCR tiêu chuẩn ngành (28 TCN202:2004) do Bộ Thủy sản ban hành năm 2004.
(nguồn:

V.1.1. Ðối tượng và phạm vi áp dụng
- Quy trình này quy định trình tự, nội dung phương pháp phát hiện vi-rút gây hội chứng
đốm trắng (sau đây gọi tắt là bệnh vi-rút đốm trắng) bằng kỹ thuật Polymerase Chain
Reaction (sau đây gọi tắt là PCR).
- Quy trình này để chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên tôm bố mẹ, tôm giống, tôm
nuôi thương phẩm của các loài tôm thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật PCR. Có thể sử
dụng Quy trình này
để chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng cho các loài giáp xác khác.

V.1.2. Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành
- Lightner D.V. (Ed.) (1996). Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for
Diseases of Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, USA.
- Lo C.F., Ho C.H., Peng S.E., Chen C.H., Hsu H.C., Chiu Y.L., Chang C.F., Liu K.F.,
Su M.S., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). White spot syndrome baculovi-rút (WSBV)
detected in cultured and captured shrimps, crabs and other arthropods. Dis. Aquat.
Org., 27, 215-225.
- Lo C.F., Leu J.H., Ho C.H., Chen C.H., Peng S.E., Chen Y.T., Chou C.M., Yeh P.Y.,
Huang C.J., Chou H.Y., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). Detection of baculovi-rút
associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase
chain reaction. Dis. Aquat. Org., 25, 133-141.
- Newton C.R. and Graham A. (1994). PCR. The Alden ss Ltd, Oxford, UK.

V.1.3. Giải thích thuật ngữ
- Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) là kỹ thuật sử dụng chuỗi các phản ứng nối

- Bộ phận chụp ảnh để lưu kết quả.
- Tủ lạnh nhiệt
độ -20
o
C hoặc thấp hơn.
- Tủ lạnh nhiệt độ 4
o
C.
- Tủ thao tác vô trùng.
- Tủ sấy dụng cụ.
- Lò vi sóng (microwave).
- Cân phân tích (độ chính xác tới 0.001 g).

60
- Micropipette các loại: 1 - 5; 5 -10; 20 -100 và 100 -1000 ml.
- Ống eppendorf chuyên dùng cho PCR các loại: 1,5 ml và 0,5 ml.
- Ðầu típ có lọc.
V.1.4.2. Mồi, hóa chất
Mồi
Mồi đặc hiệu của vi-rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) sử dụng trong kỹ thuật PCR 2
bước gồm có mồi xuôi (146F1, 146F2) và mồi ngược (146R1, 146R2) được thiết kế từ
trình tự DNA SalI 146. Trình tự mồi cụ thể như sau:
 146F1: 5’ ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG 3’ (mồi xuôi);
 146R1: 5’TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A 3’ (mồi ngược);
 146F2: 5’GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A 3’ (mồi xuôi);
 146R2: 5’ TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T 3’ (mồi ngược).
Nồng độ của mồi sử dụng trong phân tích
được pha loãng thành 25 mM trong dung dịch đệm
TBE. Ðệm TBE có thành phần như sau: 10 mM Tris -HCl (pH = 8,0) và 1 mM EDTA.
Hóa chất

Thang DNA fX174/HaeIII
Dung dịch đệm TBE (Tris - axit boric - EDTA)
 EDTA (ethylene diamine tetra acetic) 0,5 M: hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml
nước rồi chỉnh cho dung dịch có pH = 8 bằng NaOH. Sau đó, thêm nước cất cho
đủ 500 ml. Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ trong phòng.
 TBE 1 X:
 Tris: 108 g
 Axit boric: 55 g
 EDTA 0,5 M: 40 ml
 Pha chế dung dịch 10 X (đậm đặc 10 lần) bằng cách hòa tan 108 g Tris và 55 g
axit boric trong khoảng 600 ml nước. Sau đó, thêm 40 ml EDTA 0,5 M rồi chỉnh
thể tích bằng nước cho đủ
1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ trong phòng. Khi sử dụng
mới pha loãng với nước cất vô trùng thành dung dịch 1 X.
Agarose 1% trong dung dịch TBE
Dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue và glycerol) 6 X gồm: bromophenol blue 0,25 %
và glycerol 40 %
Dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml)

V.1.5. Chuẩn bị mẫu
V.1.5.1. Số lượng mẫu
Ðối với mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae): Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng là 100
mg cá thể lấy nguyên con.
Ðối với mẫu tôm bố mẹ: Lượng mẫu dùng cho mỗi phả
n ứng là 100 mg lấy ở phiến mang
tôm hoặc cuống mắt hoặc chân bơi.
Ðối với mẫu tôm thương phẩm: Lượng mẫu cần dùng cho mỗi phản ứng là 100 mg lấy ở
phiến mang tôm. Mẫu tôm thương phẩm được lấy trong 2 trường hợp:
a) Nếu ao có tôm bị bệnh, phải lấy mẫu khoảng 10 - 20 cá thể có dấu hiệu bệnh lý
rõ nhất.

Thành phần 50 ml phản ứng PCR bước 1 như sau:
 Ðối với mẫu thử: hút 46 ml PCR master mix cho vào ống eppendorf 0,2 ml rồi
thêm vào 1 ml mồi 146F1 và 146R1 có nồng độ 25 mM và 2 ml dịch chiết DNA
từ mẫu cần phân tích.
 Mẫu đối chứng dương: thay dịch chiết DNA từ mẫu cần phân tích bằng dịch chiết
DNA từ mẫu bệnh đốm trắng đã biết.
 Mẫu đối chứng âm: thay dịch chiết DNA từ
mẫu cần phân tích bằng nước cất vô trùng.
Bước khuếch đại lần 2
 Hút 46 ml PCR master mix cho vào ống eppendorf 0,2 ml rồi thêm vào 1 ml mỗi
mồi 146F2 và 146R2 có nồng độ 25 mM và 2 ml sản phẩm khuếch đại lần 1.
 Phản ứng khuếch đại PCR cả 2 bước được thực hiện trên máy luân nhiệt và cài đặt
với cùng một chế độ phản ứng.
Chế độ phản ứng khuếch đại: ở nhiệt độ 94
o
C trong 4 phút (1 chu kỳ); ở nhiệt độ
94
o
C trong 1 phút; ở nhiệt độ 55
o
C trong 1 phút; ở nhiệt độ 72
o
C trong 2 phút (39 chu
kỳ); ở nhiệt độ 72
o
C trong 2 phút (1 chu kỳ); ở nhiệt độ 4
o
C cho đến khi phân tích.

63

V.1.8. Quy định về đảm bảo an toàn
Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các quy định sau đây:
 Thuốc nhuộm ethidium bromide là một chất độc có thể gây ung thư cho người và
động vật. Do đó, khi sử dụng hóa chất này phải mang găng tay và kính bảo hộ. Dung
dịch sau sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ.
 Chỉ được bật đèn cực tím UV để quan sát kết qu
ả sau khi đã đóng kính bảo vệ.
 Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc
chuẩn bị mẫu.
 Phòng thí nghiệm phải bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý
sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.

V.2. PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV
Nguồn: Farming IntelliGene Technology Corporation ()
V.2.1. Giới thiệu
Kit IQ2000 (Farming Intelligene, Đài Loan) phát hiện và định loại YHV/GAV trên tôm
he là một hệ thống thương mại sinh học phân tử cho việc phát hiện hai loại virut này.
IQ2000 YHV/GAV có thể phát hiện và phân biệt prototype của hai loại vi-rút này và cho
kết quả mức độ nhiễm dựa theo các mẫu đối chứng. Đặc điểm sinh học tự nhiên của
GAV và YHV và trình tự RNA của chúng được sử dụng để thiết kế bộ kit dựa vào kết
qu
ả nghiên cứu của CSIRO, Úc và BIOTEC, Thái Lan.
Nhiều kết quả nghiên cứu gần đây ở các nước Đông Nam Á cho thấy có nhiều virut khác
có quan hệ với YHV/GAV. Do chưa có thông tin đầy đủ về các virut mới này nên Kit
IQ2000 YHV/GAV có thể không phát hiện được những virut có liên quan với virút
YHY/GAV, hay có thể phản ứng chéo với những virut này. Sự tác động và ảnh hưởng
của những virut này đối với ngành công nghiệp nuôi tôm và mối quan hệ giữa chúng với
YHV/GAV phát hiện đầu tiên hiện nay v
ẫn còn đang được nghiên cứu.


5. Máy lắc
6. Máy ủ
7. Pipet tự động
8. Hệ thống chụp ảnh
9. Cân
10. Chloroform
11. 95% ethanol
12. Ethidium bromide
13. Dung dịch điện di là TAE hoặ
c TBE
14. Agarose
15. Nước cất
16. Iso-propanol (2-propanol)

66
V.2.4. Giới hạn phát hiện và tính nhạy
Giới hạn phát hiện và tính nhạy của kit IQ2000 YHV/GAV tùy thuộc vào nguốn mẫu
chẩn đoán. Dựa vào đặc điểm phân bố của virut trên tôm, mang là cơ quan tốt nhất để thu
mẫu đối với tôm ấu niên và tôm trưởng thành. Các nguồn mẫu thường dùng để chẩn đoán
được trình bày ở bảng sau:
Bảng 5.1: Các nguồn mẫu dùng để chẩn đoánn WSSV
Mẫu Số lượ
ng kiểm tra Giới hạn phát hiện Đương lượng của
tính nhạy cảm
Plasmid DNA
YHV/GAV
2 bản sao 2 bản sao/ phản ứng
2 bản sao/µl mẫu
plasmid
In vitro transcribed

propanol (isopropanol).
e. Lắc nhẹ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol.
f. Rửa phần viên bằng 0.5 ml ethanol 75%, sau đó ly tâm cho lắng xuống trong 5
phút ở 7500 vòng/phút đến khi xuất hiện phần viên, sau đó rút bỏ ethanol và
làm khô phần viên.
g. Hoà tan phần viên với nước cất.
V.2.5.2. Hoà tan RNA
Do các mẫu có nguồn gốc khác nhau có hàm lượng RNA khác nhau, cần điều chỉnh
nồng độ RNA bằng cách hoà tan với lượng dung dịch nước cất khác nhau:
Nguồn mẫu Liều lượng
Tôm bột 500 µl
Mang 200 µl

V.2.6. Qui trình khuếch đại
V.2.6.1. Chuẩn bị hoá chất phản ứng
a. Phản ứng RT-PCR 1: 8 µl/phản ứng
Chuẩn bị các chất cần thiết sau:
- RT - PCR Pre-Mix reagent 7.0 µl
- Iqzyme DNA Polymerase 2 Ul/µl 0.5 µl
- Reverse Transcription (RT)Enzyme Mix 0.5 µl
b. Phản ứng nested PCR : 15 µl/phản ứng

Chuẩn bị các chất cần thiết sau:
- Nested Pre-Mix reagent 14 µl
- Iqzyme DNA Polymerase 2UI/µl 1 µl
V.2.6.2. Điều kiện phản ứng
a.
Phản ứng RT-PCR 42 °C trong 30 giây
94 °C trong 2 phút


dương. Cần phải giữ mẫu đối chứng dương ở - 20 °C khoảng 1 tuần trước khi sử dụng.

69

V.2.7. Điện di
V.2.7.1. Chuẩn bị bản thạch (gel)
a. Trước tiên, chọn dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE hay TBE. Sau đó pha
loãng dung dịch ở nồng độ 1X để chuẩn bị gel và làm dung dịch đệm để chạy
điện di. Lưu ý dung dịch dùng chạy điện di và chuẩn bị gel phải giống nhau.
b. Nên sử dụng 2 % agar (2 g/100 ml). Hoặc điều chỉnh theo tỉ lệ cho thích hợp.
Nên s
ử dụng chai có miệng rộng hay bình tam giác.
c. Đun nóng dung dịch agar cho tới khi agar tan hoàn toàn. Có thể sử dụng đèn cồn,
bếp ga, nồi đun hoặc lò vi ba. Tránh để gel sôi quá tràn ra ngoài.
d. Để nguội gel khoảng 50 °C và đổ agar từ từ vào khay đựng gel. Thể tích gel tùy
thuôc vào kích cỡ của khay đựng gel. Thường bề dày của gel chỉ cần cao hơn đáy
của lược gel khoảng 0.3 - 0,5 cm và bề dày của gel không quá 0.8 cm.
e. Cẩn thận di chuyển lược gel và các khoá ở
hai bên khi gel đã đặc lại. Gel sẽ được
đem đi điện di. Không nên để gel ở nhiệt độ phòng lâu hơn 4 giờ.
V.2.7.2. Điện di
a. Cho gel vào bồn điện di. Phân tử DNA sẽ di chuyển sang cực dương vì DNA
mang điện tích âm.
b. Thêm dung dịch điện di vào hộp cho tới khi dung dịch này vừa bao phủ gel.
c. Thêm 5-10 µl dung dịch nạp mẫu vào trong từng giếng một. Dung dịch nạp
m
ẫu sẽ chìm xuống đáy giếng vì nó nặng hơn dung dịch đệm, cẩn thận để
tránh làm nhiễm mẫu.
d. Phải dùng thang DNA cho từng gel, mỗi gel dùng 5 µl cho hai giếng hai đầu.
Mục đích của việc sử dụng thang DNA là nhằm để xác định trọng lượng phân


Hình 7.2. Gel chuẩn dùng chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000
- Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng
- Cột 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bản sao/phản ứng
- Cột 3: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng
- Cột 4: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 2000 bản sao/phản ứng
- Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng
- Cột 6: Mẫu chuẩ
n nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng
- Cột 7: Mẫu nhiễm YHV nặng
- Côt 8: Mẫu nhiễm YHV nhẹ
- Cột 9: Mẫu nhiễm GAV nặng
- Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ

71
- Cột 11: Mẫu âm tính YHV/GAV
- Cột M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp
2. Những mẫu YHV/GAV âm tính hiện vạch 680 bp là RNA thông tin của tôm.
3. Phương thức chẩn đoán
a. Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng với vạch 277 bp và vạch 777 bp thì mẫu
nhiễm YHV nặng.
b. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 277 bp thì mẫu nhiễm YHV nh
ẹ.
c. Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng với vạch 406 bp và vạch 777 bp thì mẫu
nhiễm GAV nặng.
d. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 406 bp thì mẫu nhiễm GAV nhẹ.
e. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 680 bp thì mẫu âm tính YHV/GAV.
4. Mỗi xét nghiệm PCR cần có mẫu đối chứng âm và dương. Nếu mẫu đối chứng d
ương
có 10

hoặc quá nhẹ
Thay thang DNA hoặc tăng thêm lượng
thang DNA nạp vào
Thang DNA hiện vạch
bình thường nhưng đối
chứng dương không
hiện vạch nào
1. RT sai hoặc PCR sai hoặc
cả hai
2. Chưa cho Iqzyme vào
3. Đối chứng dương bị hỏng
1. Kiểm tra phần chuẩn bị thuốc thử và
lập trình PCR
2. Cho thêm Iqzyme vào
3. Thay đối chứng dương mới
Đối chứng dương 10
3

hiện vạch nhưng đối
chứng dương nhiễm
nhẹ không hiện vạch
1. Đối chứng dương mất
phẩm chất
2. Đối chứng dương 10
4
mất
phẩm chất
3. Iqzyme hoạt động kém
1. Thay đối chứng dương mới
2. Thay đối chứng dương 10

1.6 đến 1.8
3. Dùng đối chứng dương 10
3
cho phản
ứng PCR. Nếu kết quả cho ra vạch
bình thường thì phản ứng PCR không

73
bị ức chế. Nếu đối chứng dương 10
3

không hiện vạch thì phản ứng PCR
bị ức chế cần ly trích RNA lại.

V.3. PHÁT HIỆN VI KHUẨN Ở CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP
V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn
(nguồn: Diagnostic Bacteriology, AAHRI, 1996)
Các mẫu bệnh phẩm thủy sản được khử trùng bằng cồn 70
o
và giải phẫu bằng bộ tiểu
phẫu vô trùng. Vi khuẩn được phân lập từ gan, thận hay tụy và cấy lên môi trường
Tryptic Soy Agar (TSA, Difco) và sau đó là môi trường chọn lọc, chẳng hạn như
Aeromonas agar (Oxoid) có chứa ampicilin (theo hướng dẫn của nhà sản xuất), hay môi
trường TCBS. Đĩa agar được ủ 24 giờ ở 28 °C. Các khuẩn lạc đặc trưng được chọn để
xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hoá và kiểu ribosom cùng với chủ
ng chuẩn. Các
chủng vi khuẩn được trữ ở -80 °C trong môi trường nutrient broth (NB, Oxoid) có chứa
15% glycerol và 1-1.5 % NaCl tuỳ theo mẫu là thuỷ sản nước ngọt hay nước lợ.

V.3.2 Phương pháp RFLP

sodium acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0).
V.3.2.3. Quá trình khử puria, biến tính và thấm chuyển
Gel sau khi chạy điện di được ngâm 10 phút ở nhiệt độ phòng trong dung dịch khử puria
0.25 M HCl, rửa bằng nước cất và được xử lý 30 phút trong dung dịch 0.5 M NaOH và 1.5
M NaCl để làm biến tính DNA. Sau
đó, DNA trên gel được chuyển qua màng nylon bằng
máy thấm chuyển chân không và được để 30 phút ở 80 °C để cố định DNA trên màng.
V.3.2.4. Quá trình tiền lai và lai DNA trên màng
DNA trên màng nylon được thấm với 20 ml dung dịch tiền lai và giữ 1 giờ ở 56 °C, rồi
lai qua đêm ở 56 °C trong dung dịch lai chứa mẫu dò có trình tự bổ sung với RNA
ribosom 16S và 23S của vi khuẩn. Mẫu dò được đánh dấu bằng digoxigenin. Sau khi lai,
màng được rửa nhiều lần với dung dịch rửa.
V.3.2.5. Phát hi
ện các vạch DNA
Màng nylon được ngâm 30 phút trong 5 % dung dịch cản, rồi được ủ 30 phút trong 40 ml
dung dịch ủ có chứa 8 µl phosphatase labelled anti-digoxigenin. Sau cùng các vạch DNA
được phát hiện bằng dung dịch có chứa chất nền phát màu (90 µl nitrobluetetrazolium
chloride-NBT và 66 µl 5- bromo-4-chloro-2-indolylphosphat toluidinium salt-BCIP
trong 20 ml dung dịch nhuộm).

V.3.3. Xử lý thống kê
(nguồn: Kerry Bartie, Đặng Thị Hoàng Oanh, Geert Huys, Cathryn Dickson, Margo
Cnockaert, Jean Swings, Nguyễn Thanh Phương, Alan Teale. (2007). Ứng dụng rep-pcr
và pfge để định type vi khuẩn kháng chloramphenicol phân lập từ các trại nuôi thủy sản ở
đồng bằng sông cửu long. Tạp chí Công nghệ Sinh học 4 (1): 1-10)
Màng chứa các vạch DNA được xử lý bằng phần mềm GelCompar (Applied Maths, Bỉ). Tỉ
số đồng dạng các vạch DNA của các chủng vi khuẩn được điểm số bằng hệ s
ố tương quan
Pearson. Mức độ đồng dạng kiểu DNA của từng cặp chủng vi khuẩn được tính bằng phương
pháp phân tích cụm với UPGMA và biểu thị bằng sơ đồ quan hệ của các chủng vi khuẩn.


.

.

.
.

.

.

.
.

.
.

.

.

.

.

.

.



A
TCC 15468

VN VII 4 Sp (8)

VN Vui 3 L (8)

VN K 19 (9)

VN V K 1 (10)

VN H V (11)

VN Thien HK (12)
A
. hydrophila
A
. ssobria
A
. caviae
molecular weight marker

Hình 7.3. Sơ đồ quan hệ các chủng vi khuẩn nghiên cứu với chủng chuẩn dựa trên kiểu
ribosom xác định bằng hệ số tương quan Pearson tính bằng UPGMA sử dụng phần mềm
GelCompair. Thang DNA (Molecular mass marker): Hind III-digested l DNA. (Nguồn:
Đặng Thị Hoàng Oanh. 2006. Đặc điểm sinh hoá và kiểu RNA ribosom của vi khuẩn
Aeromonas phân lập từ bệnh phẩm thuỷ sản nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tạp Chí
Khoa học số 5. Đại học Cần Thơ).


lập vi khuẩn để tránh trường hợp tạp nhiễm.
Dùng dung dịch 70 % ethanol sát trùng mặt ngoài của cá, lau sạch chất
nhầy trên da cá. Dùng kéo tiệt trùng để mổ cá.
Chú ý: khi mổ cá, tránh làm vỡ các cơ
quan nội tạng. Cần nhấc mũi kéo lên
tránh làm thủng ruột, vì đây là nguồn tạp nhiễm làm ảnh hưởng đến kết quả
phân lập.
Kiểm tra toàn bộ các cơ quan nội tạng. Ghi nhận đầy đủ các trạng thái
không bình thường hoặc các dấu hiệu bệnh lý như quan sát màu sắc, hình

77
dạng và các dấu hiệu khác thường trên gan, thận và tỳ tạng (xem chi tiết ở
mục 2.1.1.3).
 Phải quan sát vị trí của các cơ quan nội tạng, tình trạng chất dịch trong
xoang cơ thể (có hay không, nhiều hay ít, màu gì, độ đục). Lấy chất dịch
làm tiêu bản nhuộm Gram.
 Phân lập vi khuẩn trên gan, thận và tỳ tạng (lá lách) và cấy lên đĩa TSA
hoặc NA. Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 28-30 °C. Sau 18-24 gi
ờ, quan
sát và ghi nhận đặc điểm hình thái của các khuẩn lạc.
b. Thu mẫu cá chết và mẫu mô
Trong nhiều trường hợp,không thể thu và chuyển mẫu sống đến phòng thí nghiệm
để chẩn đoán thì có thể vận chuyển mẫu chết hoặc mẫu mô. Phương pháp thu và
vận chuyển mẫu phải được phòng thí nghiệm nhận mẫu phân tích tư vấn cho phù
hợp với phương pháp sẽ được sử dụng t
ại phòng thí nghiệm đó.
 trường hợp cá nhỏ thì có thể giữ riêng từng cá trong túi nilon, làm dấu và
giữ trong nước đá chuyển về phòng thí nghiệm.
 trường hợp cá lớn thì phải lấy bỏ phần nội quan (thao tác phải tiệt trùng) và
giữ trong hộp nhựa hay túi nhựa vô trùng và giữ trong nước đá chuyển về


37-40% formaldehyde 100 ml
Nước cất 900 ml
NaH
2
PO
4
.H
2
0 4.0 g
Na
2
HPO
4
6.5 g

2. Phụ lục 1b. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở tôm
1. Ghi lại các thông tin về ao thu mẫu (địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, tôm nuôi
bao nhiêu tuổi, mô tả dấu hiệu bệnh, ghi nhận thông tin về quản lý ao nuôi v.v.).
2. Thu mẫu tôm
- Thu mẫu tôm có dấu hiệu bị bệnh, phải thu tôm lờ đờ nhưng còn sống không thu
tôm chết. Mỗi ao thu từ 15-20 con. Chuyển tôm về phòng thí nghiệm trong thùng
mướ
p hay xô nhựa có sục khí. Về đến phòng thí nghiệm chỉ xử lý những mẫu còn
sống (tối thiểu là 10 tôm/ao).
- Mỗi ao thu 2-3 tôm khỏe
- Xử lý mẫu (mỗi con tôm được xem là một mẫu)
a. Phân lập vi khuẩn
i. Dùng ống chích 1ml (kim tiêm tiệt trùng) lấy huyết tương từ ở gốc
chân bò thứ năm hoặc lấy trực tiếp từ tim.


3. Phụ lục 1c. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở nhuyễn thể
1. Ghi lại các thông tin về mẫu thu (địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, nuôi bao
lâu, mô tả dấu hiệu bệnh, ghi nhận thông tin về môi trường nuôi v.v.)
2. Thu mẫu nhuyễn thể còn sống
Nên giữ mẫu nhuyễn thể trong giấy tẩm nước để chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu
sau khi thu phải được chuyể
n đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt để hạn chế tối
đa sự mất oxy trong mô nhuyễn thể và giảm số lượng nhuyễn thể chết trong quá trình
vận chuyển nhất là trường hợp nhuyễn thể thu bị bệnh và sắp chết. Công việc xử lý
mẫu tại phòng thí nghiệm cũng phải được chuẩn bị sẵn để xử lý mẫu ngay khi chuyển
về đến phòng thí nghiệm.
3.
Cố định mẫu nhuyễn thể
Trường hợp không thể thu mẫu sống hay do khó vận chuyển về phòng thí nghiệm thì
có cố định mẫu trong dung dịch cố định. Mẫu cố định chỉ có thể dùng cho xét nghiệm
mô bệnh học chứ không thể phân lập vi khuẩn hay nấm.
Dung dịch cố định dùng cho nhuyễn thể có thành phần như sau:
i) Dung dịch 1G4F (1% Glutaraldehyde : 4% Formaldehyde)
* Dung dịch gốc 1G4F – có thể giữ ở 4 ºC trong vòng 3 tháng:

80
- 120 ml 37-40% dung dịch đệm formalin **
- 20 ml 50% glutaraldehyde
- 360 ml nước máy
** Dung dịch đệm formalin:
- 1 lít 37-40% formaldehyde
- 15 g disodium phosphate (Na
2
HPO


Cấu tạo giải phẫu của cá xương

(nguồn: FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2). 82
PHỤ LỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở TÔM
(nguồn: FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2;
Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải. (2002).
Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi).

Hình 1. Tôm giống khỏe

Hình 2. Tôm giống yếu
Hình 3. Tôm khỏe

Hình 4. Tôm còi do nhiễm MBV