1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
ĐỖ THỊ MAI
NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN
DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khãa 2009-2013
Hà Nội – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
1
1
2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
ĐỖ THỊ MAI
NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN
DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KhÓa 2009-2013
Giáo viên hướng dẫn:TS. Trần Vân Khánh
Hà Nội – 2013
2
2
3
LỜI CẢM ƠN
Việc được tiến hành nghiên cứu làm đề tài, khóa luận đã giúp tôi học
hỏi được rất nhiều, đó không chỉ là kiến thức mà còn là tác phong và kinh
nghiệm làm việc.
Với tất cả tấm lòng trân trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
của thầy cô và các anh chị tại trung tâm nghiên cứu, tất cả các số liệu trong
khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công
trình nghiên cứu nào khác.
Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013
Người viết khóa luận
Đỗ Thị Mai
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DMD
BMD
DNA
Duchene muscular dystrophy
Becker muscular dystrophy
Deoxyribonucleic Acid
4
4
5
cDNA Complimentary Deoxyribonucleic Acid
CARRIER Người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử
CK Creatin kinase
bp
PCR
Basepair
Polymerase chain reaction
MLPA Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification
NST Nhiễm sắc thể
RNA
dNTP
ddNTP
BN
Ribo Nucleic Acid
“hotspots”là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’của gen dystropin(7)
6
6
7
DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bởi vậy, việc chẩn
đoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân mắc bệnh
loạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợ làm chậm lại các
biến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộc sống cho người
bệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị. Ngoài ra,việc phát hiện
đột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ý nghĩa quan trọng
trong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy cơ cao sinh con
bị bệnh. Phương pháp MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification) hiện đang là phương pháp tối ưu trong xác định đột biến xoá
đoạn, được ứng dụng rộng rãi.
Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất
đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”
được thực hiệnnhằm mục tiêu:
Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân
loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
7
7
8
1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD.
1.1.1. Trên thế giới.
- Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh mô tả chi
tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là
bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (29)
- Năm 1861, Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp
nề của bệnh gây ra.
1.1.2. Ở Việt Nam.
DMD là một bệnh di truyền khá phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam
do đó đã có rất nhiều các đề tài, dự án nghiên cứu được tiến hành mang lại gía
trị to lớn và nâng cao tầm hiểu biết về căn bệnh này. Cụ thể:
- Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS nghiên cứu
xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tại Viện
BVSKTE Hà nội, kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số 107 gia
đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh (1)
- Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang sử dụng một cặp
mồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứng PCR thăm dò ở mức độ gen
cho hai bệnh nhân DMD trong gia đình có 2 thế hệ bị bệnh.
- Năm 2000, Nguyễn Đình Lương và CS đã tiến hành xác định đột biến
xoá đoạn ở bệnh nhân DMD sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR(2)
- Năm 2001, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Trang, Vũ Chí Dũng công
bố tình hình bệnh DMD ở trẻ em Việt Nam tại hội nghị Nhi khoa quốc tế lần
thứ 23 (1).
9
9
10
- Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng năm 2002 nghiên cứu đột biến gen
gây bệnh DMD bằng phương pháp Multiplex PCR và đã phát hiện 6 trường
hợp xóa đoạn trong 11 bệnh nhân được nghiên cứu.
- Năm 2004, Trần Vân Khánh và cộng sự đã chẩn đoán 85 bệnh nhân
Việt Nam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR và phát hiện 38%
có đột biến xóa đoạn gen dystrophin.
- Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn vào năm 2005 đã phát hiện
13 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen trong 21 bệnh nhân được chẩn đoán
là DMD.
- Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang năm 2006 đã nghiên cứu 58
11
12
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng
1.2.2.1. Định lượng hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK) trong huyết thanh
Creatin Kinase (CK) là enzym xúc tác phản ứng tạo hợp chất giàu năng
lượng giúp quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ.
Creatine + ATP
→←
CK
phosphocreatine + ADP
Phosphocreatin là dạng dự trữ năng lượng cho hoạt động của cơ và vận
chuyển chất trong tế bào cơ.
Có ba dạng isoenzym của CK, đó là CK-MM, CK-MB và CK-BB.
Dạng đồng phân CK-MM chiếm 95% của CK toàn phần và tập trung chủ yếu
ở tổ chức cơ vân. Dạng CK-MB chiếm khoảng 5% và tập trung chủ yếu ở mô
cơ tim. Dạng CK-BB chiếm tỷ lệ không đáng kể và khu trú chủ yếu ở tổ chức
não, nó không qua được hàng rào mạch máu não, do đó CK-BB không xuất
hiện trong huyết thanh (11)
Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào nồng độ enzym CK trong máu.
Ở bệnh nhân DMD, gen dystrophin bị đột biến làm thay đổi cấu trúc potein
dystrophin trên màng tế bào, dẫn đến tổn thương màng tế bào cơ và giải
phóng một lượng lớn enzym CK vào máu. Ở bệnh nhân DMD, enzym CK
tăng cao ít nhất 40 lần so với bình thường (bình thường <200 UI/l). Tuy
nhiên, ở giai đoạn muộn của quá trình bệnh, khối cơ còn lại ít và lượng cơ
thoái hóa cũng ítkhiến hoạt độ enzym này giảm thấp (23,11)
1.2.2.3. Sinh thiết cơ
Sinh thiết cơ là một tiêu chuẩn chẩn đoán chính xác nhất. Phản ứng miễn
dịch huỳnh quang khi nhuộm tiêu bản sinh thiết cơ cho thấy sự vắng mặt hoàn
toàn của protein Dystrophin trên bề mặt tế bào cơ. Các sợi cơ với đường kính
không đều và có dấu hiệu của sự thoái hóa hoại tử, thâm nhiễm mô mỡ, mô liên
13
14
điều trị bệnh hiệu quả, các tác giả quan tâm đến bệnh DMD đều nhận định
rằng, trong khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnh
DMD thì biện pháp cơ bản để hạn chế bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne đó là
việc phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái trong gia đình bệnh
nhân) và chẩn đoán trước sinh cho những những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ
và đang mang thai có nguy cơ cao. Phương pháp để phát hiện bệnh được đánh
giá có độ chính xác cao đang được sử dụng là kỹ thuật MLPA (Multiplex
ligation dependent probe amplification) và cách sàng lọc trước sinh cho phụ
nữ mang thai là chọc hút dịch ối, tách DNA của thai nhi và phân tích gen
dytrophin đột biến .Trước khi phân tích DNA của thai nhi phải loại trừ khả
năng nhiễm DNA của người mẹ trong quá trình chọc hút dịch
1.3.Cơ chế di truyền của bệnh
DMD là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X. Mẹ là người
bình thường mang gen bệnh, di truyền bệnh cho con trai. Trong một lần sinh,
nguy cơ của những người mẹ này như sau:
* 50% số con gái là người bình thường mang gen bệnh.
* 50% số con gái là người bình thường không mang gen bệnh
* 50% số con trai là người bình thường không mang gen bệnh
* 50% số con trai là người mắc bệnh DMD
14
14
15
Hình 1.2. Cơ chế di truyền bệnh DMD
(http://di truyền.com)
Trong một vài trường hợp nữmang gen có biểu hiện bệnh khi NST X
không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ
biểu hiện bệnh. Francke (1989) đã phát hiện ra một vài trường hợp nữ mang gen
có biểu hiện rõ ràng của bệnh DMD với một NST X bị bất hoạt. Có khoảng 30%
bảo vệ cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ.
Dystrophin được phân chia làm 4 vùng khác nhau bao gồm: Vùng gắn
với actin, vùng cấu trúc xoắn bậc 3, vùng giàu cystein và vùng C-tận . Bốn
vùng này có chức năng rất khác nhau, một số tác giả đã chứng minh rằng
vùng N-tận, vùng giàu cystein và vùng C-tận có vai trò rất quan trọng với
chức năng của dystrophin, bệnh nhân có đột biến vùng này biểu hiện triệu
chứng lâm sàng rất nặng nề.
17
17
18
Dystrophin liên kết với phức hợp Dystrophin- glycoprotein-complex
(DGC) thông qua sự sự tương tác của vùng C-tận với phức hợp Dystroglycan và
Syntrophin. DGC có vai trò quan trọng đối với chức năng của Dystrophin trong
sự ổn định màng bào tương và là cầu nối tế bào cơ với vùng ngoại bào(7)
Hình 1.6: Cấu trúc mô phỏng của Dystrophin tại màng tế bào cơ
(actionduchene.org.com)
1.6. Các dạng đột biến cấu trúc của gen Dystrophin
1.6.1. Đột biến mất đoạn gen Dystrophin
Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhân
DMD. Đột biến này chiếm khoảng 60÷65% trong tổng số các dạng đột biến.
Đột biến gặp chủ yếu ở 2 vùng trọng điểm (hotspots region) đó là vùng tận
cùng 5’ (exon 1÷19) và vùng trung tâm (43÷60). Khi tiến hành phân tích đột
biến gen Dystrophin, người ta thường hay tập trung phân tích hai vùng này
trước để phát hiện đột biến mất đoạn [29].
1.6.2. Đột biến điểm
Đột biến điểm đứng thứ 2 về mức độ thường gặp, chiếm 25 ÷ 30%, hầu
hết đột biến điểm là dạng tạo ra mã kết thúc sớm (nonsense mutation) và gây
18
18
19
đặc hiệu với 79 exon, khi không thấy xuất hiện đỉnh có nghĩa đã xảy ra đột
biến mất đoạn trên exon.
Cấu trúc probe:
Hình 1.7: Cấu trúc của probe
- Chuỗi oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:
+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai
với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 21-30
nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe.
+ Đoạn 2 chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid của đoạn này
giống nhau cho tất cả các probe. Đây là vị trí gắn với mồi xuôi
- Chuỗi oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:
+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,
+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’,trình tự nucleotid giống nhau cho
tất cả các probe. Đây là vị trí gắn mồi ngược
+ Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’
và 2’,cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu
với DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác
nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau. Do
đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di (6).
20
Vị trí gắn
đặc hiệu
trên gen
đích
Thuốc
nhuộm
huỳnh
quang
Đoạn
đệm
sau lai
Biến tính và
lai hóa
21
22
Bước 3: Nối ghép sau lai(ngày 2): Probe đã gắn vào đọan DNA đích. Giai
đoạn này hai mồi đặc hiệu trên hai chuỗi ngắn và dài kích hoạt kéo dài mạch
theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA đích và nối liền hai chuỗi lại với
nhau. Như vậy sản phẩm thu được là các probe khác nhau với hai chuỗi
oligonucleotid ngắn và dài đã được nối liền.
Bước 4: Phản ứng PCR (ngày 2) sản phẩm là các probe đã được nối liền được
cung cấp thêm các thành phần cần thiết và thực hiện theo chu trình nhiệt đã
được cài đặt đểnhân bản các probe lên nhiều lần (23, 24).
Sản phẩm sau khi khuếch đại được điện di phân tách trên hệ thống
CEQ 8000 (Beckman Coulter). Sau khi điện di mao quản, kết quả được phân
tích bằng phần mềm Gene Marker. Kết quả phân tích được biểu thị dưới dạng
biểu đồ sóng và dưới dạng bảng. Các vị trí gen bị mất đoạn sẽ không có đỉnh
tín hiệu xuất hiện.
1.7.2 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):
PCR là kỹ thuật nhân bản gen trong ống nghiệm.Kỹ thuật này dựa trên
những nguyên tắc cơ bản của quá trình sao chép DNA trong cơ thể sống. Từ
một khuôn ban đầu sẽ cho ra sản phẩm là một lượng lớn các đoạn gen đích
cần nghiên cứu.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba bước được điều hòa bởi nhiệt độ
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao, thường là 94
o
C - 95
o
23
23
24
hành PCR việc nhiễm một lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng có thể đưa tới sự
thất bại của phản ứng, khiến chúng ta không thu được hoặc chỉ thu được một
lượng nhỏ sản phẩm DNA mong muốn(6).
1.7.3.Giải trình tự gen (DNA sequencing):
Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid
(A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine)) trên phân tử DNA.
Hiện này phương pháp enzyme của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở
Việt Nam lẫn thế giới. Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP
(dideoxyribonucleoside triphosphate) là các đồng phân của dNTP
(deoxyribonucleoside triphosphate. Cấu trúc ddNTP tương tự dNTP chỉ có
một điểm khác biệt duy nhất là ddNTP không có gốc OH ở đầu 3’ (vị trí
carbon 3 của deoxyribose), là vị trí để các dNTP tiếp theo gắn vào. Do đó,
phản ứng tổng hợp DNA sẽ được dừng lại tại ngay vị trí mà ddNTP được gắn
ngẫu nhiên vào thay cho dNTP.
24
24
25
Hình 1.10. Hình ảnh minh họa kỹ thuật giải trình tự theo phương pháp
Sanger [32].
Kết quả của phản ứng PCR giải trình tự là có rất nhiều sợi DNA được
tạo thành. Các sợi này có độ dài hơn kém nhau 1 nucleotid.
Sản phẩm PCR giải trình tự sẽ được điện di và đọc kết quả trên máy tự động.
25
25
Copyright: Tài liệu đại học ©