1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
ĐỖ THỊ MAI
NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN
DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khãa 2009-2013
Hà Nội – 2013
1
1
2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
ĐỖ THỊ MAI
NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN
DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KhÓa 2009-2013
Giáo viên hướng dẫn:TS. Trần Vân Khánh
Hà Nội – 2013
2
2
3
LỜI CẢM ƠN
Việc được tiến hành nghiên cứu làm đề tài, khóa luận đã giúp tôi học
hỏi được rất nhiều, đó không chỉ là những kiến thức mà còn là tác phong và
kinh nghiệm làm việc.
Với tất cả tấm lòng trân trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất
cứ công trình nghiên cứu nào khác.
Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013
Người viết khóa luận
Đỗ Thị Mai
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DMD
BMD
DNA
Duchene muscular dystropy
Becker muscular dystrophy
Deoxyribonucleic Acid
cDNA Complimentary Deoxyribonucleic Acid
4
4
5
CARRIER Người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử
CK Creatine kinase
Kb
PCR
Kilo base
Polymerase chain reaction
MLPA Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification
NST Nhiễm sắc thể
RNA
dNTP
ddNTP
BN
Ribo Nucleic Acid
Deoxyribonucleoside triphosphate

7
Như có thể thấy dạng đột biến xóa đoạn là phổ biến nhất, thường gặp nhất
chiếm tỉ lệ trên một nửa số ca bệnh. Đột biến này thường xảy ra ở hai vùng
trọng điểm (gọi là vùng hotspot) là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’.
Cho đến nay DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bởi
vậy, việc chẩn đoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnh
nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợ
làm chậm lại các biến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộc
sống cho người bệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị. Ngoài
ra,việc phát hiện đột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ý
nghĩa quan trọng trong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy
cơ cao sinh con bị bệnh. Có nhiều phương pháp xác định đột biến xóa đoạn
gen này nhưng do gen dystropin quá lớn với 79 exon, nên nhiều phương pháp
gặp phải trở ngại về mặt thời gian. MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification) là phương pháp xác định đột biến xóa đoạn và lặp đoạn
nhanh chóng, chính xác và đang được ứng dụng rộng rãi.
Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất
đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”
được thực hiệnnhằm mục tiêu:
Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân
loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA
7
7
8
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD.
1.1.1. Trên thế giới.
- Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả
chi tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi

Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng
được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ
lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng
nề của bệnh gây ra. Một hướng mà hiện nay được nhiều nhà khoa học trên thế
giới tập trung nghiên cứu là chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹ
BMD bằng cách dùng một đoạn trình tự oligonucleotid đặc hiệu bám vào vị
trí tăng cường quá trình ghép nối của exon, một vị trí quan trọng cho quá trình
hoàn thiện mRNA để ngăn cản quá trình này, gây mất đoạn trực tiếp exon có
chứa điểm đột biến, hoặc gây mất đoạn thêm một hoặc hai exon kề với vùng
đột biến nhằm khôi phục lại khung dịch mã. Hướng nghiên cứu này trên tế
bào đã đem lại nhiều kết quả rất đáng khích lệ, hiện nay đang được thử
nghiệm trên động vật và bước đầu đã được ứng dụng trên người. Ngày nay,
liệu pháp gen được coi là một trong các hướng nghiên cứu ưu tiên nhất đối
với DMD.
9
9
10
1.1.2. Ở Việt Nam.
DMD là một bệnh di truyền khá phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam
do đó đã có rất nhiều các đề tài, dự án nghiên cứu được tiến hành mang lại gía
trị to lớn và nâng cao tầm hiểu biết về căn bệnh này. Cụ thể:
- Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã nghiên
cứu xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tại
Viện BVSKTE Hà nội, kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số 107
gia đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh.
- Năm 1996, Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Phượng và CS đã nghiên
cứu giá trị của xét nghiệm CK trong chẩn đoán người mang gen gây bệnh và
đã nhận thấy khả năng phát hiện dị hợp tử của CK là 54%.
- Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang đã sử dụng một
cặp mồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứng PCR thăm dò ở mức độ

lại hay vấp ngã, trẻ chưa có biểu hiện
teo cơ.
Giai đoạn 2 (khi trẻ được 6-7 tuổi) Trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện
dấu hiệu Gowers rõ, trẻ đang ngồi
xổm phải đứng thẳng lên hoặc đang
nằm phải ngồi dậy, trẻ phải quay
người sang một bên, gấp đầu gối vào
mông, hai tay chống nạng đỡ lấy thân
để giữ một tư thế như quỳ bắn, sau
đó, bằng cách tỳ hai tay lần lượt lên
cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho
thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các động
tác như vậy được xem là đặc hiệu cho
bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến.
Giai đoạn 3 (khi trẻ được12-15 tuổi) Trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12
tuổi, sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện
do trẻ không đi lại được, cuối cùng trẻ
bị tử vong ở lứa tuổi 20-25 do tổn
thương cơ tim và rối loạn hô hấp
12
12
13
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng
1.2.2.1. Định lượng hoạt độ enzym Creatine Kinase (CK) trong huyết thanh
Creatine Kinase (CK) là enzym xúc tác phản ứng tạo hợp chất giàu
năng lượng giúp quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế
bào cơ.
Creatine + ATP
→←
CK

DMD là một trong các bệnh di truyền có tiên lượng xấu vì chưa có
phương pháp điều trị hiệu quả. Bệnh nhân dần dần bị tàn phế và thường chết
do suy hô hấp, tổn thương cơ tim hoặc ở lứa tuổi thiếu niên hoặc trước 20 tuổi
Hiện nay phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi chức năng nhằm trì
hoãn sự tiến triển của bệnh. Các thuốc điều trị nội khoa cho bệnh nhân DMD
như: prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm steroid) hoặc
aminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy tế bào cơ.
Vật lý trị liệu có tác dụng giúp cho trẻ hạn chế bớt mức độ co kéo cơ.
Hiện nay, liệu pháp gen trong điều trị căn bệnh này đang được thực
hiện với mục đích đưa vào trong tế bào một hoặc nhiều gen có khả năng tổng
14
14
15
hợp ra protein dytrophin và làm cho protein biểu hiện được ở màng tế bào cơ.
Hai phương pháp đã được thử nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ những
plasmid và sử dụng vật truyền trung gian virut. Nhưng phương pháp này còn
nhiều hạn chế do gặp phải trở ngại khi tiến hành đưa một gen lớn vào vật
truyền trung gian, đưa vào bộ máy di truyền ở bên trong tế bào cơ sau phân
bào, sự tồn tại của gen đưa vào cơ thể và sự thải ghép của hệ thống miễn dịch
nên chưa được áp dụng để điều trị bệnh trên người. Trong vài năm trở lại đây,
một hướng điều trị gen mới, sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh
nhân, các nhà khoa học đã chọn lọc, xóa thêm một, hai hoặc nhiều exon của
đoạn gen bị đột biến tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen mà vẫn duy trì
được khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần giúp cho người
bệnh chuyển từ thể bệnh nặng (DMD) sang thể bệnh nhẹ (BMD) và giúp kéo
dài thời gian sống.
1.2.4. Phòng bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền tiên lượng nặng, có thể dẫn đến tàn phế, mất khả
năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành. Hiện nay, chưa có phương pháp
điều trị bệnh hiệu quả, các tác giả quan tâm đến bệnh DMD đều nhận định

Y
Lành
X
d
Y
bệnh
X
D
X
D
lành
X
D
X
d
lành mang
gen bệnh
X
d
X
d
bệnh
X
D
Y lành X
D
X
D
Lành
1 0 1 0 0

d
lành mang gen
bệnh
½ ½ 0 ½ ½
X
d
Y bệnh X
d
X
d
bệnh
0 1 0 0 1
Trong một vài trường hợp nữmang gen có biểu hiện bệnh khi NST X
không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ
biểu hiện bệnh. Francke 1989) đã phát hiện ra một vài trường hợp nữ mang gen
16
16
17
có biểu hiện rõ ràng của bệnh DMD với một NST X bị bất hoạt. Có khoảng 30%
bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình
đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ .
1.4. Vị trí cấu trúc chức năng của gen Dystrophin
1.4.1 Vị trí của gen Dystrophin
Gen Dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X.
Hình 1.3: Vị trí của gen Dystrophin.
1.4.2. Cấu trúc gen Dystrophin
Hình 1.4: Cấu trúc gen Dystrophin.
Gen Dystrophin là một trong những gen lớn nhất của người đã được
biết tới, gen có kích thước khoảng gần 3000kb, trong đó hơn 99% chiều dài
gen là intron .

19
Hình 1.5: Cấu trúc mô phỏng của Dystrophin và một số protein tương tác
với nó
1.6.Đột biến xóa đoạn gen Dystrophin
Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn, lặp đoạn và
đột biến điểm. Trong đó tỉ lệ các dạng đột biến:
Đột biến xóa đoạn chiếm khoảng 60%
Đột biến điểm chiếm 25-30%
Đột biến lặp đoạn chiếm khoảng 10-15%
Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhân
DMD/BMD. Đột biến này chiếm khoảng 60÷65% tổng số các dạng đột biến.
Đột biến gặp chủ yếu ở 2 vùng trọng điểm (hotspot regions): vùng tận cùng 5’
(exon 1÷19) và vùng trung tâm (exon 43÷60). Hai phương pháp đang được
dùng phổ biến trong chẩn đoán mất đoạn gen là PCR và MLPA. Trong đó
MLPA là phương án tối ưu hơn do chính xác và nhanh chóng.
19
19
20
Hình 1.6. Vị trí đột biến mất đoạn thường gặp trên gen Dystrophin(theo
Thomas Prior, 2005).
Foster (2006) đã xác định đột biến mất đoạn gen ở mức độ mRNA của
80 bệnh nhân DMD và ông đã xác định được tỷ lệ mất đoạn gen Dystrophin
chiếm 63% bệnh nhân được chẩn đoán DMD. Kết quả này phù hợp với
nghiên cứu của Prior (2005) đã phát hiện tỷ lệ đột biến xóa đoạn gen
Dystrophin là 60 ÷ 65% ở các bệnh nhân DMD. Năm 2004, TS.BS
Trần Vân Khánh đưa ra bảng tổng kết so sánh tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen trên
bệnh nhân DMD giữa các dân tộc khác nhau ở châu Mỹ, châu Âu và châu Á;
tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen Dystrophin dao động trong khoảng 33 ÷ 65%; tại
châu Mỹ và châu Âu bệnh nhân DMD của Hoa Kỳ và Hy Lạp có tỉ lệ đột biến
xóa đoạn gen khá cao 60 ÷ 65%, tiếp sau là tỉ lệ xóa đoạn gen ở bệnh nhân

DMD, như đã biết, có ba dạng đột biến. Có nhiều các phương pháp khác
nhau để xác định những đột biến này như PCR, RT- PCR, Multiplex PCR,
21
21
22
MLPA…Hai kỹ thuật chính đang được sử dụng phổ biến hiện nay là PCR và
MLPA.
1.7.1. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):
PCR là kỹ thuật nhân bản gen trong ống nghiệm. Từ một khuôn ban
đầu sẽ cho ra sản phẩm là một lượng lớn các đoạn gen đích cần nghiên cứu.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba bước được điều hòa bởi nhiệt độ
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao, thường là 94
o
C - 95
o
C trong vòng 30 – 60 giây. Bước này
DNA sợi kép tách ra thành hai mạch đơn.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi cặp với khuôn là các DNA mạch đơn, dao động trong khoảng 40
o
C –
70
o
C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 – 60 giây.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extennsion) Nhiệt độ tăng lên
72
0
C là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme Taq polymerase hoạt động tổng

79 exon của đoạn gen đích. Mỗi chuỗi đều có vị trí gắn đặc hiệu với exon
đích và có gắn sẵn mồi, khi hai chuỗi này đã gắn được vào vị trí exon
đích, enzym ligase sẽ gắn 2 chuỗi thành probe hoàn chỉnh. Nếu gen bị
đột biến, probe tương ứng với exon bị xóa không được hình thành do 2
chuỗi không gắn được vào exon này. Mồi gắn sẵn trên probe ( tác dụng
khuếch đại probe)có trình tự giống hệt nhau, nên chỉ cần một cặp mồi
duy nhất để khuếch đại tất cả probe. Riêng ở chuỗi dài có thêm một
đoạn đệm gồm số nucleotid khác nhau, nhờ đó các probe có sự khác
biệt về kích thước, giúp phân tách khi điện di mao quản sau khuếch đại
probe. Kết quả phân tích sẽ cho 79 đỉnh có kích thước tương ứng với
79 probe đặc hiệu với 79 exon, khi không thấy xuất hiện đỉnh có nghĩa
đã xảy ra đột biến mất đoạn trên exon
Cấu trúc probe:
Hình 1.8: Cấu trúc của probe
24
Vị trí gắn
đặc hiệu
trên gen
đích
Thuốc
nhuộm
huỳnh
quang
Đoạn
đệm
Mồi
xuôi
X
Mồi
ngược Y