TCNCYH 23 (3) 2003
Tần suất và sự đột biến mất đoạn gien lmp1
ở bệnh nhân ung th vòm mũi họng

Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi,
Nguyễn Văn Đô, Bạch Khánh Hoà, Trần Thị Chính
Đại học Y Hà Nội

Epstein-Barr (EBV) - virút có mối quan hệ mật thiết đối với ung th vòm mũi họng (UTVMH).
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 20 cặp mẫu (gồm máu ngoại vi và sinh thiết vòm họng) bệnh nhân
UTVMH thể không biệt hoá, 5 mẫu bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH. Mục đích
của nghiên cứu này nhằm điều tra tần suất của gien LMP1 là một trong những gien ở thể tiềm ẩn
của virút và 30 mẫu máu ngoại vi của những ngời khoẻ mạnh. Sử dụng hai cặp mồi LMP1 dựa
theo kinh nghiệm của phòng thí nghiệm MTC, viện Karolinska, Thuỵ điển. Hai cặp mồi này đặc
hiệu và thiết kế cho gien LMP1 đột biến, có vị trí từ 168592 - 168174 và từ vị trí 168373 - 168174
(từ genom của EBV). Kết quả thu đợc nh sau:
1. Tỷ lệ gien LMP1 - EBV ở máu ngoại vi ngời khoẻ mạnh là 96,7% (29/30 ca dơng tính).
2. Tỷ lệ gien LMP1 - EBV ở cặp mẫu bệnh nhân UTVMH thể biểu mô không biệt hoá là 100%
(20/ 20 trờng hợp dơng tính)
3. Tỷ lệ gien LMP1 ở bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH là 100% (5/ 5 trờng
hợp dơng tính).
4. Trên điện di, 90% gien LMP1 - EBV ở mô sinh thiết vòm họng bệnh nhân UTVMH có hiện
tợng đột biến mất đoạn trong khi gien LMP1 - EBV ở máu ngoại vi của những bệnh nhân này chỉ
có 10% có đột biến mất đoạn.

I. Đặt vấn đề
EBV thuộc nhóm Herpes virút có lõi ADN
xoắn kép, liên quan gần đến một vài khối u ác
tính ở ngời trong đó có ung th vòm mũi họng
(UTVMH), đặc biệt là với thể ung th biểu mô
không biệt hoá. Mối liên quan này đợc chứng


91
TCNCYH 23 (3) 2003
1. Xác định tỷ lệ gien LMP1 ở ngời
khoẻ mạnh và bệnh nhân UTVMH.
2. Xác định tỷ lệ gien LMP1 ở bệnh nhân
ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH.
3. Phát hiện đột biến gien LMP1 ở bệnh
nhân UTVMH.
II. Đối tợng và phơng pháp
1. Đối tợng
Đối tợng nghiên cứu:
- 20 cặp mẫu: máu ngoại vi và sinh thiết
vòm họng bệnh nhân UTVMH thể không biệt
hoá. Các mẫu này đợc thu thập tại bệnh viện
K Hà Nội từ năm 2000 đến 2001.
Đối tợng chứng:
- 5 mẫu sinh thiết bệnh nhân ung th đầu,
cổ khác không phải UTVMH.
- 30 mẫu máu ngoại vi lấy từ ngời khoẻ
mạnh về lâm sàng.
Toàn bộ mẫu sinh thiết trên đợc bảo quản
ở 70
0
C cho đến khi tiến hành tách chiết ADN.
2. Phơng pháp
2.1. Tách chiết ADN
- ADN tách từ máu ngoại vi theo qui trình
Perchlorate.
- ADN tách từ mẫu sinh thiết theo qui trình

2.3.1. Phản ứng PCR lần thứ nhất:
- Trình tự cặp mồi:
168592: 5 - ATC GCG ACT CTG CTG
GAA AT - 3
168174: 5 - CGC GGA TCC TTA GTC
ATA GTA GCT TAG - 3
- Nguyên vật liệu để tiến hành phản ứng
PCR gồm: 100ng ADN; 4àM mỗi mồi; 0,2
mM dNTP; 3.0 mM MgCl
2
; 1 đơn vị Taq ADN
polymerase (Perkin Elmer) trong PCR buffer
1X. Tổng thể tích phản ứng là 50àl.
- Điều kiện chu trình nhiệt: 94
0
C/ 10 phút;
35 chu kỳ: 95
0
C/ 45 giây, 55
0
C/ 1 phút 30 giây,
72
0
C/ 2 phút 30 giây; 72
0
C/ 10 phút 4
0
C.
2.3.2. Phản ứng PCR lần thứ hai:
- Trình tự cặp mồi: giống nh cặp mồi để

III. Kết quả
1. Kết quả tách chiết ADN
Bảng 1: Hàm lợng và độ tinh khiết của
ADN
OD
Đối tợng
OD
260
OD
280
OD
260
/
OD
280

ADN 0,1494 0,2831 1,894
- Hàm lợng ADN đợc đo bằng giá trị
OD
260
trên quang phổ kế.
- Độ tinh khiết của ADN đợc đo bằng chỉ
số OD
260
/ OD
280
sau khi đo trên quang phổ kế.
Một đơn vị OD
260
= 0,1494 tơng ứng với

khác không phải UTVMH
0% (0/ 5 mẫu)
Máu ngoại vi ngời khoẻ
mạnh
0% (0/ 30 mẫu)
Máu ngoại vi bệnh nhân
UTVMH
10% (2/ 20 mẫu)

93
TCNCYH 23 (3) 2003
H
ình 3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR từ
mẫu sinh thiết trên gel agarose 2%, điện thế
100V trong 1 giờ.
Số 1, 2, 3, 4, 9,10: các mẫu UTVMH thể không biệt
hoá
M: thang ADN chuẩn 100bp
Số 21: Bệnh nhân chứng

Hình 4.A: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR
(của các cặp mẫu) trên gel agarose 2%, điện
thế 100V, thời gian 1 giờ.
(Có sự chênh lệch giữa sản phẩm PCR của máu
ngoại vi và của mô sinh thiết khối u vòm họng trên
cùng một bệnh nhân UTVMH).
T: sản phẩm PCR từ mô sinh thiết khối u vòm
họng
của bệnh nhân UTVMH
B: sản phẩm PCR từ máu ngoại vi của bệnh nhân

hay nói một cách khác là chỉ sử dụng một cặp
mồi thì sẽ không tạo ra đợc đủ lợng sản
phẩm PCR mong muốn vì lợng ADN của
EBV khuôn quá thấp. Hơn nữa, chúng tôi
không thể tăng nhiều ADN tổng số làm khuôn
ban đầu vì điều này sẽ gây nên tính không đặc
hiệu của phản ứng PCR và có thể cho ra nhiều
sản phẩm phụ.
Với kỹ thuật PCR lồng chúng tôi khắc phục
nhợc điểm này. Sản phẩm PCR lần thứ nhất
sau đó sẽ đợc dùng làm sợi khuôn cho phản
ứng PCR tiếp theo để nhân bản đoạn ADN của
gien LMP1. ở lần chạy PCR thứ hai, chúng tôi
sử dụng 2àl sản phẩm PCR lần thứ nhất để làm
khuôn.
Trên 30 mẫu ADN tách từ máu ngoại vi của
ngời khoẻ mạnh phát hiện có 96,7% (29/ 30
mẫu dơng tính) có LMP1 - EBV. Trên 20 mẫu
máu ngoại vi của bệnh nhân UTVMH, chúng

94
TCNCYH 23 (3) 2003
tôi thu đợc 100% (20/ 20 mẫu dơng tính) có
LMP1 - EBV (Bảng 2; Hình 2). Kết quả này rất
phù hợp với kết quả của các tác giả: Theo Kee -
Ching G., Chen - Yi Hsu và cs, tỷ lệ nhiễm
EBV ở ngời dân sống ở Đài Loan là 100%[8].
ở nớc ta, tỷ lệ những ngời trởng thành
nhiễm EBV là 93% [2]. Nghiêm Đức Thuận
cũng tìm thấy có genome EBV ở 100% bệnh

ADN - EBV từ vị trí 168373 - 168174.
Kết quả cho thấy đoạn gien LMP1 đã đợc
nhân lên một cách đặc hiệu, thể hiện một băng
sáng rõ nét, có kích thớc khoảng 230bp (Hình
3; Bảng 3).
Xuất phát từ cùng một hàm lợng ADN làm
khuôn (khoảng 100 ng) để chạy phản ứng PCR,
ở máu ngoại vi chúng tôi phải tiến hành PCR 2
lần, nhng ở tổ chức sinh thiết khối u chỉ tiến
hành PCR một lần và điện di 4àl sản phẩm
PCR so với điện di 10àl sản phẩm PCR ở máu
ngoại vi. Kết quả là: sản phẩm PCR chạy từ
sinh thiết khối u có băng ADN đậm hơn rất
nhiều so với băng ADN - LMP1 là sản phẩm
PCR đã chạy điện di từ máu ngoại vi. Kết quả
này hoàn toàn đúng với lý thuyết cho rằng:
hàm lợng ADN - EBV ở trong mô sinh thiết
cao hơn rất nhiều so với ở máu ngoại vi. Trong
25 mẫu sinh thiết (gồm 5 mẫu bệnh nhân ung
th vùng đầu, cổ không phải là UTVMH và 20
mẫu sinh thiết vòm bệnh nhân UTVMH) đều
có gien LMP1 - EBV.
Theo kết quả nghiên cứu của tác giả
Nghiêm Đức Thuận [3]: trong tổng số 47 bệnh
nhân UTVMH thể không biệt hoá phát hiện
thấy có 85,11% trờng hợp có ADN - EBV
trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng (tác giả
sử dụng cặp mồi EBNA - 2A). Tiếp tục sử dụng
sản phẩm PCR với cặp mồi EBNA - 2A làm
ADN dò cho kỹ thuật lai dot - blot thì tác giả

UTVMH, của bệnh nhân UTVMH và khi làm
điện di song song các mẫu này thì thấy rằng:
trong lúc các mẫu máu ngoại vi ngời bình
thờng, máu ngoại vi ngời UTVMH (18/ 20
mẫu) và mô sinh thiết bệnh nhân ung th vùng
đầu, cổ không phải UTVMH đều chỉ thấy sản
phẩm quãng 230bp thì 16 mẫu đơn sinh thiết
vòm của bệnh nhân UTVMH và 2 cặp mẫu
thấy sản phẩm quãng 200bp (tổng số là 18/ 20
mẫu) (Hình 4.A; Hình 4.B). Điều này khiến
chúng tôi suy nghĩ là đã có đột biến mất đoạn ở
gien LMP1 - EBV, khoảng 30bp hay ít, nhiều
hơn.
So sánh với kết quả một số tài liệu của
những nớc có tần suất UTVMH rất cao, cao
hơn cả nớc ta, cho thấy:
92% gien LMP1 có mặt trong mô sinh thiết
khối u vòm họng của bệnh nhân UTVMH
Trung Quốc trong đó có 82% gien LMP1 của
những bệnh nhân này có đột biến mất 10 amino
acid ở vị trí 346 - 355 acid amin hoặc đột biến
mất 3bp từ vị trí 168287 - 168256 nucleotid ở
đầu -C tận [10]. 100% gien LMP1 tách từ sinh
thiết vòm của bệnh nhân Đài Loan bị UTVMH
có đột biến mất 30bp [4]. 93% (34/ 37 ca
dơng tính) gien LMP1 tách từ mô sinh thiết
khối u vòm họng của bệnh nhân UTVMH
Hồng Kông bị UTVMH có đột biến mất 10
amino acid từ vị trí 346 - 355 hoặc đột biến mất
30bp từ vị trí 168285 - 168256 nucleotid ở đầu

16% (7/ 47
mẫu)
3 Việt
Nam
90% (18/ 20
mẫu)
10% (2/20
mẫu)
4 Hồng
Kông
92% (34/ 37
mẫu)
8% (3/37
mẫu)
5 Đài
Loan
100% 0%
Những kết quả này cho thấy chủng EBV có
gien LMP1 đột biến mất 30bp nhiều nhất là ở
Đài Loan. Một điều đặc biệt là không thấy có
đột biến mất 30bp của gien LMP1 ở bệnh nhân
UTVMH gốc Nga, tuy nhiên vẫn thấy đột biến
này ở bệnh nhân mắc bệnh Hodgkin [9].
Trong 5 mẫu sinh thiết chứng (lấy từ các
bệnh nhân ung th amidan khẩu cái và ung th
hạ họng thanh quản) đều phát hiện thấy ADN -
EBV với hàm lợng rất cao, tuy rằng gien
LMP1 - EBV không bị đột biến giống nh ở
bệnh nhân UTVMH. Nh vậy, phải chăng EBV
trong các mẫu sinh thiết này có liên quan với

sự (số liệu đã gửi trên tạp chí Nghiên cứu y
học, 2002): bằng phơng pháp hoá miễn dịch
mô và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, tác giả
thấy rằng protein LMP1 đợc biểu lộ ở 53/ 80
trờng hợp (66%), trong khi đó có 27/ 80
(37%) trờng hợp không biểu lộ LMP1. Hơn
nữa, trong 44 trờng hợp biểu lộ LMP1 có tới
33 trờng hợp (75%) đã đáp ứng rất tốt sau xạ
trị (u tan, hết hạch), mặc dù trớc đó hạch lan
rộng. Tỷ lệ tái phát sớm và di căn của nhóm
này là 14/ 44 (25%). Ngợc lại, trong số 21
trờng hợp không biểu lộ LMP1, chỉ có 7
trờng hợp có dấu hiệu tiên lợng tốt nh nhóm
có LMP1 dơng tính, còn lại 14/ 21 trờng hợp
(67%) có tiên lợng xấu, với đáp ứng sau xạ trị
kém (u thu nhỏ một phần, hạch còn tồn tại), có
biểu hiện tái phát sớm sau < 6 tháng và di căn
nhiều nơi, mặc dù trớc đó u và hạch không lan
rộng nh nhóm LMP1 dơng tính. Nh vậy,
những trờng hợp có LMP1 dơng tính thì
cùng với u, hạch có xu hớng lan rộng hơn
những trờng hợp âm tính với LMP1, nhng
tiên lợng vẫn tốt hơn. Nhận xét này gợi ý có
thể xem protein LMP1 nh là một dấu ấn EBV
có giá trị, góp phần tiên lợng UTVMH.
Kết quả của chúng tôi cho thấy 100% bệnh
nhân UTVMH đều có gien LMP1 trong đó
90% có đột biến mất đoạn; nhng tác giả Đỗ
Hoà Bình khi nghiên cứu 80 trờng hợp thì sản
phẩm chỉ biểu lộ protein LMP1 ở 66% trờng

vòm mũi họng ở Việt Nam. Tình hình nhiễm
EBV ở một số lứa tuổi ngời dân Việt Nam, Y
học thực hành. 1987, 5- 6: 41 - 42.
3. Nghiêm Đức Thuận : Nghiên cứu đặc
điểm lâm sàng, mô bệnh học ung th vòm mũi
họng và hoạt tính của gen virút Epstein - Barr
trong UTVMH, Luận văn Tiến sỹ Y học. 2001.
4. Chang Y. S., Su I. J., Chung P. J., Shu
C. H., Ng C. K., Wu S. J., Liu S. T.: Deletion

97
TCNCYH 23 (3) 2003
of an Epstein - Barr virus variant in T - cell
lymphoma tissues identical to the distinct strain
observed in nasopharyngeal carcinoma in the
Taiwanese population, Int. J. Cancer. 1995, 62:
673 - 677.
5. Cheung S. T., Lo K. W., Leung S. F.,
Chan W. Y., Choi P. H., Johnson P. J., Lee J.
C., Huang D. P.:Prevalance of LMP1 deletion
variant of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal
carcinoma and gastric tumor in Hong Kong,
Int. J. Cancer. 1996, 66: 711 - 712.
6. Cheung Siu - Tim, Leung Sing - Fai,
Lo Kwok - Wai, Chui K. W., Tam J. S. L., Fok
T. F., Johnson Philip J.: Specific latent
membrane protein 1 gene sequences in type 1
and type 2 Epstein-Barr virus from
nasopharyngeal, Int. J. Cancer.1998, 76: 399 -
406.

position 168592 to 168174 and from 168373 to 168174 of the strain HEHS B95 – 8 were used. Our
finding indicated that:
1. The prevalence of LMP1 - EBV gene in peripheral blood of healthy persons are 96.7% (29/ 30
positive cases).
2. Prevalent LMP1 - EBV gene in 20 UCNT nasopharyngeal carcinoma patients are 100% (20/
20 positive cases).
3. Prevalence LMP1 - EBV gene in patients with other head and neck tumor are 100% (5/ 5
positive cases).
4. On the electrophoresis showed that 90% biopsies of nasopharyngeal carcinoma patients
having deletion in LMP1 gene.

98