TCNCYH 25 (5) - 2003
Biến thể ebnai ở bệnh nhân ung th vòm mũi họng
Việt Nam, Trung Quốc và ở ngời Việt Nam bình thờng

Nguyễn Văn Đô
1
, Trần Thị Chính
1
, Phan Thị Phi Phi
1
,
Ingemar Ernberg
2
, Li Fu Hu
2
1
Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh trởng đại học Y Hà Nội
2
MTC, Viện Karolinska, Stockholm, Thuỵ Điển

EBNA (EBV - nuclear antigen1) là một protein duy nhất đợc biểu lộ ở tất cả các tế bào bị
nhiễm virut Epstein - Barr. Biến thể của EBNA1 đã đợc định nghĩa dựa vào acid amin ở vị trí thuộc
mã bộ ba 487 của DNA và bao gồm các dới nhóm là P (prototype): P- ala (B95 -8) và P- thr; V
(variant): V - val, V - leu và V - pro.
Chúng tôi đã phân tích trình tự DNA ở đầu cacboxy của EBNA1 từ sản phẩm PCR. Các mẫu
DNA cho kỹ thuật PCR đợc chiết tách từ khối u vòm họng và máu ngoại vi của bệnh nhân ung th
vòm họng ngời Việt Nam và Trung Quốc, thể biểu mô không biệt hoá; máu ngoại vi của ngời cho
máu Việt Nam.
Kết quả cho thấy EBNA1 ở ngời bình thờng và bệnh nhân ung th vòm mũi họng có các đột
biến điểm dẫn đến thay đổi các acid amin và các biến thể này thuộc dới nhóm của V - val: V - val
- v1 (9/10 cặp mẫu và 5 ngời bình thờng) và V - val - v2 (1/10 cặp mẫu). Trong số 15 cặp mẫu

nhiễm EBV. Nó có vai trò rất quan trọng là yếu
tố hệ thống các gen khởi động của EBV giúp
cho quá trình sao chép ADN và phân chia của
EBV để duy trì sự tồn tại của EBV trong tế bào,
đồng thời điều hoà sự biểu lộ của chính EBNA1
và các gen khác của thể nhiễm tiềm ẩn nh
EBNA 2 - 6, LMP1,2.
Trình tự gen của EBV thuộc dòng tế bào
B95 -8 đã đợc phân tích hoàn chỉnh và cấu
trúc của gen EBNA1 liên quan đến các chức
năng của nó đã đợc nghiên cứu và làm sáng
tỏ. Một số tác giả đã phát hiện thấy các đột
biến điểm của gen EBNA1 dẫn đến sự thay đổi

23
TCNCYH 25 (5) - 2003
các acid amin trong chuỗi protein ở các chủng
EBV từ các vùng địa lý khác nhau trên thế giới
và từ những bệnh lý khác nhau có liên quan.
Các công trình nghiên cứu đều cho thấy các
đột biến thờng xảy ra ở vùng có chức năng
gắn DNA thuộc đầu cocboxy của EBNA1 [4,5].
Bhatia và cộng sự 1996 cũng đã phân tích trình
tự gen EBNA1 của EBV thuộc dòng B95 - 8 so
sánh với một số chủng EBV khác và đã phân
loại EBNA1 thành 5 dới nhóm khác nhau, đó
là P - ala, P - thr, V - pro, V - leu và V - val (P
là prototype thuộc chủng B95 - 8, còn V là
variant).
ở Việt Nam cha có công trình nào nghiên

2.1. Chiết tách DNA
2.1.1. Chiết tách DNA từ máu toàn phần
5ml máu đợc chống đông bằng EDTA bảo
quản trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 4
0
C. Cho
10ml dung dịch phá hồng cầu (1mM NH
4
HCO
3

115mM NH
4
Cl) vào falcon 15ml đã đựng sẵn
máu chống đông, lắc đều và ly tâm 1200g x 10
phút. Loại bỏ dịch và giữ lại phần cặn. Làm tan
cặn và cho 10ml dung dịch phá hồng cầu lần 2,
ly tâm lấy cặn nh trên. Cho 1,8ml dung dịch
phá bạch cầu (100mM tris - C1, pH 7,6; 40mM
EDTA, pH 8.0; 50mM NaCl; 0,2% SDS; 0,05%
sodium azide) vào cặn bạch cầu thu đợc và
lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm để làm
tan hết các bạch cầu, dung dịch trở nên đặc và
nhầy. Cho 10àl proteinase K nồng độ
20mg/mL vào bạch cầu đã đợc làm tan và ủ ở
50
0
C, 2 giờ có lắc theo chu kỳ. Thêm 600àl
NaCl 6M, lắc 10 phút và ly tâm 1200 vòng/
phút x 5 phút, loại bỏ nớc nổi. Cho 5ml cồn

DNA bằng điện di trên thạch agarose 0,8% có
ethidium bromide. Đọc kết quả bằng đèn UV.

24
TCNCYH 25 (5) - 2003
Nồng độ và độ tinh khiết của DNA đợc đo
bằng quang phổ kế. Các mẫu DNA đều đạt độ
tinh khiết tiêu chuẩn (OD 260/280) lớn hơn 1,7.
2.2. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction)
2.2.1. Xác định gen EBNA1 từ khối u
Cặp mồi sử dụng cho kỹ thuật khuyếch đại
1 đoạn gen EBNA1 từ mô sinh thiết là: mồi
xuôi, 5' - tgg gttt gga aag cat cgt ggt c - 3'
(109339nt - 109360nt) và mỗi ngợc, 5' - gtt
gtg ggc cgg gtc cag gg - 3' (109600nt -
109581nt). Thể tích của phản ứng là 25àl trong
đó 2,5àl mỗi mồi xuôi và ngợc nồng độ 2àl, 1
đơn vị Taq polymerase (Perkin - Elmer), 2àl
dNPTs nồng độ 2.5àM và 200ng DNA và
H
2
O. Trình tự các phản ứng gồm có biến tính
DNA tiền phản ứng là 95
0
C x 2', 35 chu kỳ
nhiệt là 95
0
C x 15'', 52
0

hoàn thành việc kéo dài là 72
0
C x 5' . Kích
thớc của sản phẩm là 246bp.
PCR2: Kỹ thuật PCR lồng (nested - PCR)
với cặp mồi là: mồi xuôi 5' - tgg gtt gga aag cat
cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt) và mồi
ngợc: 5' - gcc att cca aag aga cg - 3'
(109580nt - 109561nt). Nhiệt độ gắn mồi tăng
lên 59
0
C và số chu kỳ nhiệt giảm xuống còn
27. Sản phẩm PCR có kích thớc là 146bp.
2.3. Kỹ thuật phân tích trình tự nucleotid
Các sản phẩm PCR (DNA từ mô sinh thiết)
và nested - PCR (DNA từ máu ngoại vi) là
nguyên liệu dùng để phân tích trình tự. Chuẩn
bị mẫu để phân tích trình tự bằng một phản ứng
PCR có một mồi xuôi, 5' - Thủ tớng gttt gga
aag cat cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt). Bộ
kit sử dụng là "BigDye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit". Kết quả đợc
phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
III. Kết quả
1. Đột biến thay thế nucleotid đầu
cacboxy của EBNA1 ở mô sinh thiết bệnh
nhân ung th vòm mũi họng và máu ngoại
vi
Phân tích trình tự 1 đoạn gen mã hoá cho
các acid amin nằm ở những vị trí có các acid

Pro
GCT
Ala
AGT
Ser
GAC
Asp
GAA
Glu
ACT
Thr
CTA
Leu
ACT
Thr
GCC
Ala
ATT
Ile
CTT
Leu
P-ala-v1 GAA
Glu
ATT
Ile

P-ala-v2 GAA
Glu
GTT
val

CT
C
Leu
A
TT
Ile

V-leu GAA
Glu
AGC
Ser
CAG
Gln
CTT
Leu
TGT
Cys
GAG
Glu
GA
T
Asp
A
AT
Agn
CTC
Leu
A
TT
Ile

Val
ATT
Ile
V-val-v1 GTT
Val
GAG
Glu
A
AT
Agn
CTC
Leu
A
TT
Ile
CTT
Leu
ATT
Ile

2. Tỷ lệ các dới nhóm của EBNA1 ở bệnh nhân UTVMH Việt Nam, Trung Quốc và ngời
bình thờng
Bảng 2: Sự phân bổ các dới nhóm EBNA1 ở máu ngoại vi ngời bình thờng, máu và
khối u của các bệnh nhân ung th vòm Trung Quốc và Việt Nam
Số mẫu P - ala P - ala +
Va-val-v1
Va-val-v1 Va-val-v2 Ghi chú
T: 10 0 0 9 1
UTVMH Việt Nam
L: 10 0 0 9 1

thể EBNA1 ở Châu á, nơi có tỷ lệ mắc bệnh
ung th vòm họng cao nh Trung Quốc. Tuy
nhiên, việc nghiên cứu chức năng của đoạn
protein EBNA1 có đột biến thay thế acid
amin cũng cần đợc tiến hành để xem các
đột biến này có ảnh hởng đến chức năng
của nó hay không.
IV. Kết luận
Dới nhóm của EBNA1 ở bệnh nhân ung
th vòm họng và ngời bình thờng Việt
Nam chủ yếu là V-val-v1. Kết quả này cũng
tơng tự ở các mẫu nghiên cứu lấy từ bệnh
nhân ung th vòm họng ở Trung Quốc.
Tài liệu tham khảo
1. Frank, D. et al, (1995):
Postransplantation lymphoproliferative
disorders frequently contain type A and not
type B Epstein - Barr virus. Blood, 85 (5): p.
1396 - 403.
2. Zur Hausen H., et al., (1970), EBV
DNA in biopsies of Burkitt tumours and
anaplastic carcinomas of the nasopharynx.
Nature, 228 (276): p.1056 - 8.
3. Chang, Y.S., et al., (1990),
Detection of Epstein - Barr virus DNA
sequences in nasopharygeal carcinoma
cells by enzymatic DNA amplification. J Clin
Microbiol, 28 (11): p.2398 - 402.
4. Bhatia, K., et al. (1996), Variation in
the sequence of Epstein Barr virus nuclear

The results show that there are two EBNA1 sub-subtypes in Vietnamese NPC (nasopharyngeal
carcinoma), V-val-v1 (9/10 DNA matches samples and 5 DNA samples from healthy blood donors
and V-val-v2 (1/10 matched samples). Among 15 Chinese matched samples, 15/15 samples from
tumors contained V-val-1, only 2/15 (blood samples) contained P-ala and 1/15 (blood sample) may
be mixed P-ala and V-val-1.27