1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể
dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Nơi có tỷ lệ ung thư vòm cao nhất
là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu lại có tỷ lệ rất thấp. Các
nước đông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình. Virut Epstein-
Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di truyền đều cho là liên
quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng và EBV là yếu tố được nghiên cứu
nhiều nhất.
EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không
biệt hóa và duy trìcác thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen quan
trọng là EBNA1, LMP1 và LMP2. EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bào
chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫn
truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinh
ung thư cho các tế bào bị nhiễm. Các gen này nằm cách xa nhau trong bộ gen EBV
và được biểu lộ bởi sự hoạt hóa các promoter khác nhau. EBNA1 được biểu lộ ở các
thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter: Cp, Wp và Qp. Tuy nhiên, trong
ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều
hòa biểu lộ gen EBNA1.
Methyl hóa ADN vùng promoter là một trong các yếu tố ngoại di truyền có vai
trò rất quan trọng trong điều hòa biểu lộ genMức độ methyl hóa diễn ra ở các vị trí
của đảo CpG tại vùng promoter và exon1 có vai trò trong điều hòa biểu lộ gen, có thể
làm giảm biểu lộ hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gen mà bình thường vẫn được
biểu lộ. Việc xác định mức độ methyl hóa vùng promoter của một gen có ý nghĩa
quan trọng trong tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng gen đó
trong nhiều quá trình bệnh lý ác tính , đồng thời dấu ấn này cũng có thể góp phần
trong chẩn đoán sớm các bệnh ung thư. Ngoài ra, khi dùng các chất hóa học để làm
mất methyl hóa thì có tác dụng làm gen hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của
chúng, giúp cho việc điều trị những rối loạn hay các bệnh lý khác nhau.
2
Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác định được

1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr .
Virut Epstein-Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được nghiên
cứu nhiều nhất cho thấy có liên quan chặt chẽ của nó với UTVMH. Người ta phát
hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô
không biệt hóa (UCNT). Ngoài ra, các sản phẩm gen của EBV là EBER, EBNA1 và
LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thương
quá sản tại biểu mô vòm họng gồm những dòng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV. Điều
này phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV là một trong những yếu tố khởi phát trong
cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển của UTVMH [5]
Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng, người
ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh nhân.
Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH cao hơn 8 - 10
lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác hoặc người khỏe về lâm sàng
Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi,
thường qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam có giá trị để theo dõi và
phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có giá trị là một dấu ấn quan trọng
4
theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng cao [6,7]. Người ta cho rằng sự tái hoạt
hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển
của UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA.
1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt
Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô nhiễm
liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống. Nhiều
nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ý
kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) là
nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muối
ngay từ nhỏ. Dùng cá muối hàng ngày có thể làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5
lần [8]. Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa
EBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển
dạng do EBV [9]. Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có

Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằng
virut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra là sự tiếp cận
giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV. Tế bào B đi vào chu trình dung
giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus mới cho
các tế bào khác trên một diện rộng . Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô
bởi hiện tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA Sixbey and Yao. Ngoài ra,
phân tử MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu
mô. Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi
các tế bào máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Natural
Killer cell).
1.3.2. Cấu trúc của EBV
EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó khoảng 172-
kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid EBV hình thành phân tử
DNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm bởi đầu TR (terminal repeat) của nó (hình 1A).
Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95-8 bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn
gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ cái và theo thứ tự kích thước giảm dần (hình
1B). Thuật ngữ sử dụng cho từng đoạn như sau: Mỗi chữ cái là ký hiệu cho từng
đoạn (A, B …), khung đọc mở trái hoặc phải và tiếp theo là thứ tự (0,1,2,3…) ví dụ
6
như BARF0 và BARF1. Toàn bộ bộ gen EBV của dòng tế bào B95-8 được giải trình
tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân hàng gen là V01555.
Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác nhau (các phân tử protein
lớn) trong thể dung giải của nó, ngược lại, chỉ có khoảng 10 kháng nguyên được sản
xuất trong các thể nhiễm tiềm ẩn Reddy, Raslan, Gooneratne, Kathuria and Marks[2]
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của EBV: A) Cấu trúc EBV dạng vòng biểu thị các vùng promoter và các
gen thể nhiễm tiềm ẩn: EBER1 và 2: EBV Early RNA, EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen, LMP1
và2: Latent Membrane Protein. B) EBV ở dạng thẳng gồm các đoạn gen được tạo ra sau khi xử lý
với enzym giới hạn BamH1 và vị trí các gen của thể tiềm ẩn.
1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV
Giống như tất cả các virut herpes, EBV có thể tồn tại dạng không hoạt động

U lympho sau ghép tạng. U lympho ở bệnh
nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn khuẩn,
LCL.
1.3.4. Các gen EBV của thể tiềm ẩn
1.3.4.1. EBNA1
Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng 66-
95 kDa và chiều dài là 641 axit amin. Kích thước này được thay đổi ở các chủng
khác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-Ala) Hennessy and
Kieff. Các cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ ràng: một vùng
cơ bản nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin,
vùng cơ bản ngắn và một vùng gắn DNA ở đầu C có chiều dài từ axit amin 459-641
Ambinder, Mullen, Chang, Hayward and Hayward (Hình 2).
Hình 2. Cấu trúc của EBNA1
Basic
Gly-Ala
repeats
Bas
i
c DNA-binding
NH
2
COOH
1 33 83 90 328
382
459 604
6
EBNA1 là protein biểu lộ hầu như tất cả các tế bào nhiễm EBV
Andersson-Anvret, Klein, Forsby and Henle và nó đóng một vai trò quan
trọng trong việc duy trì episom của EBV (dạng vòng) trong nhân tế bào chủ,
cũng như chức năng phiên mã của virut Yates JL. Vùng gắn ADN của protein

II có giống nhau ở 84%, 80% và 72% một cách tương ứng . Các protein này
hoạt động có chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác với các protein
RBP-JK Robertson ES.
1.3.4.4. EBNA-LP
Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ 20-
130 kDa, là kết quả của hoạt động promoter Wp. Cùng với EBNA2, EBNA-
LP là một trong những protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào
lympho B in vitro
1.3.4.5. LMP1
Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu 3'
của bộ gen EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng
virus [104, 105]. Ở chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có 386
axit amin và chia thành ba vùng,(i) một vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii)
sáu vùng xuyên màng kỵ nước được kết nối bởi ba vòng bên ngoài và hai
vòng nội bào(iii) một vùng đầu C có 200 axít amin bao gồm hai lĩnh vực chức
năng quan trọng Hennessy, Fennewald, Hummel, Cole and Kieff được gọi là
vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Terminal Activation Region 1: aa194-232) và
CTAR2 ( aa 351-386).
LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng, di căn và chống lại
chết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung thư
vì nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm. Biểu
hiện của LMP1 cũng tác động ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của tế
bào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của chúng, gây biến đổi hình thái của một số
dòng tế bào biểu mô , và làm tăng biểu hiện của các yếu tố tăng trưởng biểu
bì EGFR Miller WE.
1.3.4. 6. LMP2A/2B
LMP2 được mã hóa bởi chỗ ghép nối hình thành dạng vòng của EBV
[119]. LMP2 có hai loại là LMP2A và LMP2B, và chỉ khác nhau là LMP2A
có thêm đoạn 119 acid amin ở đầu N tận còn LMP2 thì không có. Mặc dù
chưa biết được chức năng cụ thể của LMP2B, nhưng việc biểu lộ nhiều của


Hình 3: Một cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN.
A) Hai nucleotid CpG ở vùng promoter không methyl hóa, cho phép thực hiện phiên mã
trong các tế bào bình thường. B) Phiên mã bị chặn bởi tăng methyl hóa trong vùng
promoter.
1.4.2. Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1
EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa của các
promoter khác nhau ở những thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu
kỳ dung giải (Fp). Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt
hóa, trong khi các promoter khác không hoạt động. Ngược lại, trong thể
nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp được hoạt hóa, tuy nhiên phụ thuộc vào từng
thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và II chỉ có Qp hoạt
động, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai promoter Wp và Cp hoạt động. Hai
promoter này hoạt động luân phiên và Wp được hoạt động trước ở một thời
gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động lâu dài hơn.
Hình 4. Các promotor của EBV điểu khiển phiên mã EBNA1.
Việc các promoter đóng hoặc mở được thực hiện bởi các yếu tố khác
nhau, trong đó có methyl hóa các CpG vùng promoter. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I
và II, các promoter Wp và Cp bị đóng lại, do đó EBV chỉ biểu lộ EBNA1 do
Qp như trong trường hợp UTVMH. Nghiên cứu về methyl hóa giúp tìm hiều
cơ chế biểu lộ gen, đồng thời nó cũng là những dấu ấn giúp cho chẩn đoán
cũng như điều trị liên quan đến ngoại di truyền vì rối loạn này có thể được
sửa chữa nhờ những chất hóa học được bổ sung vào tế bàoRobertson,
Hayward, Ling, Samid and Ambinder, Miyamoto and Ushijima. Chúng tôi
phát triển kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa trên mô hình của EBV
trong ung thư vòm mũi họng, đồng thời nó cũng có thể ứng dụng cho nhiều
các gen khác của các bệnh lý khác nhau.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

++
, và lượng DNA làm khuôn mẫu.
- Các biến số nghiên cứu của mẫu sinh thiết bệnh nhân là mức độ
methyl hóa hay không methyl hóa các promoter của EBNA1
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin
- Quan sát và ghi kết quả nghiên cứu thực nghiệm
- Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án và điền phiếu theo mẫu (phụ lục
kèm theo)
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm chương trình SPSS 15.0 với các test thống
kê thích hợp trong y học
2.5. Sơ đồ nghiên cứu
Mẫu
ADN
PCR
đơn
mồi
Bisulfite
PCR
đa mồi
cDNA
RT-PCR
ProteinARN
Điện di, nhuộm sản phẩm PCR và chụp ảnh
WB
Thu thập thông tin và xử lý số liệu
CHƯƠNG 3

Qp
Biểu đồ 3.1.2.
Nhận xét:
3.1.3. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đơn mồi
ở 6 nồng độ Mg
++
(NC)khác nhau:
Bảng 3.1.3
(+/-) %
Promotor
Nồng độMg
++
(NoC)
NoC1 NoC2 NoC3 NoC

4 NoC5 NoC6
(+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-)
Wp
Cp
Qp
Biểu đồ 3.1.3.
Nhận xét3.1.4. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR
đa mồi đặc hiệu ở 6 nồng độ (NA) mồi khác nhau:
Bảng 3.1.4
(+/-) %
Promotor
Nồng độ mồi (NA)
NA1 NA2 NA3 NA4 NA5 NA6
(+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-)
Wp

Cp
Qp
Biểu đồ 3.1.6
Nhận xét:
3.2. Dự kiến kết quả cho mục tiêu 2:
3.2.1. So sánh mức độ methyl hóa ở promotor Wp trong 2 phản ứng
PCR đơn mồi và PCR đa mồi đặc hiệu
Phản ứng
Methyl hóa
Wp Tổng
PCR đơn mồi PCR đa mồi
M(Methyl)
U(Không methyl)
Tổng n
. Nhận xét:
3.2.2. So sánh mức độ methyl hóa ở promotor Cp trong 2 phản ứng
PCR đơn mồi và PCR đa mồi đặc hiệu
Phản ứng Cp Tổng
Methyl hóa
PCR đơn mồi PCR đa mồi
M
U
Tổng n
. Nhận xét:
3.2.3. So sánh mức độ methyl hóa ở promotor Cp trong 2 phản ứng
PCR đơn mồi và PCR đa mồi đặc hiệu
Phản ứng
Methyl hóa
Qp Tổng
PCR đơn mồi PCR đa mồi

- Hoàn thiện đề cương
500.000đ
200.000đ
100.000đ
200.000đ
2. Thu thập số liệu
- Chiết tách mẫu
- Hóa chất và sinh phẩm:
+ Kit xử lý ADN (Bisufite)
+ Trizol
+ dNTPs
+ Enzym Taq DNA polymerase
(Buffer)
+ Mồi
+Và các hóa chất khác:
31.500.000đ
4000.0000đ
8.000.000đ
4.000.000đ
2.500.000đ
8.000.000đ
5.000.000đ
4. In ấn tài liệu 1.000.000đ
5. Chi phí phát sinh 500.000đ
Tổng số tiền 33.500.000đ
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
TỔNG QUAN 3
1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam 3
1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr 3