1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể
dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Nơi có tỷ lệ ung thư vòm cao
nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu lại có tỷ lệ rất
thấp. Các nước đông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình.
Virut Epstein-Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di truyền
đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng và EBV là yếu tố
được nghiên cứu nhiều nhất.
EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không
biệt hóa và tồn tại các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen
quan trọng là EBNA1, LMP1 và 2. EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bào
chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫn
truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinh
ung thư trong các tế bào bị nhiễm. Các gen này nằm xa nhau trong bộ gen và được
biểu lộ nhờ những promoter khác nhau. EBNA1 được biểu lộ trong các thể nhiễm
tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter, bao gồm Cp, Wp và Qp. Tuy nhiên trong
ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều
hòa biểu lộ gen EBNA1.
Ngoại di truyền được cho là có vai trò rất quan trọng trong điều hòa biểu lộ
gen, chúng bao gồm methyl hóa ADN vùng promoter, sửa chữa histon và
nucleosom. Mức độ methyl hóa xảy ra ở các vị trí CpG của ADN tại vùng
promoter và exon1 có vai trò trong điều hòa biểu lộ gen, có thể làm giảm biểu lộ
hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gen mà bình thường vẫn được biểu lộ. Việc xác
định mức độ methyl hóa vùng khởi động của một gen có ý nghĩa quan trọng trong
tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng gen đó trong nhiều
quá trình bệnh lý như ung thư, đồng thời dấu ấn này cũng góp phần trong chẩn
2
đoán sớm trong ung thư. Ngoài ra, việc làm mất methyl hóa có tác dụng làm gen
hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của chúng, giúp cho việc điều trị những
rối loạn hay bệnh lý khác nhau.

Virut Epstein-Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được
nghiên cứu nhiều nhất cho thấy có liên quan chặt chẽ của nó với UTVMH. Người
ta phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư
biểu mô không biệt hóa (UCNT) và EBV được phát hiện là từ tế bào UTVMH chứ
không phải từ lympho thâm nhiễm đã được chứng minh từ chuột trụi lông được
truyền khối u lấy từ bệnh nhân UTVMH, khối u này không chứa lympho thâm
nhiễm (Klein và cs 1974) [trích từ 89]. Ngoài ra, các sản phẩm gen của EBV là
EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết
UTVMH hoặc ở tổn thương quá sản tại biểu mô vòm họng gồm những dòng tế bào
tiền ác tính nhiễm EBV. Điều này phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV là một
trong những yếu tố khởi phát trong cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển
của UTVMH [124].
Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng,
người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh
nhân. Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH cao hơn
8 - 10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác hoặc người khỏe về
4
lâm sàng (Henle và cs 1970, 1973; Klein và cs 1970) [trích từ 89 c.binh]. Đặc biệt
IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường
qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [6],[8],[7],[13],[18],[25],
[156] , có giá trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có
giá trị là một dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng
cao( ref). Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện
tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển của UTVMH và nó tương quan với
nồng độ IgA/VCA [89].
1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt
Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô nhiễm
liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống. Nhiều
nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ý
kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) là

Namalwa, nó tích hợp vào nhiẽm sắc thể ở vị trí 1p35. Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong
lympho B, EBV biểu lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm
quá thấp (1 tế bào lympho B/1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn
dịch. Khi ở thể dung giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm
vào các tế bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân
lên trong cơ thể.
Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằng
virut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra là sự tiếp
cận giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV. Tế bào B đi vào chu trình
dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus
mới cho các tế bào khác trên một diện rộng (Bayliss và Wolf 1980,1981) [trích từ
6
89]. Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào qua
trung gian rexeptơ với IgA (Sixbey và Yao, 1992) [trích từ 89]. Ngoài ra, phân tử
MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu mô [10].
Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi các tế
bào máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Nature Killer cell).
1.3.2. Cấu trúc của EBV
EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó khoảng 172-
kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid. Suốt chiều dài của gen
có thể chia làm 4 vùng chính: 1 chuỗi ngắn duy nhất (US- short unique ), 1 chuỗi
lặp ( IR- internal repeat), 1 chuỗi dài duy nhất (UL - long unique ) và 1 chuỗi lặp
cuối cùng ( TR - terminal repeat ). EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng ở tế
bào bị nhiễm bởi đầu TR của nó.(hình 1A). Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95-8
bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ
cái và theo thứ tự kích thước giảm dần. (hình 1B). Thuật ngữ sử dụng cho từng
đoạn như sau: Theo mỗi chữ là ký hiệu cho từng đoạn ( A, B …), đọc trực tiếp
( trái hoặc phải) và số bắt đầu theo thứ tự (1,2,3…) ví dụ như BARF0, BARF1.
EBV của dòng tế bào B95-8 được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân
hàng gen là V01555 [1].

0 EBER1 & 2
LMP2A +/-
Người thường
I EBER1 & 2
EBNA1
U lympho Burkitt,
NPC
8
II EBER1 & 2
EBNA1
LMP1
LMP2A&2B
NPC, U lympho loại Hodgkin
U lympho tế bào T, ung thư
tuyến nước bọt…
III EBER1&2
EBNA1- 6
LMP1
LMP2A & B
U lympho sau ghép tạng. U
lympho ở bệnh nhân AIDS, bạch
cầu đơn nhân nhiễn khuẩn,
DLBCL?
1.3.4. Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn
1.3.4.1. EBNA1
Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng
66-95 kDa và chiều dài là 641 axit amin. Kích thước này được thay đổi ở các
chủng khác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-Ala) [58]. Các
cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ ràng: một vùng cơ bản
nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin, vùng cơ

Các gen trong gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B và 3C nằm ở giữa bộ
gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự và có trọng lượng phân tử từ 140-180
kDa. Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B và 3C giữa EBV typ 1 và II có giống
nhau ở 84%, 80% và 72% một cách tương ứng [89]. Các protein này hoạt động có
chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác với các protein RBP-JK [90].
10
1.3.4.4. EBNA-LP
Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ 20-130 kDa, là
kết quả của hoạt động prômôtơ Wp . Cùng với EBNA2, EBNA-LP là một trong
những protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro
1.3.4.5. LMP1
Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu 3'của bộ gen
EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng virus [104, 105]. Ở
chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có ba vùng, (i) một vùng đầu N
gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước được kết nối bởi ba vòng
bên ngoài và hai vòng nội bào (iii) một vùng đầu C có 200 acid min bao gồm hai
lĩnh vực chức năng quan trọng[104, 106] được gọi là vùng hoạt hóa CTAR1 (C-
Trminal Activation Region1: aa194-232) và CTAR2 ( aa 351-386).
LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng , di căn và chống lại
chết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung thư vì
nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm, biến đổi tế
bào Rat-1 trong ống nghiệm để tăng trưởng độc lập, và là tumorigenic ở chuột
nude [109]. Biểu hiện của LMP1 cũng tác động ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng
trưởng của tế bào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của chúng, gây biến đổi hình thái
của một số dòng tế bào biểu mô [110, 111], và làm tăng biểu hiện của các yếu tố
tăng trưởng biểu bì (EGFR [112].
1.3.4. 6. LMP2A/2B
LMP2 được mã hóa bởi chỗ ghép nối hình thành dạng vòng của EBV [119]. LMP2
có hai loại là LMP2A và LMP2B, được phiên mã từ hai prômôtơ khác nhau và chỉ
khác là LMP2A có thêm đoạn 119 acid amin ở đầu N tận còn LMP2 thì không có.


Chú thích (Hình ): Một cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN.
A: Hai nucleotid CpG ở vùng prômôtơ không methyl hóa, cho phép phiên
mã xảy ra trong các tế bào bình thường.
B: Phiên mã bị chặn bởi tăng methyla hóa trong vùng prômôtơ.
Do đó sự methyl hóa ADN của các gen trong các tế bào ung thư hiện nay là
một mục tiêu hấp dẫn điều trị và là một kiến thức mới trong lĩnh vực chẩn đoán
13
phân tử, tức là, phát hiện sớm bệnh bằng sử dụng PCR để xác định methyl hóa
ADN. [ luận án]
1.4.2. Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1
EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa của các promoter
khác nhau ở những thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu kỳ dung giải
(Fp). Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt hóa, trong khi các
promoter khác không hoạt động. Ngược lại, trong thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp
được hoạt hóa, tuy nhiên phụ thuộc vào từng thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III. Ở thể
nhiễm tiềm ẩn I và II chỉ có Qp hoạt động, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai
promoter Wp và Cp hoạt động. Hai promoter này hoạt động luân phiên và Wp
được hoạt động trước ở một thời gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động
lâu dài hơn
Hình 4. Các vùng promotor của EBV điểu khiển phiên mã.
Việc các
promoter đóng hoặc mở được thực hiện bởi các yếu tố khác nhau, trong đó có
methyl hóa các CpG vùng promoter. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các promoter Wp
14
và Cp bị đóng lại, do đó EBV chỉ biểu lộ EBNA1 do Qp như trong trường hợp
UTVMH. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa biết tại sao trong ung thư vòm mũi họng
EBV lại chỉ có biểu lộ một số gen như đã nêu, khác với trong một số ung thư liên
quan đến EBV. Nghiên cứu về methyl hóa giúp tìm hiều cơ chế biểu lộ gen, đồng
thời nó cũng là những dấu ấn giúp cho chẩn đoán cũng như điều trị liên quan đến

- Các bệnh nhân ở giai đoạn 1 hoặc đã có di căn.
- Bệnh nhân đến khám định kỳ
2.3. Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu:
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu:
- Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Trình tự kỹ thuật cần thực hiện:
+ Thiết kế mồi.
+ Chiết tách AND, ARN, Protein.
+ Xử lý AND bằng Bisulfite
16
+ Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi.
+ Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu.
2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu:
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin
- Quan sát và ghi kết quả xét nghiệm
- Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án và điền phiếu theo mẫu (phụ lục kèm theo)
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được làm sạch trước khi nhập vào máy tính. Xử lý số liệu bằng
phần mềm chương trình SPSS 15.0 với các test thống kê thích hợp trong y học
2.5. Sơ đồ nghiên cứu
RT-PCA
CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ
Tách chiết mẫuMẫu
ProteinARNADN
CDNABisulfite
MMSPMSP
PCR
17
CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN
18

+ Bisufite
+ DNTPs
+ Enzym (Buffer)
+ Mồi
8000.000/1kit
7.500.000
5000.000/250 mẫu
3.500.000/40 Nucleotid
4. In ấn tài liệu 1.000.000đ
5. Chi phí phát sinh 500.000đ
Tổng số tiền 30.000.000đ
.
Phạm Thụy Liên, Lê Vũ Anh và Cs (2002), "Một vài đặc điểm dịch tễ học của
bệnh nhân ung thư vòm họng ở Miền bắc Việt nam", Y học thực hành, 4(8),
tr.3-8.