VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ne
an
dP

ha
r

ma
c

y,

KHOA Y DƢỢC

LÊ THỊ THANH

ed

ici

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN
ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU

ho
ol


KHOA Y DƢỢC

ne
an
dP

ha
r

LÊ THỊ THANH

ho
ol
of
M

ed

ici

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ
PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ
SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS
VAR. FUSCIDISCUS K. KOMATSU, S. ZHU
& S.Q. CAI)

Khóa
Ngƣời hƣớng dẫn

ma
c

Thực vật – Viện Dược liệu.
Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

ne
an
dP

hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài khóa luận này.

ha
r

TS. Nguyễn Thị Duyên – Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược liệu, PGS.TS.
Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp
Lãnh đạo, thầy cô công tác tại Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã
giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được học tập, nghiên cứu tại khoa suốt 5 năm học qua.
Cán bộ nghiên cứu khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, lãnh đạo Viện
Dược liệu, đặc biệt PGS.TS. Đỗ Thị Hà đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá
trình tiến hành thực nghiệm.

ici

Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và trồng cây Sâm Lai

ed

Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai)”, mã



Phân đoạn butanol Sâm Lai Châu

BuOH

Butanol

CC

Sắc ký cột (Column Chromatography)

DCM

Dicloromethan

DCMLC

Phân đoạn DCM Sâm Lai Châu

DL/DM

Dược liệu/Dung môi

EtOH

Ethanol

GLUT4



MS

Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor- Kappa B)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

PCA

Phản ứng phản
Anaphylaxis)

PRT4

Pseudoginsenosid

yri

ha
r

Methanol

Mp.

NMR

ne
an
dP



Hệ số lưu

SKĐ

Sắc ký đồ

vệ

thụ

động

(Passive

Cutaneous


Receptor của LPS (Tool-Like Receptor)

TLTK

Tài liệu tham khảo

TNF-α

Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor)

Treg


ed
ho
ol
of
M
Sc
gh
t@
yri
Co
p

VN
U

TLR4

y,

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

ma
c

TLC


VN
U


ho
ol
of
M

ed

ici

ne
an
dP

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ hợp chất LC07 và Rb1 .......................................................... 30


VN
U

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. ..................... 4

y,

Hình 1.2. Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidiscus. ........ 13

ma
c


M

ed

ici

Hình 3.7. Công thức hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) ........................................... 32


VN
U

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

ma
c

y,

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

ha
r

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2

Sc

1.2.4. Thành phần hóa học ............................................................................... 14
1.2.5. Tác dụng sinh học................................................................................... 14

gh
t@

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2.1. Đối tượng ........................................................................................................... 15

Co
p

yri

2.2. Hoá chất, thiết bị ................................................................................................ 15
2.2.1. Hoá chất .................................................................................................. 15
2.2.2. Thiết bị.................................................................................................... 15

2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết ....... 16


VN
U

2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập....................................................... 16
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc ........................................ 17
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 20


t@

Sc

PHỤ LỤC

ho
ol
of
M

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ed

ici

3.3. Bàn luận.............................................................................................................. 32
3.3.1. Về chiết xuất ........................................................................................... 32
3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất ..................... 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 37


VN
U

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nền kinh tế - xã hội ngày càng phát triển và hiện đại hơn, kéo theo đó là nhu



Việt Nam nổi tiếng với loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha &
Grushv), đây là một trong những loài Sâm có hàm lượng saponin rất cao. Năm
2013, Phan Kế Long cùng cộng sự đã phát hiện ra một thứ Sâm mới được đặt tên là

ho
ol
of
M

Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus), bậc phân loại dưới loài của
Sâm Việt Nam ở huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu [38]. Mặc dù các nghiên cứu sơ
bộ cho thấy Sâm Lai Châu cũng chứa hàm lượng saponin tương đối cao đem lại
những hiệu quả đáng chú ý, song cho đến nay, còn khá ít những nghiên cứu chi tiết
về thứ Sâm này.

Sc

Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng của Sâm
Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân
lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần

gh
t@

thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S.
Zhu & S.Q. Cai)” với 2 mục tiêu cần đạt được:

Co
p

xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc

ne
an
dP

Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam Canada (có 2 loài P. quinquefolius và P.
trifoliatus) [6,32,33]. Vùng Đông Bắc Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung

ici

Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài là P. ginseng và P. japonica.
Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây-Nam của Trung Quốc lan
tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề
nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và
dưới loài (thứ) mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng là P. notoginseng (nhập từ Bắc

ed

Mỹ) và P. pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại, nhưng giả thiết có
nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi

Sc

ho
ol
of
M

nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) trên thế giới.


là loài thứ 20 thuộc chi Panax được phát hiện trên thế giới và là loài thứ 3 của chi

Panax L. được tìm thấy và công bố chính thức ở Việt Nam. Đây là loài đặc hữu của

ma
c

Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Bộ: Apiales
Họ: Araliaceae

- Chi: Panax
- Loài: Panax vietnamensis Ha & Grushv.

ha
r

-

y,

hệ thực vật Việt Nam (Theo Trung tâm Sâm Việt Nam - 1993) [54].
Về phân loại Sâm Việt Nam [53]:

ne
an
dP



Co
p

yri

gh
t@

4-6 mm [4].
Sâm Việt Nam mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban
ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C. Sâm Việt Nam có thể sống rất lâu, thậm
chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân
rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm
xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây Sâm
trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7
bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn

3


ici

ne
an
dP

ha
r


Co
p

yri

gh
t@

Sc

Thành phần chủ yếu trong các loài thuộc chi Panax L. nói chung hay Sâm
Việt Nam nói riêng là saponin sâm hay còn gọi là ginsenosid. Loại và tỷ lệ
ginsenosid khác nhau giữa các loài và giữa các bộ phân của loài. Theo nghiên cứu
tổng quan về Sâm Việt Nam – Panax vietnamensis đã công bố gần 50 hợp chất
saponin gồm các dẫn xuất của các dạng protopanaxadiol, ocotillol, oleanolic,
panaxatriol và dammarenediol [20]. Các cấu trúc saponin này có từ 2-6 phân tử
đường, chủ yếu là đường 6 cạnh gồm glucose, xylose và rhamnose.
Ngoài các ginsenosid, trong các bộ phận khác nhau của Sâm Việt Nam còn
có chứa polyacetylen, polysaccharid, flavonoid, daucosterin, chất nhầy, acid amin,
chất đắng, vitamin, cholin, pectin, dầu béo và tinh dầu [4].

4


VN
U

1.1.5.1. Cấu trúc các saponin Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
a. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol.


5

Ginsenosid Rd

-Glc2-1Glc

6

Gypenosid XVII

-Glc

7

Notoginsenosid Fa

-Glc2-1Glc2-1Xyl

8

Notoginsenosid R4

9

Kiểu cấu trúc

-Glc6-1Glc

A


Quinquenosid R1

-Glc2-1Glc6-Ac
hoặc -Glc2-1Glc

-Glc2-1Glc6-Ac
hoặc -Glc2-1Glc

A

10

Yesanchinosid J

-Glc2-1Glc
6|
Ac

-Glc6-1Glc6-1Xyl

A

11

Ginsenosid Re

-Glc6-1Rha

-Glc



15

Ginsenosid Rh5

-CH3

B

gh
t@

Sc

ho
ol
of
M

ed

ici

ne
an
dP

1

yri


Quinquenosid L2

-Glc2-1Glc

18

Notoginsenosid R1

-H

19

Notoginsenosid R6

-H

20

Pseudo-ginsenosid
RS1

-H

21

Vina-ginsenosid R4 -Glc2-1Glc

-Glc



E

Co
p

yri

gh
t@

Sc

ho
ol
of
M

ed

ici

17

R3

ha
r

Tên


R2

22

24(S)-Vinaginsenosid R9

-Glc2-1Glc

-Glc

23

24(R)-Vina-Glc2-1Glc
ginsenosid R9 (=
Majorosid F1)

-Glc

F

24

Vina-ginsenosid
R13

-Glc2-1Glc

-Glc



K

27

Vina-ginsenosid
R25

-Glc

28

Vina-ginsenosid
R12

-Glc

Sc

26

-Glc

M
-

Co
p

yri

b. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol

ha
r

ma
c

y,

Bảng 1.2. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam [20]

Tên

R1

29

24(S)-Majonosid R1

30

24(S)-Majonosid R2

31

Protopanaxatriol oxid II

32



-H

34

Vina-ginsenosid R1

-Glc2-1Rha

-H

35

Vina-ginsenosid R2

-Glc2-1Xyl

-H

36

Vina-ginsenosid R5

-Glc2-1Xyl4-αGlc

-H

37

Vina-ginsenosid R6

ed

ici

-Glc2-1Glc

8

-OH


VN
U

c. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic

39

Tên

R1

Ginsenosid Ro (=

-Glc

Chikusetsusaponin V)
40

Chikusetsusaponin


-Glc

-Ara(p)

ed

41

R3

ici

IVa

R2

ne
an
dP

TT

ha
r

ma
c

y,

43

Vina-ginsenosid R11

-Glc2-1Xyl

-OH

Co
p

yri

42

9


VN
U

e. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol

TT

R1

Vina-ginsenosid R3

-Glc

nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại của hợp chất là

ed

chuỗi C7H15 [18,21,34].

1.1.6. Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax

ho
ol
of
M

vietnamensis Ha & Grushv.

Do có thành phần chính gồm các ginsenosid cho nên các các dụng sinh học
của Sâm hầu hết đều do ginsenosid đem lại.
- Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
Sâm Việt Nam liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động

Sc

vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh [1].
- Tác dụng chống trầm cảm

gh
t@

Sâm Việt Nam có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg



+ Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4
tuần, thời gian ngủ khi tiêm Natri barbital giảm đi 30%. Sâm Việt Nam liều uống
mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [1].

ne
an
dP

- Tác dụng chống oxy hóa

ha
r

50-100 mg/kg hoặc hoạt chất majonosid R2 tiêm trong màng bụng liều 3,2; 12,5

Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não, gan và phân đoạn vi thể
gan của chuột nhắt trắng, saponin Sâm Việt Nam ở nồng độ 0,05-0,5 mg/ml có tác
dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (Malondialdehyd) là sản phẩm của
quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [1].

ici

- Tác dụng kích thích miễn dịch

Bột chiết Sâm Việt Nam liều uống 500 mg/kg và majonosid R2 tiêm trong

ho
ol
of


yri

họng ở người [1].
1.2. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu – Sâm Lai Châu
Năm 2003, Zhu và cộng sự đã mô tả một thứ mới có tên khoa học Panax

11


VN
U

vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai, bậc phân loại dưới

loài của Panax vietnamensis. Thứ này được phát hiện tại vùng Jinping, phía nam
tỉnh Vân Nam, Trung Quốc. Gần đây Phan Kế Long và cộng sự (2013) đã phát hiện

y,

thứ Panax vietnamensis var. fuscidiscus nói trên có phân bố ở tỉnh Lai Châu, Việt
Nam và được gọi tên là Sâm Lai Châu [38].

ma
c

1.2.1. Đặc điểm thực vật

Cây thảo, sống lâu năm. Cây mang hoa cao khoảng 0,5-0,8 m. Thân rễ nạc,


màu dần. Nhị hoa màu trắng, hơi thò. Chỉ nhị hình sợi mảnh, dài khoảng 2,5 mm.
Bầu 2 ô, 2 vòi nhụy, phát triển thành quả, 1 ô thường tiêu biến. Quả dẹt, kích thước
7 x 6 mm, màu nâu đỏ đến nâu tím với núm nhụy màu đen khi chín [38].
Sâm Lai Châu ra hoa vào tháng 6-7, quả trưởng thành vào tháng 10-11, quả

Co
p

yri

gh
t@

Sc

chín vào tháng 5-6 năm sau [38].

12


VN
U
y,
ma
c
ha
r
ne
an
dP


1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam
Theo Phan Kế Long và cộng sự (2014), hai thứ Sâm Lai Châu (P.
vietnamensis var. fuscidiscus) và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh, P.
vietnamensis Ha & Grushv. var. vietnamensis) của loài Sâm Việt (P. vietnamensis
Ha & Grushv) có quan hệ chị em [3]. Cụ thể khi so sánh khoảng cách di truyền giữa
loài Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh) thì khoảng cách di truyền
rất thấp (0,7%) và số vị trí nucleotide sai khác của 2 loài này là 4 nucleotide [7].

13


VN
U

1.2.4. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm Lai Châu còn rất hạn chế.

y,

Theo nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2004), phần thân rễ Sâm Lai Châu Panax
vietnamensis var. fuscidiscus có chứa các hợp chất ginsenosid Rb1, ginsenosid Rc,

ha
r

ma
c

ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, notoginsenosid R2, majonosid R2,


TLTK
[20,52]

Co
p

yri

gh
t@

Sc

ho
ol
of
M

ed

1.2.5. Tác dụng sinh học
Theo tìm hiểu các nghiên cứu, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá
tác dụng sinh học của Sâm Lai Châu. Tuy nhiên, dựa vào kết quả nghiên cứu thành
phần hóa học của Sâm Lai Châu [52] và các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền
giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam [3,7] ta có thể cho những dự đoán rằng Sâm
Lai Châu cũng có các tác dụng sinh học tương tự như Sâm Việt Nam.

14


dicloromethan.

ici

Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo
YMC (30-50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd.).

ed

Chất hấp phụ SephadexTM LH-20 (Amersham Bioscience, Uppsala, Thụy Sỹ).

ho
ol
of
M

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G
F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm).
Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất.
2.2.2. Thiết bị

Co
p

yri

gh
t@

Sc

c

2.3. Phƣơng pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết

ha
r

2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất và phân lập
Thân rễ Sâm Lai Châu được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt
với dung môi cồn 70%. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc, cất thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc. Cao này được hòa lại với nước và

ne
an
dP

chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần dicloromethan, nbutanol thu được các phân đoạn tương ứng.

Các hợp chất trong thân rễ Sâm Lai Châu được phân lập bằng phương pháp
sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck),
silica gel pha đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJisilisa Chemical Ltd.).

ici

Theo dõi, kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, thực

ed

hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck). Phát
hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc


Co
p

qua cột đến khi cột hoàn toàn ổn định (có thể từ 5-10 giờ). Chú ý không được để cột
bị khô dung môi.

16