ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THANH HÒA

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT
PHÂN LẬP TỪCÂY ĐƠN ĐẤT (WEDELIA
CHINENSIS)

Chuyên ngành:Hóa phân tích
Mã số: 8 44 01 18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHẠM THẾ CHÍNH

Thái Nguyên-2018


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Thế Chính
ngƣời thầy đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và truyền đam mê nghiên cứu
cho em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, ngƣời thầy đã tận tình
hƣớng dẫn để em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trƣờng Đại
học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, tập thể các thầy cô, anh chị và các
bạn tại khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã
tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo
viên Trƣờng THPT Đồ Sơn – Hải Phòng đã tạo điều kiện thuận lợi về thời

1.3.1 Nguồn gốc và phân bố....................................................................... 13
1.4.Thành phần hóa học của cây đơn đất .........................................................
13
1.4.1 Nhóm wedelo .................................................................................... 13
1.4.2 Nhóm tecpenoit ................................................................................. 14
1.4.3 Nhóm flavonoit ................................................................................. 14
1.4.4 Thành phần hóa học của tinh dầu cây đơn đất .................................. 15
1.5. Mục tiêu của luận văn ......................................................................... 16
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM ....................................................................... 17
2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị ....................................
17
2.1.1. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................. 17
2.1.2. Hóa chất và dung môi ...................................................................... 17
2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng
sắc kí lớp mỏng .......................................................................................... 17
b


2.1.4. Xác nhận cấu trúc ............................................................................. 17
2.2. Chuẩn bị mẫu các hợp chất thiên nhiên ....................................................
18
2.2.1. Khảo sát điều kiện tách cột bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) ........... 18

b


2.2.2. Phân lập các chất tinh khiết từ cặn chiết diclometan ....................... 19
2.3. Phân tích cấu trúc của hợp chất HOA01 bằng phổ IR .............................
20
2.4. Phân tích cấu trúc của hợp chất HOA01 bằng phổ MS ...........................


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MS

Phƣơng pháp phổ khối lƣợng

EI

Phƣơng pháp bắn phá bằng dòng electron

CI

Phƣơng pháp ion hóa hóa học

FAB

Phƣơng pháp bắn phá nguyên tử nhanh

GC

Phƣơng pháp sắc ký khí

HPLC

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

SKLM

Sắc kí lớp mỏng


1

Hình 3.5. Phổ H-NMR giãn 2 của HOA01 ............................................... 31
Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất HOA01 ........................................ 32
Hình 3.7. Phổ DEPT của HOA01 .............................................................. 33
Hình 3.8. Phổ HSQC của hợp chất HOA01 ............................................... 34
Hình 3.9. Phổ HSQC của hợp chất HOA01 ............................................... 34
Hình 3.10. Phổ HMBC của HOA01 .......................................................... 36
Hình 3.11. Phổ HMBC của HOA01 tiếp ................................................... 36
Hình 3.12: Phổ COSY của hợp chất HOA01 ............................................. 37
Hình 3.13: Phổ LC/MS của hợp chất HOA01 ........................................... 38
Hình 3.14. Phổ DEPT của 1P ..................................................................... 39
Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của 1P ............................................................... 40

f


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Phân loại phổ hai chiều (2D) ....................................................... 5
Bảng 2.1. Kết quả chạy sắc ký cột ............................................................. 20
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tách bằng SKLM ................... 25
Bảng 3.2. Bảng dữ liệu phổ quy gán của HOA01 ...................................... 35
1

13

Bảng 3.3 . Kết quả phổ H-NMR và C-NMR của hợp chất 1P ............... 41

g



Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về c c phƣơng ph p

c

nh cấu tr c

1.1.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)[1,4]
Cơ sở của các phƣơng pháp phổ đều dựa trên sự tƣơng tác của từ
trƣờng với hạt nhân của các nguyên tố.
Tính chất của hạt nhân nguyên tố
Nhƣ ta biết, hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng, điện tích và liên quan
đến tƣơng tác của electron bao quanh hạt nhân nhƣ trung hòa điện tích và
tính chất hóa học đặc trƣng của nguyên tử. Hạt nhân của một vài đồng vị tự
nhiên của các nguyên tố có momen góc hay momen spin với tổng biên độ
ħ√

Hợp phần đo lớn nhất của momen góc là Iћ trong đó ћ =

h/2л
là hằng số Planck rút gọn. I là số lƣợng tử, có thể là số nguyên hay số bán
nguyên (0,1,3/2…). Vì I đƣợc lƣợng tử hóa nên có một dãy các số không
liên tục của momen góc đƣợc quan sát và độ lớn của nó bằng ћm , ở đây số
lƣợng tử m có thể có các giá trị I, I -1, I-2,… -I. Nhƣ vậy có 2I + 1 giá trị
khác nhau của trạng thái spin của hạt nhân với số lƣợng tử I.
Hạt nhân nguyên tử ngoài momen spin đƣợc đặc trƣng bằng số lƣợng
tử spin còn có momen từ µ đƣợc đặc trƣng bằng số lƣợng tử từ mI thay đổi
theo trạng thái spin khác nhau, µ có 2I + 1 giá trị khác nhau. Khi không có


δ; đối với hạt nhân H thì:
ν TM S −ν
νo

δ=

x

6

.10 ( ppm)

νTMS, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân
mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học đƣợc định
nghĩa một cách tổng quát nhƣ sau:
δ=

ν

c huan

−ν

νo

x

6

không tƣơng đƣơng sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi
vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên
sự tách tín hiệu cộng hƣởng thành nhiều hợp phần là do tƣơng tác của các
hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tƣơng tác đó thể hiện qua các electron
liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tƣơng tác, số liên kết
và bản chất các liên kết ngăn giữa các tƣơng tác [3].
Hằng số tƣơng tác spin-spin J đƣợc xác định bằng khoảng cách giữa
các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tƣơng tác spin-spin J ta có
thể rút ra kết luận về vị trí trƣơng đối của các hạt nhân có tƣơng tác với
nhau [2].
Phổ 2D-NMR
NMR (nuclear magnetic resonance) là kỹ thuật có giá trị nhất để xác
định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Phƣơng pháp NMR có hạn chế là chỉ áp
dụng cho các hạt nhân nguyên tử với số hiệu nguyên tử (số thứ tự Z) lẻ

4


hoặc số khối (A) lẻ vì các nguyên tử loại này có spin hạt nhân thì mới có
1

13

15

19

31

tính chất từ nhƣ H, C, N, F, P…

J H-

COSY (hoặc HOMOCOSY,DQF COSY)

δ1

δ1 H (ppm)

13

1

H(ppm)

1

1

1

H(Hz)

13

HET2DJ( C VÀ H)

δ13C(ppm)

J H-



δ1 H(ppm)

δ1 H(ppm)

2D- INADEQUATE

δ13C(ppm)

δ13C(ppm)

H(ppm)

H(ppm)

H(ppm)

1.1.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1,4]
Nguyên tắc chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là phá vỡ phân
tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dƣơng có số khối z = m/e.
Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận đƣợc phổ khối
lƣợng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân
tử của chất nghiên cứu.
Để phá vỡ phân tử ngƣời ta có nhiều phƣơng pháp: bắn phá bằng
dòng electron (EI), phƣơng pháp ion hóa hóa học (CI), phƣơng pháp bắn
phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lƣợng cao để
bắn phá phân tử là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng nhất. Khi bắn phá các
phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện
tích dƣơng hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:
ABC


Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là
các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lƣợng bắn phá các
phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhƣng với năng lƣợng cao thì ion
phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dƣơng (+), hoặc các ion gốc, các
gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên ngƣời ta thƣờng thực hiện bắn
phá các phân tử ở mức năng lƣợng 70 eV.
6


Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phƣơng pháp bắn phá và
năng lƣợng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa.

Hình 1.4. Phổ khối lượng củaToluen C7H8

Các ion dƣơng hình thành đều có khối lƣợng m và mang điện tích e,
tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối
khác nhau ra khỏi nhau và xác định đƣợc xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ
đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cƣờng độ I) và số
khối z thì đồ thị này đƣợc gọi là phổ khối lƣợng (Hình 1.3).
Nhƣ vậy, khi phân tích phổ khối lƣợng ngƣời ta thu đƣợc khối lƣợng
phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đó có thể xác
định đƣợc cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong
những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một
chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phƣơng pháp phổ với nhau.
1.1.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1,4]
Trong số các phƣơng pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho
nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất. Khi chiếu các bức xạ
hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân
tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn. Có hai

để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ
-1

hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm đƣợc gọi là
vùng vân ngón tay.
1.2. Phân tích hàm lƣợng các chất bằng HPLC [16]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn đƣợc gọi là sắc ký lỏng áp
suất cao (High - Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân
tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dƣới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân
tích sắc ký, các chất đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự
phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thƣờng. Chính vì thế mà các thuốc không
bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Sắc ký thƣờng đƣợc hoàn
thành trong một thời gian ngắn (khoảng 30 phút). Chỉ những thành phần có
hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích đƣợc bằng HPLC. Ngày nay
HPLC đã và đang đƣợc sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hóa học nói
chung cũng nhƣ trong kiểm tra chất lƣợng thuốc và phân tích sinh dƣợc nói
riêng.

Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC
(1) Bình chứa pha

ộng:Máy HPLC thƣờng có 4 đƣờng dung môi

vào đầu bơm cao áp cho ph p chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng


một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đƣờng là 100%.


(5) Cột sắc ký: Cột chứa pha tĩnh đƣợc coi là trái tim của của hệ
thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.Cột pha tĩnh thông thƣờng làm bằng th p
không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đƣờng kính trong 1-10mm, hạt
nhồi cỡ 0,3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.
(6) Đầu dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và
cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lƣợng. Tùy
10


theo tính chất của các chất phân tích mà ngƣời ta lựa chọn loại đầu dò phù
hợp.Tín hiệu đầu dò thu đƣợc có thể là: độ hấp thụ quang, cƣờng độ phát
xạ, cƣờng độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…Trên cơ sở
đó, ngƣời ta sản xuất các loại đầu dò sau:
- Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để
phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại đầu dò thông dụng nhất.
- Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh
quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang.
- Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng qu t chồng phổ để
định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.
- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thƣờng dùng đo các loại đƣờng.
- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn.
- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…
(7)Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò
phát hiện.Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này đƣợc phần mềm
trong hệ thống ghi nhận, lƣu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan
đến peak nhƣ tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý
các thông số liên quan đến kết quả phân tích.
(8) In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ đƣợc in ra qua máy
in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.

cƣa to thô, sần sùi có lông ngắn màu trắng hoặc dài hơn. Cụm hoa hình
đầu, màu vàng, mọc ở nách lá hay ở đầu cành, mọc đơn độc hay từng đôi
một. Quả bế hình thoi, ba cạnh, không đều, dài 1cm, trên có rãnh chạy dọc
[6].
1.3.1 Nguồn gốc và phân bố
Đơn đất là một loại thực vật thân thảo đƣợc tìm thấy ở những nơi ẩm
ƣớt nhƣ Uttar Pradesh, Assam, Arunachal Pradesh và dọc tất cả các khu
vực ven biển của Bengal, Myanma, Konkan, Trung Quốc và Nhật Bản.
Ngoài ra, còn thấy mọc ở Ấn Độ, Thái Lan, Philipin [2, 17].
Ở Việt Nam, cây đơn đất phân bố rộng rãi khắp nơi ở miền Bắc và
Miền Trung nƣớc ta nhƣ: Hà Giang, Cao Bằng, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà
Nội, Hòa Bình, Hải Phòng, Gia Lai, Lâm Đồng…vv. Trừ vùng núi cao lạnh
nhƣ: Sa Pa (Lào Cai), Sìn Hồ (Lai Châu), Phó Bảng (Hà Giang) không thấy
có cây đơn đất [6, 7].
1.4.Thành phần hóa học của cây ơn ất
Đơn đất thuộc chi Wedelia là một chi lớn trong họ Cúc (Asteraceae),
nhƣng nghiên cứu về loài cây này còn rất hạn chế. Các nghiên cứu về thành
phần hóa học của cây chủ yếu là của tác giả nƣớc ngoài. Căn cứ vào tài liệu
thu thập đƣợc, các thành phần hóa học của cây đơn đất có thể chia làm ba
nhóm chất chính là: wedelo, tecpenoit, flavonoit.
1.4.1 Nhóm wedelo
O

HO

O

O

HO


Axit norwedelic

Năm 1956, lần đầu tiên Govindchari TR, đã phân lập đƣợc một hợp
chất thuộc nhóm benzofuran đƣợc đặt tên là wedelolacton từ cây Wedelia
Calendulaceae, một loài thuộc chi Wedelia [9]. Sau đó các thực vật thuộc
13


chi Wedelia đều phân lập đƣợc các wedelolacton và các dẫn xuất của nó,
ngƣời ta đặt tên nhóm các hợp chất này là wedelo [8, 9, 17, 14].
1.4.2 Nhóm tecpenoit
H3C

CH3

CH3

CH3
OH

COOH

CH3
O

O

O


chất thuộc nhóm chất tecpenoit nhƣ axit (-) kaur-16-en-19-oic; hỗn hợp của
ba este là 3α-triglinoyloxy, 3α-angeloyloxy, axit 3α-senecioyloxy-kaur-16en-19-oic [10, 12]

1.4.3 Nhóm flavonoit
Cũng từ dịch chiết metanol của lá cây thuộc Wedelia, ngƣời ta đã
phân lập đƣợc một số flavonoit đáng chú ý [10], trong đó dịch chiết lá của


Wedelia Chinensis các nhà khoa học đã phân lập đƣợc apigenin và luteolin.
Đây là hai thành phần hóa học có hoạt tính chống oxy hóa đã đƣợc phát
hiện ở nhiều loài thực vật bậc cao [12].
OH
HO

O

OH

OH
O

HO

H

O

OH

Apigenin

Sapthulenol

Limonen