BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ
--------------------------

TRẦ
N
THỊ
KIM
MỴ

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT
TRONG CÂY
AN XOA (HELICTERES
HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM
BẰNG CÁC
PHƢƠNG
PHÁP HÓA
LÝ HIỆN ĐẠI


LUẬN
VĂN
THẠC
SỸ HÓA
HỌC

AN XOA (HELICTERES
HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM
BẰNG CÁC
PHƢƠNG
PHÁP HÓA
LÝ HIỆN ĐẠI

CHUYÊN NGÀNH: HÓA
PHÂN TÍCH
MÃ NGÀNH: 8440118


LUẬN
VĂN
THẠC
SỸ HÓA
HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN THANH TRÀ

H
À
N
Ộ
I
2
0
1
9

CN Việt Nam, Các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, Trung tâm nghiên cứu
các phƣơng pháp Phổ ứng dụng.
Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn này bằng tất cả sự
nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Rất mong nhận đƣợc những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2019
Học viên

Trần Thị Kim Mỵ


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
WHO
CC
TLC
IR
MS
NMR
1

H-NMR

13

C-NMR

DEPT
HPLC
HPLC-MS

13

C của hợp chất HH01................................................................................ 33

Hình 3.5: Phổ DEPT của hợp chất HH01............................................................................ 34
Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất HH01.......................................................................... 34
Hình 3.7: Tƣơng tác HMBC của hợp chất HH01................................................................35
Hình 3.8: Phổ MS của hợp chất HH02................................................................................ 36
1

Hình 3.9: Phổ H của hợp chất HH02..................................................................................37
Hình 3.10: Phổ

13

C của hợp chất HH02.............................................................................. 37

Hình 3.11: DEPT của hợp chất HH02..................................................................................38
Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH02................................................................ 38
Hình 3.13: Phổ MS của hợp chất HH03.............................................................................. 39
1

Hình 3.14: Phổ H của hợp chất HH03................................................................................40
Hình 3.15: Phổ

13

C của hợp chất HH03.............................................................................. 40

Hình 3.16: Phổ DEPT của hợp chất HH03.......................................................................... 41

Hình 3.26: Cấu trúc hợp chất HH05....................................................................................47
Hình 3.27: Phổ khối phân giải cao HRESI-MS của hợp chất HH06...................................48
1

Hình 3.28: Phổ H-NMR của hợp chất HH06.....................................................................48
Hình 3.29 : Phổ

13

C-NMR của hợp chất HH06...................................................................49

Hình 3.30: Phổ HSQC của hợp chất HH06......................................................................... 49
Hình 3.31: Phổ HMBC của hợp chất HH06........................................................................ 50
Hình 3.32 : Tƣơng tác HMBC của hợp chất HH06.............................................................50
1

Hình 3.33: Phổ H-NMR của HH07....................................................................................51
Hình 3.34: Phổ

13

C-NMR của HH07...................................................................................52

Hình 3.35: Phổ DEPT của HH07.........................................................................................52
Hình 3.36: Phổ HMBC của HH07....................................................................................... 53
Hình 3.37: Cấu trúc của hợp chất HH07..............................................................................54
1

Hình 3.38: Phổ H của hợp chất HH08................................................................................54
Hình 3.39: Phổ

1.2.1. Các triterpenoid............................................................................................... 4
1.2.2. Các coumarin................................................................................................... 8
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO
(STERCULIACEAE)................................................................................................ 8
1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CÁC
HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN................................................................................... 12
1.4.1. Các phƣơng pháp chiết xuất.......................................................................... 12
1.4.2. Các phƣơng pháp sắc ký............................................................................... 13
1.4.3. Các phƣơng pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc.........15
1.4.3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy)
16
1.4.3.2. Phổ khối lƣợng MS (Mass spectrometry).................................................. 17
1.4.3.3. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR).....17
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................20
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU............................................................................ 20
2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU................................. 20
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu........................................................................................ 21
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................... 21


2.3.1. Xử lý mẫu thực vật........................................................................................ 21
2.3.2. Điều chế các cặn chiết................................................................................... 21
2.3.3. Phƣơng pháp phân lập và phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất tự
nhiên [35,36]........................................................................................................... 22
2.3.4. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân cây An xoa.....................24
2.4. DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP
ĐƢỢC.................................................................................................................... 25
2.4.1. Betulin (HH01).............................................................................................. 25
2.4.2. Axit betulinic (HH02).................................................................................... 26
2.4.3. Axit alphitolic (HH03)................................................................................... 27

chính thức đƣợc sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thƣ.
Việt Nam là quốc gia nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có
hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Trong số này, nguồn tài nguyên cây
làm thuốc chiếm khoảng 30%. Trong những năm gần đây, rất nhiều công trình
nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vật Việt nam đã đƣợc thực hiện và đã có
những đóng góp quan trọng vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Những loài thực vật có tác dụng chữa bệnh là nguồn dƣợc liệu quý giá bởi
chúng có khả năng chữa bệnh cho con ngƣời và để lại ít tác dụng phụ hơn các
thuốc có nguồn gốc tổng hợp. Ngày nay, với mối hiểm họa về tình trạng gia
tăng bệnh tật đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo nhƣ ung thƣ, tim mạch…thì việc
nghiên cứu tác dụng làm thuốc của các loài thực vật mang tính ý nghĩa khoa
học và thời sự [2].
Cây An xoa đã đƣợc nhắc đến trong danh mục Thực vật chí ở Việt Nam và
trên thế giới, dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau nhƣ cảm cúm, sởi, ung nhọt,
kiết lỵ, trong đó có tác dụng với các bệnh về gan. Ở nƣớc ta, cây mọc nhiều ở
Bình Phƣớc, ven các sông suối, ngoài ra còn tìm thấy ở Lâm Đồng và các tỉnh
miền núi phía Bắc. Theo y học cổ truyền, từ xa xƣa, cây An xoa đƣợc xem nhƣ
là một bài thuốc gia truyền hỗ trợ điều trị xơ gan của ngƣời dân tộc thiểu số
Camphuchia. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học hoàn


2

chỉnh và tác dụng dƣợc lý của cây An Xoa ở Việt Nam và trên thế giới vẫn
còn rất hạn chế. Chính vì thế, chúng tôi đề xuất đề tài luận văn: “Phân tích
cấu trúc một số hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt
Nam bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại” với mục tiêu nghiên cứu
thành phần hóa học trong cây An xoa nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử
dụng cây thuốc một cách hợp lý và hiệu quả.
*Mục tiêu nghiên cứu:

Bầu đính ở giữa các nhị; 5 ô; lá noãn 5, phân cách bởi các rãnh quả; noãn
nhiều, đảo, xếp thành 2 dãy dọc; vòi thành cột; đầu nhụy không rõ. Qủa nang,
có lông, hạt nhiều, hình tháp.
Thành phần hóa học và tác dụng dược lý: Một số loài của chi này đƣợc
sử dụng trong y học dân tộc, nhƣ: rễ của loài Helicteres isora đƣợc dùng để
trị chứng mƣng mủ, viêm dạ dày, nhiễm trùng ruột, tiểu đƣờng. Loài H.
ovata và H. sacarolha đƣợc dùng để trị bệnh giang mai, và rễ của loài H.
hirsuta đƣợc dùng để trị đau dạ con.
1.2. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ CHI DÓ (HELICTERES)
Các nghiên cứu sinh học của một số loài thuộc chi này đã chứng tỏ
rằng dịch chiết của loài H. isora có hoạt tính chống tiểu đƣờng, giảm mỡ máu


4

[4-6]; dịch chiết của H. hirsuta có hoạt tính độc tế bào [7] và dịch chiết của
H. gardneriana thể hiện hoạt tính kháng ký sinh trùng gây bệnh sốt rét,
leishmania…[8].
Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài Helicteres đã chỉ ra đƣợc
việc phân lập các hợp chất: triterpenoid, flavonoid, lignan, neolignan và các
dẫn xuất của axit rosmarinic.
1.2.1. Các triterpenoid
Từ rễ của loài H. angustifolia. Các nhà khoa học Đài Loan [9] đã tách và
định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC ba triterpenoid có khung lupan đó là:
3β-acetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester (1), 3βacetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid (2) và 3β-acetoxy-27- (phydroxyl) benzoyloxylup -20(29)-en-28-oic acid methyl ester (3).
Tiếp theo nghiên cứu trên, vào năm 2008, khi nghiên cứu rễ của loài H.
angustifolia, nhóm tác giả Min-Hsiung Pan và cộng sự [10] đã công bố các
kết quả phân lập, và xác định cấu trúc của 3 triterpen mới đó là 3β-acetoxy27-[(E)-cinamoyloxy]lup-20(29)-en-28-oic acid methyl este (4), 3β-acetoxy27-[4-hydroxybezoyl)oxy]lup-20(29)-en-28-oic acid (5), 3β-acetoxy-27-[(4hydroxybezoyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid methyl este (6), cùng với 8
triterpen có cấu trúc đã biết là 3β-acetoxy-27-(benzoyloxy)_olean-12-en-28oic acid methyl este (7), cylicodiscic acid (3β,27-dihydroxylup-20(29)-en-28oic acid) (8), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulinic acid (9), pyracrenic acid (3βO-(trans-caffeoyl)_betulinic acid) (10), 3β-O-(trans-feruloyl)betulinic acid
(11), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulin (12), 3β-O-(cis-coumaroyl)_betulin

µg/ml (cucurbitacin B), và ED50= 7.6×10-5 µg/ml (isocucurbitacin B).

-5


7

Hình 1.2: Một số cucurbitacin phân lập từ chi Dó Helicteres
Cũng từ rễ của loài H. angustifolia [15], các tác giả Trung Quốc đã phân
lập đƣợc một steroit có khung pregnan tên là 2α,7β,20α-trihydroxy-3β,21dimethoxy-5-pregnanene (27).


8

1.2.2. Các coumarin
Từ rễ loài H. angustifolia, nhóm tác giả Wenliang Chen và cộng sự đã
phân lập đƣợc một coumarin mới có tên là 6,7,9α-trihydroxy-3,8,11αtrimethylcyclohexo-[d,e]-coumarin (28) [15]. Cũng từ loài H. angustifolia,
Wang và cộng sự [17] đã phân lập ra một hợp chất coumarin mới và đặt tên là
heliclacton (29)

Hình 1.3: Một số coumarin phân lập từ chi Dó Helicteres
Ngoải ra, chi Helicteres còn có chứa các hợp chất khác nhƣ
sesquiterpenoid quinon [19, 20], lignan [21], neolignan [22, 23], acid
rosmarinic [24] và flavonoid [25,26].
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO
(STERCULIACEAE)
Cây An xoa (hay còn gọi là Dó lông, Tổ kén cái) có tên khoa học là
Helicteres hirsuta Loureiro thuộc Họ Trôm Sterculiaceae. An xoa là cây bụi,
cao khoảng 1-3m, nhánh hình trụ, có lông. Lá hình trái xoan, dài 5-17cm,
rộng 2,5-7,5cm. Gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn. Mép có răng


Trong số 6 lignan tách ra từ loài này thì có 3 chất là 1, 4 và 5 là có hoạt
tính ức chế 3 dòng tế bào ung thƣ là: ung thƣ phổi (Lu1), ung thƣ tuyến tiền
liệt (LNCaP) và ung thƣ vú (MCF-7), trong đó, (±)-pinoresinol (30) thể hiện
khả năng gây độc tế bào mạnh trên dòng ung thƣ phổi Lu1, ung thƣ tuyến
tiền liệt (LNCaP), ung thƣ vú MCF-7, với IC50 từ 0,5-1,7µg/ml.
Gần đây, cây An xoa cũng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học
trong nƣớc. Nhóm tác giả Hồng Ngọc (2015, 2016) đã công bố cặn chiết
nƣớc và cặn chiết methanol từ lá và thân cây An xoa thu hái ở Khánh Hòa,
Việt Nam giàu nhóm chất phenol và flavonoid có tác dụng chống oxy hóa
invitro trên hệ DPPH, ABTS, FRAP [31, 32]. Nhóm tác giả Hữu Duyên
(2016) đã phân lập đƣợc 4 hợp chất từ cặn petroleum ether (PE) cây An xoa
thu hái ở Kiên Giang: lupeol (36), stigmasterol (37), tiliroside (38) và
apigenin (39), kết quả thử nghiệm gây độc tế bào cho thấy: cao chiết PE và
cao chiết dichloromethane (DC) có hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ gan
HepG2 với IC50 lần lƣợt là 28,29 và 30,30 µg/ml [33].

Hình 1.6: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu
hái ở Kiên Giang (Hữu Duyên, 2016)
Ngoài ra, nhóm tác giả Ngọc Quang (2018) đã phân lập đƣợc 12 hợp
chất từ loài An xoa H.hirsuta thu hái ở Bình Phƣớc bao gồm: 3-Otranscaffeoylbetulinic acid (40), 3b-benzoylbetulinic acid (41), betulinic acid
methyl ester (42), betulinic acid (43), lupeol (44), 4-hydroxybenzoic acid
(45), 3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester


11

(46), 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid (47), 5,8-dihydroxy-7,40dimethoxyflavone
(48),
isoscutellarein

−Phương pháp 2: Phƣơng pháp chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ
thành phần trong dƣợc liệu thì dung môi thích hợp nhất methanol hoặc
ethanol (80%). Nhất là methanol đƣợc xem nhƣ là dung môi vạn năng, nó
hòa tan đƣợc chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối
hydro với các nhóm phân cực khác. Dịch chiết với methanol thu đƣợc, đem
loại hết dung môi thu đƣợc cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dƣợc
liệu. Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi
không hòa lẫn với nƣớc và có độ phân cực từ yếu đến mạnh. Ví dụ dãy dung
môi: ether dầu, ether, chloroform, ethyl axetate, n-buthanol. Về cách chiết có
hai cách chiết:
-

Chiết ngâm lạnh: là phƣơng pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xƣa.
Sau khi chuẩn bị dƣợc liệu, tiến hành đổ dung môi ngập dƣợc liệu trong
bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết. Để
tăng cƣờng hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút dịch
chiết ở dƣới rồi đổ lên trên. Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần.

-

Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một cách
mãnh liệt- gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất


13

cần chiết xuất. Phƣơng pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phƣơng
pháp chiết xuất bằng ngâm lạnh nhƣng có nhƣợc điểm là chỉ áp dụng đƣợc
với quy mô nhỏ.
1.4.2. Các phƣơng pháp sắc ký


mép dƣới của bản mỏng 1,2 cm), đƣờng giới hạn di chuyển của dung môi
(cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết
chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).

−Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc
micropipet chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ,
lƣợng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng
không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử.
−Triển khai sắc ký: Bình triển khai thƣờng là bình thủy tinh, có nắp đậy
kín và đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ
dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để
giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bình triển
khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín
bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy đến đƣờng giới hạn,
lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết.

−Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bƣớc
sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là
Ce(SO4)2).

Hình 1.9: Các bƣớc tiến hành sắc ký bản mỏng
Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60
F254, kích thƣớc 20×20 cm, dày 0,2 mm.


Phương pháp sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp
phụ pha tĩnh đƣợc nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có