ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG

PHẠM THỊ BÍCH LUYẾN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC NGUỒN NITƠ
KHÁC NHAU LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ NĂNG
SUẤT CỦA VI TẢO ARTHROSPIRA PLATENSIS

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Cán bộ hƣớng dẫn: TS. PHẠM THỊ MỸ
TS. TRỊNH ĐĂNG MẬU

Đà Nẵng - năm 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc ai

công bố trong bất kì công trình nào khác.
Tác giả khóa luận

Phạm Thị Bích Luyến


ii


MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU......................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề......................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài...............................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...................................................... 3
3.1. Ý nghĩa khoa học................................................................................. 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn..................................................................................3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................... 4
1.1. Giới thiệu chung về tảo Spirulina.............................................................. 4
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm phân loại.....................................................4
1.1.2. Đặc điểm hình thái............................................................................4
1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái...........................................................6
1.1.4. Cách thức sinh trƣởng, sinh sản....................................................... 7
1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của tảo
Spirulina............................................................................................................9
1.3. Vai trò và ảnh hƣởng của các nguồn nitơ đến sinh trƣởng, phát triển của
Spirulina..........................................................................................................13
1.4. Các nghiên cứu về vi tảo Spirulina..........................................................16
1.4.1. Một số nghiên cứu trên giới............................................................16
1.4.2. Một số nghiên cứu trong nƣớc....................................................... 17

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU............................................................................... 19
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.............................................................................. 19


iv

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................ 43
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................ 45
PHỤ LỤC


v

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Bảng 2.1

K

và

nh
Bảng 3.1

Ả
độ

(O

Sp
Bảng 3.2

Ả

tr


Hình 3.3

Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6
Hình 3.7

Hình 3.8
Hình 3.9


vii

Hình 3.10 Cƣờng độ ánh sáng và nhiệt độ theo dõi trong suốt quá
trình nuôi cấy.

.


1

MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, nhu cầu

về chăm sóc sức khỏe của con ngƣời ngày càng đƣợc chú trọng. Con ngƣời
không ngừng tìm cách đa dạng hóa các sản phẩm, nâng cao chất lƣợng thực
phẩm theo hƣớng phát triển bền vững, thân thiện với môi trƣờng bằng việc

trị dinh dƣỡng cao phục vụ cho con ngƣời [10]. Tuy nhiên, để nuôi Spirulina
đạt đƣợc hiệu quả và chất lƣợng cao thì cần phải quan tâm, xem xét nhiều
yếu tố, trong đó yếu tố về dinh dƣỡng đƣợc xem là quan trọng nhất. Trong
một nghiên cứu đã chỉ ra rằng hơn 25% tổng năng suất của tảo Spirulina liên
quan đến môi trƣờng nuôi cấy, chúng đóng vai trò là nguồn cung cấp chất
dinh dƣỡng cho toàn bộ các quá trình sinh lý – hóa trong tế bào của tảo, đặc
biệt là nitơ [19]. Nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa là thành phần tham gia vào
các quá trình trao đổi chất và năng lƣợng trong tảo [19]. Trong nuôi trồng
Spirulina ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm nitơ vào môi trƣờng dƣới dạng
muối nitrate (NaNO3). Tuy nhiên NaNO3 có giá thành khá cao làm tăng chi
phí đầu tƣ nên ảnh hƣởng đến hiệu quả kinh tế trong nuôi tảo. Mặt khác theo
nhiều nhà khoa học trên thế giới thì Spirulina có khả năng hấp thụ đa dạng
các nguồn nitơ khác nhau [24], do vậy nghiên cứu thay thế muối NaNO 3 bằng
các hợp chất cung cấp nitơ khác đang là vấn đề đƣợc quan tâm hiện nay.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh
hƣởng của các nguồn nitơ khác nhau lên sự sinh trƣởng và năng suất của
vi

tảo Arthrospira platensis”.
Mục tiêu đề tài

2.
-

Xác định đƣợc nguồn nitơ thích hợp bổ sung vào môi trƣờng nuôi để

tảo Spirulina sinh trƣởng, phát triển và cho năng suất tốt nhất.
-

Xác định đƣợc nồng độ tối ƣu của nguồn nitơ cung cấp để tăng tốc độ

nƣớc mặn của Châu Phi, Trung và Nam Mỹ từ 3,6 tỷ năm trƣớc. Trong những
năm 60 của thế kỉ XX, Brandily – một nhà nhân chủng học ngƣời Pháp đã
phát hiện ra loài tảo này trong lần khảo sát sự đa dạng sinh học tại vùng hồ ở
Tchad, Châu Phi. Đến năm 1973, FDA và WHO/OMS đã chính thức công
nhận tảo Spirulina là nguồn dinh dƣỡng và dƣợc liệu quý cho con ngƣời và
đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu đến ngày nay [21].
Tảo Spirulina là các vi sinh vật có hình xoắn, sống trong nƣớc mà ta
thƣờng gọi là Tảo xoắn với tên khoa học là Spirulina platensis. Thực ra đây
không phải là một sinh vật thuộc ngành Tảo (Algae) vì Tảo thuộc giới sinh vật
nhân chuẩn (Eukaryotes) mà Spirulina thuộc ngành Vi khuẩn lam
(Cyanobactera), chúng thuộc giới sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy
(Prokaryotes). Những nghiên cứu mới nhất lại cho biết chúng cũng không
phải thuộc chi Spirulina mà lại thuộc chi Arthrospira [20].
Chính vì vậy, về phân loại khoa học, tảo Spirulina thuộc:
Giới (domain): Bacteria; ngành (phylum): Cyanobactera; lớp (class):
Chroobacteria; bộ (order): Oscillatoriales; họ (family): Phormidiaceae; chi
(genus): Arthrospira; loài (species): Arthrospira platensis (A. platensis).
1.1.2. Đặc điểm hình thái

Tảo Spirulina có màu xanh lục, quan sát dƣới kính hiển vi điện tử thấy
Spirulina có dạng xoắn lò xo, sợi tảo (trichome) có 5 – 7 vòng (có khi lên đến
27 vòng) đều nhau không phân nhánh, ở hai đầu sợi tảo thƣờng hẹp, mút lại.


5

Đƣờng kính vòng xoắn từ 35 – 50 µm, bƣớc xoắn 60 µm. Chiều dài thay đổi
có thể đạt đƣợc 0,25 mm, có khi lớn hơn [37]. Spirulina là loài có khả năng
vận động tiến về phía trƣớc hoặc phía sau. Sự vận động này đƣợc thực hiện
bởi các lông ở sƣờn bên cơ thể. Các sợi lông này có đƣờng kính 5 –7 nm và

mọi điều kiện về dinh dƣỡng và ánh sáng nhƣ nhau); vào mùa hè tốc độ sinh
trƣởng của dạng thẳng kém hơn dạng xoắn và nếu trong thành phần dinh
dƣỡng thiếu các nguyên tố vi lƣợng, hàm lƣợng NaHCO 3 thấp dẫn tới số
vòng xoắn giảm và đƣờng kính vòng xoắn tăng [43].
1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái

Tảo Spirulina phân bố rộng trong các môi trƣờng khác nhau nhƣ bãi
rong cỏ, các thủy vực nƣớc ngọt, lợ, mặn hay ngay cả ở suối nƣớc nóng. Tảo
lơ lửng ở độ sâu có thể tới 50 cm, và trong môi trƣờng nhân tạo thƣờng nuôi
ở mức nƣớc 10 –30 cm (nuôi hồ hở), hoặc có thể trong hồ đáy sâu 1 – 1,5 m
(sục khí). Trong môi trƣờng sống có độ kiềm cao, Spirulina nổi lên hoặc lặn
xuống ít nhất một lần trong suốt thời gian 24 giờ và sẽ thƣờng xuyên hơn nếu
nhƣ có gió nhẹ trên bề mặt hồ. Spirulina sống trong môi trƣờng kiềm tính,
pH thích hợp nằm trong khoảng 9 – 11, tối ƣu nhất là pH = 9,5. Ở điều kiện
này khó có loài nào có thể tồn tại đƣợc ngoài tảo Spirulina. Tảo Spirulina có
thể sống trong nhiệt độ nƣớc là 20 – 40 oC, thích hợp nhất là 35oC. Trong tự
nhiên Spirulina tập trung nhiều nhất là ở Trung Phi tại khu vực hồ Chad và
Niger, ở Đông Phi dọc theo thung lũng GreaRift [7].
Việc nuôi trồng Spirulina ở qui mô lớn trên thế giới bắt đầu tại Nhật
Bản vào năm 1960. Đến nay, Spirulina đã đƣợc sản xuất tại ít nhất 22 quốc
gia, trong đó có Việt Nam.
Ở

Việt Nam, Spirulina phân bố ở các thủy vực khác nhau nhƣ: sông,

ao, hồ, ruộng lúa… và đƣợc một số nơi nuôi trồng ở quy mô công nghiệp.
Công ty Vĩnh Hảo (Bình Thuận) và cơ sở Bình Chánh (TP. Hồ Chí Minh) là 2
trung tâm nuôi trồng tảo lớn nhất nƣớc ta [21].



nhanh và liên tục. Sinh trƣởng logarit là sinh trƣởng đồng đều, tức là các
thành phần tế bào đƣợc tổng hợp với tốc độ tƣơng đối ổn định. Tốc độ tăng
trƣởng trong giai đoạn này tùy thuộc vào kích thƣớc tế bào, cƣờng độ ánh
sáng và nhiệt độ và môi trƣờng dinh dƣỡng. Nếu cân bằng dinh dƣỡng hay
các điều kiện môi trƣờng thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trƣởng không đồng đều.
Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một
môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng sang một môi trƣờng giàu dinh dƣỡng hơn


8

hoặc ngƣợc lại thì cũng có kết quả về sự sinh trƣởng không đồng đều nhƣ
vậy.
+ Pha cân bằng (Stationary phase): khi có một vài nhân tố xuất hiện
nhƣ sự giảm sút của yếu tố dinh dƣỡng nào đó, tỷ lệ cung cấp oxy và
carbonic, sự thay đổi pH, sự hạn chế ánh sáng hay sự xuất hiện các yếu tố
ngăn cản sự phân chia các tế bào do một chất độc nào đó...thì quá trình sinh
trƣởng của tảo sẽ bị ức chế, đây là giai đoạn đầu của pha tăng trƣởng chậm.
Tuy nhiên, pha này diễn ra rất nhanh với sự cân bằng đƣợc tạo ra giữa tốc độ
tăng trƣởng và các nhân tố giới hạn, nó đƣợc xem là pha quân bình.
+ Pha suy vong (Death phase): khi các chất dinh dƣỡng trở nên cạn kiệt
không đủ cung cấp cho sự sinh trƣởng và trao đổi chất đến mức trở nên độc
hại, tảo sẽ bị suy tàn gọi là pha chết. Giống nhƣ giai đoạn logarit, sự tử vong
của quần thể vi sinh vật cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là
không đổi). Tổng số tế bào sống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bào
chết chƣa bị phân hủy. Ở giai đoạn này, tảo chết theo phƣơng thức logarit
nhƣng sau khi số lƣợng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế
bào chậm lại. Đó là do một số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt
mạnh. Vì điều này và những nguyên nhân khác làm cho đƣờng cong của giai
đoạn suy vong có thể khá phức tạp.

nhân tạo cần chú ý đến các yếu tố sau [43]:
+

Yếu tố ánh sáng [41]: Spirulina là vi sinh vật quang dƣỡng bắt buộc,

chúng không thể sống hoàn toàn không có ánh sáng vì vậy ánh sáng là điều
không thể thiếu giúp cho tảo quang hợp và phát triển. Sự tổng hợp các thành
phần của tế bào cũng bị ảnh hƣởng mạnh bởi cƣờng độ ánh sáng. Chính vì
vậy, cƣờng độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng là nhân tố quan trọng nhất ảnh
hƣởng đến sinh trƣởng của tảo Spirulina. Theo nghiên cứu thì tốc độ tăng
trƣởng nhanh nhất khi Spirulina đƣợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng đầy đủ,
tuy nhiên để đạt đƣợc chất lƣợng tốt nhất thì cƣờng độ ánh sáng phải vừa phải


10

để tránh ức chế sự phân chia tế bào. Ở điều kiện phòng thí nghiệm, khi nuôi
trong bình thuỷ tinh dung tích nhỏ, ánh sáng đƣợc xác định cho sự phát triển
của tảo Spirulina là 1000 – 3000 lux còn với bề nuôi lớn cƣờng độ ánh sáng
là 5000 – 100000 lux [2] [7] [19]. Tuy nhiên khi nuôi Spirulina ở giai đoạn
đầu nên để ở cƣờng độ ánh sáng thấp để tránh sự quang phân ly. Ngoài ra
hiệu quả hấp thụ cƣờng độ ánh sáng còn phụ thuộc vào mật độ nuôi cấy của
tảo, vì khi cƣờng độ ánh sáng cao mà mật độ tảo lớn thì mỗi sợi tảo vẫn nhận
đƣợc cƣờng độ ánh sáng nhỏ. Nhiều loại vi tảo có cƣờng độ quang hợp bão
hoà ở khoảng 33% tổng lƣợng cƣờng độ ánh sáng và Spirulina cũng nằm
trong số đó. Vì vậy trong điều kiện ánh sáng có cƣờng độ cao và thời gian
chiếu sáng dài, ngƣời ta thấy xuất hiện hiện tƣợng quang ức chế có thể làm
tảo chết hoặc làm giảm đáng kể năng suất nuôi trồng.
+



môi trƣờng nuôi cấy còn giúp Spirulina tránh đƣợc sự tạp nhiễm của các yếu
tố sinh học nhƣ loài tảo lục, động vật phù du hay các sinh vật lạ khác [6].
Ngoài các yếu tố về điều kiện nuôi cấy thì hàm lƣợng dinh dƣỡng là
yếu tố đƣợc coi là rất quan trọng cần chú ý trong quá trình nuôi cấy. Nhất là
đối với quá trình sinh trƣởng cũng nhƣ tích lũy các chất trong tảo. Môi
trƣờng dinh dƣỡng của Spirulina cần các dƣỡng chất: Cacbon, Nitơ, các chất
khoáng đa lƣợng và vi lƣợng…
+

Dinh dƣỡng Carbon: Spirulina đồng hóa carbon chủ yếu ở dạng vô

cơ, tốt nhất là bicarbonate (HCO3-) thông qua quá trình quang hợp. Nguồn
cacbon cung cấp cho Spirulina khoảng 1,2 – 16,8 g NaHCO3/lít [25].
+

Dinh dƣỡng Nitơ: Spirulina có khả năng đồng hóa nitơ theo phản ứng

khử nhờ enzyme nitrogenase xúc tác khi có ATP và kết quả là nitơ đƣợc tổng
hợp thành protein của chúng. Spirulina là loài có khả năng cố định đạm và
chuyển hóa nitơ tự do dạng khí thành amoniac, nitrit hay nitrat – là dạng mà tảo
có thể hấp thụ và chuyển hóa thành protein và các acid nucleic. Tuy nhiên
chúng chỉ có thể chuyển hóa khoảng 12 – 15 mg nitơ ở dạng phân tử trong không
-

khí, vậy nên chúng sử dụng nitơ bằng cách đồng hóa các dạng nitrit (NO 2 ),
nitrat (NO3-), amoni (NH3, (NH4)2SO4, NH4Cl, (NH2)2CO). Chính vì lý do này,
các nhà khoa học đã nghiên cứu bổ sung những nguồn này vào môi trƣờng nuôi
tảo Spirulina. Đặc biệt, khi sử dụng nguồn nitơ không từ nitrate


+

Ca2+: ion Ca2+ thƣờng kết hợp với ion CO 32-, HCO3-, SO42-, dạng

HCO3-, dễ chuyển hoá thành CaCO 3 và phóng thích CO2 cho quá trình quang
hợp của thực vật phù du trong nƣớc. Ca2+ làm cho nƣớc bớt chua, làm tăng
độ hoà tan, đồng hoá các chất dinh dƣỡng khác nhƣ nitơ, phospho giúp cho
+

Fe [9]: cung cấp dƣới dạng muối FeSO 4. Nồng độ Fe2+ bổ sung

khoảng 0,56 mg/lít môi trƣờng. Chlorophyl trong tảo không thể tạo thành
đƣợc nếu không có sắt.
+

Cl-: tảo Spirulina rất ƣa Clo vô cơ, nồng độ cung cấp từ muối NaCl

khoảng 1 – 1,5 g/lít.


13

1.3. VAI TRÒ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC NGUỒN NITƠ ĐẾN SINH
TRƢỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA SPIRULINA
Nitơ đóng vai trò vô cùng quan trọng đối với sự sinh trƣởng, phát triển
của tảo và do đó nó quyết định năng suất và chất lƣợng tảo sau thu hoạch.
nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa tham gia trong các quá trình trao đổi chất và
năng lƣợng trong tảo. nitơ là thành phần chính cấu tạo nên các chất: protein,
acid nucleic, các hợp chất dự trữ năng lƣợng (ADP, ATP, các chất điều hoà
sinh trƣởng…). Ngoài ra, nitơ trong tảo còn đƣợc dùng để cấu tạo nên các


nguồn nitơ vô cơ thành amoniac (NH3) là dạng mà tảo có thể hấp thụ hạn chế
sự tích lũy nitrate trong tảo. Quá trình chuyển hoá có sự tham gia của ATP,
Mo và Fe theo sơ đồ và các bƣớc:

Hình 1.1. Sự khử nitrat đồng hóa (Theo Prescott và cs, 2005)
Các bƣớc khử có sự tham gia của các enzim khử nitrogenase reductase
và ATP.
-

+

-

-

+

NO3 + NADPH + 2H +4e → NO2 + NAD(P) + H2O
-

+

-

NO2 + 6 Feredoxin khử + 7H + 6e → NH3 + 2H2O
-

+


 Amin

hoá trực tiếp các acid xêto tạo acid amin:
+

Acid kêto + NH4 → Acid amin.
 Chuyển

vị amin:

Acid amin + acid kêto → acid amin mới + acid kêto mới


16
 Hình

thành amit: liên kết phân tử NH3 với acid amin dicacboxilic
Acid amin đicacboxilic + NH4+ → amit

Các nguồn nitơ có thể dùng trong nuôi tảo Spirulina là các dạng nitrate
(NO3-), NH3, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, (NH2)2CO. Trong khi đó, sử dụng
nguồn nitơ không từ nitrate ở nồng độ cao, tảo không kịp chuyển hóa và hấp
thu amoniac nên có thể gây ra hiện tƣợng ngộ độc amoniac (NH 3) ở tảo, ảnh
hƣởng đến sự phát triển sinh khối của tảo, thậm chí có thể gây chết tảo. Sự
hình thành amit trong quá trình này có ý nghĩa sinh học quan trọng. Đó là
cách giải độc NH3 tốt nhất (NH3 tích luỹ lại sẽ gây độc cho tế bào) [32]. Là cơ
sở để bổ sung các nguồn nitơ khác dạng nitrat vào môi trƣờng để nuôi tảo.
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ VI TẢO SPIRULINA
1.4.1. Một số nghiên cứu trên giới


Đặc biệt tại Hàn Quốc vào năm 2003, nhóm nghiên cứu của A. Choi và
cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng quan về cả 4 nguồn amonium, nitrat,
nitrit và urê; sau 30 ngày nuôi nhận thấy nguồn amoni cung cấp vào môi
trƣờng làm tảo đạt sinh khối khô cao nhất (4,5g/l), trong khi đó môi trƣờng
chứa nitrat, nitrit và amoni thấp hơn, sinh khối đạt đƣợc lần lƣợt là 4,05g/l;
3g/l và 2,825g/l [15].
Không chỉ bó hẹp trong phòng thí nghiệm, M. Shahmen còn đƣa ra
ngoài thực nghiệm để khảo sát. Năm 2015, ông tiến hành nuôi tảo trong các
túi nhựa dƣới điều kiện thời tiết của Malaysia, sau 8 ngày nuôi sinh khối đạt
đƣợc cao nhất là 1,24g/l khi bổ sung Amoni Nitrat, cao hơn so với môi
trƣờng sử dụng Urê là 1,19g/l [40].
1.4.2. Một số nghiên cứu trong nƣớc

Việt Nam là nƣớc có điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, rất thuận lợi
cho sự phát triển của tảo Spirulina. Loài tảo này lần đầu tiên đƣợc biết đến ở
Việt Nam nhờ giáo sƣ Ripley D. Fox của hiệp hội chống suy dinh dƣỡng bằng
các sản phẩm từ tảo (ACMA) tại Pháp đƣa vào Việt Nam năm 1988. Từ đây,