VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
............... ***...............

Hoàng Đăng Sáng

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ĐỘT BIẾN CÓ
KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO BẰNG CHIẾU XẠ GAMMA KẾT
HỢP VỚI XỬ LÝ KHÁNG SINH
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. ĐỖ THỊ HUYỀN
ThS. TRẦN BĂNG DIỆP

LỜI CẢM ƠN
Hà Nội - 2018


Để hoàn thành nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, lời đầu tiên tôi xin
chân thành cảm ơn sâu sắc đến ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn khoa học, ngƣời thầy
đã chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu - ThS. Trần Băng Diệp
và ngƣời thầy cho tôi những ý kiến quí báu - TS. Đỗ Thị Huyền, các cô đã giúp tôi
trong quá trình hoàn thiện luận văn. Ngoài ra tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy,
Cô giảng dạy đã cho tôi nhiều kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm nghiên cứu quý báu.
Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.


DNA
EDTA
GLP – 1

: Adenosine triphosphate
: Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung
rifampicin nồng độ 0,2 µg/ml
: Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung
rifampicin nồng độ 2 µg/ml
: Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung
streptomycin nồng độ 20 µg/ml
: Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung
streptomycin nồng độ 200 µg/ml
: Deoxyribonucleic acid
: Ethylendiamin tetraacetic acid
: Glucagon – like peptide – 1

KS
MMP
MT
PCR
ppGpp

: Kháng sinh
: Matrix metallo protease
: Môi trƣờng
: Polymerase chain reaction
: Guanosine – 5‟diphosphate – 3‟diphosphat


1.1.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp ............................................................................. 8
1.1.4.2. Trong nghiên cứu và trị liệu............................................................................ 10
1.1.4.3. Trong nông nghiệp ............................................................................................ 11
1.2. BACILLUS SUBTILIS VÀ PROTEASE CỦA BACILLUS ................................................... 12
1.2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis.................................................................................12
1.2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ....................................................................... 12
1.2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên .................................... 12
1.2.1.3. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 12
1.2.1.4. Đặc điểm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy ................................................. 13
1.2.1.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử ....................................................................... 14
1.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp protease ở Bacillus subtilis ................15
1.2.2.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng....................................... 15
1.2.2.2. Ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp protease ...... 17
1.2.2.3. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy ............................................................ 18
1.3.

PHƢƠNG PHÁP TĂNG CƢỜNG SẢN XUẤT SẢN PHẨM THỨ CẤP

(PROTEASE) VÀ CÔNG NGHỆ RIBOSOME ............................................................................... 18
1.3.1. Công nghệ đáp ứng lại của VSV ............................................................................18
1.3.2. Công nghệ gen .........................................................................................................19


1.3.2.1. Phƣơng pháp gây đột biến ................................................................................ 19
1.3.2.2. Tái tổ hợp di truyền ........................................................................................... 20
1.3.3. Công nghệ trao đổi chất ..........................................................................................20
1.3.4. Công nghệ ribosome ................................................................................................21
1.4. TƢƠNG TÁC CỦA BỨC XẠ ION HÓA VỚI TẾ BÀO – ỨNG DỤNG BỨC XẠ
ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VI SINH VẬT ................................................... 24
1.4.1. Quá trình gây hiệu ứng sinh học của bức xạ ion hóa ..............................................24

2.2.7.1. Thiết kế mồi và xử lý số liệu ...............................................................................37
2.2.7.2. Khuếch đại trình tự gen rpoB và rpsL12 ......................................................... 38
2.2.7.3. Tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................................. 38
2.2.7.4. Phƣơng pháp điện di DNA ............................................................................... 38
2.2.7.5. Giải trình tự ........................................................................................................ 39
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................... 40
3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO
LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN................................................................................ 40
3.1.1. Tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có hoạt tính cao và ổn định .......40
3.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh protease của các chủng
Bacillus subtilis ........................................................................................................................ 42
3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG VK BACILLUS SUBTILIS VÀ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG .................................................... 44
3.2.1. Đánh giá quá trình sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis ...............44
3.2.2. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của các chủng
Bacillus subtilis ..................................................................................................................45
3.2.3. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh protease của các chủng
Bacillus subtilis ..................................................................................................................47
3.3. XỬ LÝ CHIẾU XẠ KẾT HỢP SỬ DỤNG KS GÂY ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƢỚNG TỚI
CÁC GEN MÃ CHO SẢN PHẨM LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
PROTEASE CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS......................................................................... 49
3.3.1.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng streptomycin ở các chủng
Bacillus subtilis ............................................................................................................... 50
3.3.1.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ các
chủng kháng xạ và kháng streptomycin ........................................................................ 51
3.3.2. Xử lý chiếu xạ kết hợp với rifampicin ..................................................................55


3.3.2.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng rifampicin ở các chủng
Bacillus subtilis ............................................................................................................... 55

Hình 1.6. Cơ chế tác động ppGpp làm tăng lƣợng sản phẩm thứ cấp của ribosome ..........21
Hình 1.7. Công nghệ ribosome. ................................................................................22
Hình 1.8. Cấu trúc tiểu phần β của RNAP ở Escherichia coli, Streptomyces
coelicolor, Bacillus subtilis, Mycobacterium leprae. ...............................................23
Hình 1.9. Tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa tới DNA ...................24
Hình 1.10. Các loại tổn thƣơng do tác động của bức xạ ion hóa trên DNA....................26
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thử hoạt tính protease ......................................................34
Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 09 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh
protease......................................................................................................................40
Hình 3.2. Vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease cao............41
Hình 3.3. Hoạt độ protease của các chủng Bacillus subtilis tuyển chọn ..................41
Hình 3.4. Kích thƣớc vòng phân giải casein bởi protese của các chủng Bacillus
subtilis tạo ra tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau .................................................42
Hình 3.5. Hoạt tính protease của các chủng Bacillus subtilis đƣợc kiểm tra ngay sau
khi thu và sau bảo quản 48 giờ ..................................................................................43
Hình 3.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis tiềm năng ........44
Hình 3.7. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng VK Bacillus subtilis sống sót trong dịch
nuôi cấy và liều chiếu xạ ...........................................................................................46


Hình 3.8. Tần số đột biến kháng streptomycin 20 µg/ml của 03 chủng Bacillus
subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau ..............................................50
Hình 3.9. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần và
của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 300
Gy ..............................................................................................................................53
Hình 3.10. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần
và của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 500
Gy ..............................................................................................................................54
Hinh 3.11. Tần số đột biến kháng rifampicim 0,2 µg/ml của 03 chủng Bacillus
subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau ..............................................55

Hình 3.26. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng
thuần H12 và chủng đột biến 19-H12 .........................................................................69


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Một số chủng VSV có khả năng tổng hợp protease cao ..............................7
Bảng 1.2. Phản ứng sinh hóa của VK Bacillus subtilis................................................13
Bảng 2.1. Các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào
...................................................................................................................................30
Bảng 2.2. Tỷ lệ các hóa chất cần pha cho xây dựng đƣờng chuẩn tyrosin ...............35
Bảng 2.3. Các bƣớc chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính ........................................35
Bảng 2.4. Trình tự nucleotide của các mồi dùng trong nghiên cứu ..........................37
Bảng 2.5. Thành phần và chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự hai gen rpoB và
rpsL từ DNA tổng số .................................................................................................38
Bảng 3.1. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 09 chủng Bacillus subtilis có khả
năng sinh protease .....................................................................................................40
Bảng 3.2. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease
...................................................................................................................................41
Bảng 3.3. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao của 3 chủng Bacillus subtilis tại các liều
chiếu xạ khác nhau ....................................................................................................48
Bảng 3.4. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 20 µg/ml có khả năng sinh
protease cao từ các chủng Bacillus subtilis B5 chiếu xạ...........................................52
Bảng 3.5. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 200 µg/ml có khả năng sinh
protease cao từ các chủng Bacillus subtilis B5 kháng xạ và kháng streptomycin 20
µg/ml .........................................................................................................................53
Bảng 3.6. Số lƣợng khuẩn lạc tiềm năng kháng rifampicin 0,2 µg/ml sinh protease
cao đƣợc sàng lọc từ các chủng Bacillus subtilis chiếu xạ .......................................56
Bảng 3.7. Các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease vƣợt trội .......59
Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ
(OD) ở bƣớc sóng 260 nm trên máy Nano Drop .........................................................60

Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt
tính của vi sinh vật (Awan, 2011).
Nhiều nghiên cứu cho thấy một số thể đột biến kháng kháng sinh ở vi sinh
vật có thể tăng cƣờng sản xuất sản phẩm thứ cấp nhƣ enzyme, sắc tố, kháng sinh
(Ochi, 2007; Wang và cs, 2008; Ochi và Hosaka, 2013) cũng nhƣ tăng khả năng
chịu hợp chất độc hại (Hosokawa và cs, 2002). Ở Bacillus subtilis, đột biến kháng
streptomycin làm tăng lƣợng sản phẩm enzyme α – amylase lên 20 – 30% và lƣợng
sản phẩm cũng tăng từ 1,5 đến 2 lần với thể đột biến kháng rifampicin (Kurosawa
và cs, 2006). Cơ chế phân tử liên quan đƣợc phân tích, đánh giá trong nhiều công
trình nghiên cứu cho thấy sự tác động này chủ yếu theo hai con đƣờng chính là gây
đột biến gen rpsL mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen rpoB mã
hóa cho tiểu phần β của RNAP (Lai và cs, 2002; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013;
1


Wang và cs, 2008). Đây cũng là cơ sở cho sự ra đời của công nghệ ribosome
(Ribosome Engineering), một kỹ thuật khá mới sử dụng khả năng kháng kháng sinh
làm gia tăng hoạt tính của các ribosome tham gia dịch mã tăng sinh tổng hợp
protein. Nhƣ vậy gen đích không hề bị cải biến nhƣng khả năng sinh tổng hợp sản
phẩm của gen đƣợc tăng lên nhờ các đột biến liên quan đến bộ máy tổng hợp
ribosome. Kỹ thuật này đã chứng minh đƣợc tính hiệu quả, có thể làm tăng khả
năng sinh tổng hợp lên hàng chục, thậm chí hàng trăm lần. Trong khi, theo báo cáo
của một số công ty công nghệ sinh học trên thế giới, đa số các chủng vi sinh vật tái
tổ hợp có năng suất cao hơn chủng tự nhiên không quá vài lần, một số ít trƣờng hợp
đạt đƣợc vài chục lần (Ochi và cs, 2013). Ngoài ra, một số sản phẩm dùng để sản
xuất thực phẩm hoặc dùng vào mục đích bảo quản thực phẩm chƣa cho phép sử
dụng các protein tái tổ hợp. Việc áp dụng công nghệ ribosome sẽ giúp khắc phục
những hạn chế này.
Rõ ràng, kỹ thuật sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng là tƣơng đối
đơn giản, hiệu quả và đặc biệt chi phí thấp so với công nghệ gen. Tuy nhiên, thời

có khả năng sinh protease.
+ 3.3: Xác định liều chiếu xạ và nồng độ kháng sinh thích hợp để thu đƣợc
dòng đột biến có khả năng tăng sinh tổng hợp protease cao.
Nội dung 4: Xác định đột biến trên các gen rpoB và rpsL ở các chủng vi sinh có
khả năng sinh protease cao hơn chủng gốc.

3


PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. PROTEASE
1.1.1. Giới thiệu chung
Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide giữa các amino acid của phân
tử protein tạo thành các amio acid đơn lẻ (Hình 1.1) ().
Protease đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ rất lâu trên thế giới, trong đó
protease tiêu hoá đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học
ngƣời Pháp, Reaumur đã bắt đầu nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày
và sau đó Schwann đã gọi chất này là pepsin. Năm 1857, Corvisart đã tách đƣợc
trypsin, loại protease thứ hai từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở
dạng chế phẩm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998).

Hình 1.1. Vị trí hoạt động và phân loại exopeptidase
().
1.1.2. Phân loại protease
Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase
(López-Otín, 2007).
* Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide,
exopeptidase đƣợc phân chia thành hai loại:
- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu amine tự do
của chuỗi polypeptide để giải phóng ra các amino acid đơn lẻ, các

protein thông qua các amino acid quan trọng trong trung tâm hoạt động
tạo ra các amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide (López-Otín, 2007).
- Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease đƣợc tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Phân biệt với
các enzyme khác, các metallo protease chỉ hoạt động khi liên kết với ion
kim loại, chủ yếu là kẽm nên còn có tên là zinc metallo protease. Số ít
protease khác thuộc nhóm này liên kết với coban thay vì kẽm khi tham
gia phản ứng xúc tác. Các metallo protease hoạt động ở vùng pH trung
tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA (Fox, 1991).
Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
Acidic protease: là các protease hoạt động ở pH 2–4; chúng có nhiều ở tế bào
động vật, nấm men, nhƣng ít thấy ở vi khuẩn (Fox, 1991).
5


Protease trung tính là các protease hoạt động ở pH 7–8 nhƣ papain từ đu
đủ, bromelain từ dứa, và hầu hết protease có nguồn gốc động vật.
Protease kiềm là các protease hoạt động ở pH 9–11 nhƣ alkaline
protease, serine protease, protease đƣợc sản xuất bởi Bacillus sp. (López-Otín,
2007).
1.1.3. Nguồn thu protease
Protease là loại enzyme phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng, từ động
vật, thực vật, tới vi sinh vật.
Ở động vật, protease thƣờng có ở hệ tiêu hóa nhƣ tuyến tụy, niêm mạc dạ
dày, niêm mạc ruột non (Shafee và cs, 2005). Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch
vị của động vật có vú, chim, bò sát, cá… đƣợc sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa.
Rennin ở ngăn thứ tƣ của dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi có khả năng làm đông
tụ sữa, đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat.
Ở thực vật, protease có thể có ở các thành phần thân, lá và đặc biệt trong
quả. Papain thu đƣợc từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ; bromelain thu từ quả, chồi


Có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hƣớng có lợi
(định hƣớng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).

-

Giá thành enzym vi sinh vật không cao nhờ môi trƣờng nuôi cấy tƣơng đối
rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất.
Cho đến nay, số lƣợng enzyme đƣợc sản xuất hàng năm ở các nƣớc phát triển

(chủ yếu là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản) vào khoảng 300.000 tấn, trong đó có 600 tấn
protease tinh khiết đƣợc sản xuất từ vi sinh vật, bao gồm khoảng 500 tấn từ vi
khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc (Veloorvalappil và cs, 2003). Các kỹ thuật sinh học
phân tử hiện đại cho phép sản xuất protease cố định trên các chất mang không tan,
và điều đó giúp enzyme có thể đƣợc tái sử dụng dễ dàng.
Bảng 1.1. Một số chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease cao
(Veloorvalappil và cs, 2003)
Nấm

VK

Aspergillus candidus

Alteromonas

A. flavus

Arthrobacterprotophormiae

B. alcalophilus subsp.


Microbacterium sp.

B. firmus

Cephalosporium

Bacillus spp.
sp. B. alcalophilus

sp. Nocardiopsisdassonvillei

var. B. circulans

B. intermedius

Chrysosporiumkeratinop Oerskoviaxanthineolytica

B. lentus

hilum

Pimelobacter sp.

B. licheniformis

Conidioboluscoronatus

Pseudomonas aeruginosa



Streptomyces sp.

B.

Tritirachium

album Streptomyces microflavus

subtilis

amylosacchariticus

Limber

Streptomyces moderatus

Bacillus sp.

Rhizopusoligosporus

Streptomyces rectus

B. stearothermophilus

Streptomyces

rectus

var.



Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam nhiều nghiên cứu ứng dụng
enzyme protease từ Bacillus subtilis trong quy trình sản xuất nƣớc chấm giúp rút
ngắn thời gian chế biến, tăng hàm lƣợng đạm và hƣơng vị cho sản phẩm (Ichishima
và cs, 1983).
 Công nghiệp thuộc da và công nghiệp dệt
Chế biến da bao gồm một số công đoạn nhƣ ngâm ƣớt, tẩy lông, làm mềm và
thuộc da (Lê Ngọc Tú và cs, 1998). Quá trình thuộc da thƣờng dùng các hóa chất
độc hại nhƣ Na2SO3, nên đòi hỏi chi phí cao để xử lý nƣớc thải. Việc sử dụng
enzyme thay thế hóa chất đã thành công trong việc nâng cao chất lƣợng da, giảm ô
nhiễm môi trƣờng. Protease có khả năng làm mềm da nhờ thủy phân một phần
protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm da bị cứng. Kết quả, loại
bỏ các chất nhớt, tăng độ mềm dẻo cho da; những tính chất đó đƣợc hoàn thiện hơn
sau khi thuộc da. Trƣớc đây, để làm mềm da ngƣời ta dùng protease đƣợc phân lập
từ cơ quan tiêu hóa của động vật (Lê Ngọc Tú và cs, 1998). Hiện nay, việc đƣa các
protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (Aspergillus
oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả
và dần chiếm một vị trí quan trọng (Ogino và cs, 2007).
Protease đƣợc sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo
đƣợc tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) làm cho sợi đƣợc bóng, dễ nhuộm.
Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serine; lớp này gây dính bết các sợi tơ
tự nhiên, nhờ đó làm bong và tách rời các sợi tơ, giảm lƣợng hoá chất để tẩy trắng
(Phạm Thị Trân Châu và cs, 2006).
 Công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại
chất tẩy rửa nhƣ: chất làm sạch kính, răng giả, kem đánh răng và nhiều nhất trong
bột giặt. Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn đƣợc sản xuất vào năm
1956 với tên BIO – 40 đƣợc thu nhận từ B. subtilis (Rao và cs, 1998). Đến năm
1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dƣới tên thƣơng mại là BIOTEX


trị

HIV

Protease cũng đóng vai trò quan trọng trong bệnh ung thƣ. Các cystein
protease và metallo protease kích thích quá trình di căn bằng cách phân cắt các
protein ngoại bào xung quan khối u (Hình 1.2) (Freije và cs, 2011). Ngƣợc lại,
chính protease cũng đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ khi chúng kích hoạt các
quá trình apoptosis (chết theo chƣơng trình) (Freije và cs, 2011). Chất ức chế
proteasome Velcade đƣợc chấp nhận trong điều trị ung thƣ máu từ năm 2003
( />Các serine – protease – dipeptidyl – peptidase – amin 4 (DPP4) là protease
tham gia vào quá trình điều hòa glucose và là đích trong điều trị bệnh tiểu đƣờng.
10


GLP – 1, hormone ruột là tín hiệu quan trọng cho sự giải phóng insulin. Protease
DPP4 bất hoạt GLP – 1, do đó làm giảm bài tiết insulin và tăng nồng độ đƣờng
trong máu. Các chất ức chế DPP4 đầu tiên đƣợc sử dụng trong bệnh tiểu đƣờng là
Sitagliptin (Merk) đƣợc chấp nhận bởi FDA Hoa Kỳ vào năm 2006
( />USD (Tỷ)

Hình 1.3. Thị phần sử dụng proteinase trong nghiên cứu - trị liệu.
(Protein Hydrolysis Enzymes Market - Global Trends & Forecasts to 2019, 2014)
Ngoài ra, protease đƣợc sử dụng nhiều trong điều trị các bệnh về tim mạch,
nhiễm trùng máu, rối loạn tiêu hóa, vẩy nến, xơ nang…………………………..…
( />1.1.4.3. Trong nông nghiệp
Nông nghiệp tuy không phải là mục tiêu hàng đầu của công nghệ sinh học ở
nhiều nƣớc công nghiệp phát triển trên thế giới, nhƣng trên thực tế những hoạt động
nghiên cứu, sản xuất và thƣơng mại hóa các sản phẩm công nghệ sinh học trong

Họ (Family)

: Bacillaceae

Giống (Genus)

: Bacillus

1.2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn B. subtilis có mặt trong hầu hết các môi trƣờng tự nhiên, phần lớn
cƣ trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên đƣợc gọi là “trực khuẩn cỏ khô”. Thông
thƣờng đất trồng có khoảng 106 - 107 CFU/g. Đất nghèo dinh dƣỡng nhƣ vùng sa
mạc thì vi khuẩn này gần nhƣ không hiện diện. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong
các nguyên liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột mì B. subtilis chiếm 75 - 79% vi
khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm nhƣ mắm, tƣơng, chao...
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon
trong khi một số loài khác nhƣ B. sphaericus, B. cereus cần các hợp chất hữu cơ là
vitamin và amino acid cho sự sinh trƣởng. Đặc biệt các loài nhƣ B. popilliae, B.
lentimobus có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi
trƣờng nuôi cấy thông thƣờng nhƣ nutrient agar (NA) hay nutrient broth (NB).
1.2.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram (+) nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím, kích
thƣớc 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn.

12