TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 9524:2012
EN 14133:2009
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG RƯỢU VANG VÀ BIA - PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM
Foodstuffs - Determination of ochratoxin A in wine and beer - HPLC method with immunoaffinity column
clean-up
Lời nói đầu
TCVN 9524:2012 hoàn toàn tương đương với EN 14133:2009;
TCVN 9524:2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu
biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG RƯỢU VANG VÀ BIA - PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM
Foodstuffs - Determination of ochratoxin A in wine and beer - HPLC method with immunoaffinity
column clean-up
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng ochratoxin A trong rượu vang và bia sử dụng
sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm, xem [2] và [3].
Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo Hướng
dẫn của AOAC [4] về các thủ tục nghiên cứu cộng tác để đánh giá xác nhận phương pháp phân tích hàm
lượng ochratoxin A trong rượu vang và bia qua việc phân tích các mẫu nhiễm tự nhiên và các mẫu rượu
vang và bia thêm chuẩn ở các mức khác nhau trong dải từ 0,1 ng/ml đến 3 ng/ml.
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp
dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương
pháp thử.
3. Nguyên tắc
Mẫu rượu vang và bia được pha loãng bằng dung dịch chứa polyetylen glycol (PEG) và natri hydro
cacbonat, sau đó được lọc và làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm. Ochratoxin A được rửa giải bằng

4.12 Toluen
4.13 Hỗn hợp dung môi của toluen và axit axetic băng
Trộn 99 phần thể tích toluen (4.12) với 1 phần thể tích axit axetic băng (4.8).
4.14 Dung dịch gốc ochratoxin A
Hòa tan 1 mg ochratoxin A (dạng tinh thể) hoặc lượng chứa trong 1 ampoule (nếu ochratoxin A ở dạng
màng mỏng) trong hỗn hợp dung môi (4.13) để thu được dung dịch chứa khoảng từ 20 g/ml đến 30
g/ml ochratoxin A. Để xác định nồng độ chính xác, ghi lại đường hấp thụ giữa các bước sóng từ 300 nm
đến 370 nm với các khoảng 5 nm trong cuvet thạch anh 1 cm (5.10) và sử dụng hỗn hợp dung môi (4.13)
để so sánh. Xác định bước sóng có độ hấp thụ tối đa và tính nồng độ khối lượng của ochratoxin A, OTA,
bằng microgram trên mililit, theo Công thức (1):
ota

=

A max M 100
b

(1)

Trong đó:
Amax là độ hấp thụ tối đa xác định được trên đường hấp thụ (trong trường hợp này là ở 333 nm);
M là khối lượng mol của ochratoxin A (M = 403,8 g/mol);
là hệ số hấp thụ mol của ochratoxin A trong hỗn hợp dung môi (4.13) (trong trường hợp này là 544
m2/mol);
b là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng centimet (cm).
Dung dịch này khi được bảo quản ở - 18 oC có thể bền được 4 năm.
4.15 Dung dịch chuẩn ochratoxin A
Pha loãng dung dịch gốc (4.14) bằng hỗn hợp dung môi (4.13) để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ
khối lượng của ochratoxin A là 2 g/ml. Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4 oC và
kiểm tra tính ổn định của dung dịch.

2 000

Thể tích dung dịch OTA 100 ng/ml,
l

30

100

300

1 000

2 000

3 000

Nồng độ khối lượng OTA, ng/ml

0,6

2,0

6,0

20

40

60

5.3 Bình định mức, dung tích 5 ml và 10 ml.
5.4 Ống chân không, dùng cho cột ái lực miễn nhiễm.
5.5 Bình chứa và các phụ kiện thích hợp với cột ái lực miễn nhiễm.
5.6 Bộ lọc sợi thủy tinh, cỡ lỗ 1,6 m, (ví dụ: loại Whatman GF/A1) hoặc tương đương).
5.7 Bộ làm bay hơi dung môi.
5.8 Xyranh microlit đã hiệu chuẩn hoặc pipet microlit đã hiệu chuẩn.
5.9 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, gồm có:
5.9.1 Hệ thống bơm, van bơm dạng xyranh có vòng bơm 100 l hoặc loại tương đương.
5.9.2 Bơm dùng cho HPLC, đẳng dòng, có thể duy trì được tốc độ dòng thể tích 1,0 ml/min.

1)

Whatman là tên thương mại của sản phẩm phù hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện
cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm
tương tự nếu cho kết quả tương đương.


5.9.3 Cột phân tích pha đảo, ví dụ như thép không gỉ (dài 150 mm, đường kính trong 4,6 mm) được
nhồi bằng vật liệu pha đảo C18, cỡ hạt 5 m, trước cột có cột bảo vệ pha đảo thích hợp hoặc bộ lọc bảo
vệ (cỡ lỗ 0,5 m). Có thể sử dụng cột có kích thước khác nếu cột đáp ứng được độ phân giải đường nền
của pic ochratoxin A ra khỏi các pic khác.
5.9.4 Detector huỳnh quang, được trang bị cuvet dòng chảy và được cài đặt bước sóng kích thích ở
333 nm và bước sóng phát xạ ở 460 nm. Detector này phải phát hiện được ochratoxin A ở nồng độ nhỏ
nhất là 0,02 ng.
5.9.5 Hệ thống dữ liệu
5.10 Máy đo phổ UV, có các cuvet thạch anh thích hợp.
6. Cách tiến hành
6.1 Chuẩn bị mẫu
Khử khí rượu vang nổ và bia trước khi pha loãng. Rót 10 ml rượu vang (hoặc bia) vào bình nón dung tích
100 ml có thể đậy kín. Thêm 10 ml dung dịch pha loãng (4.9) và trộn kỹ. Lọc qua bộ lọc sợi thủy tinh (5.6)

lưu của pic chất chuẩn trên sắc phổ.


Đôi khi có thể cần phải nhận biết pic bằng cách bơm đồng thời dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.
7.4 Xác định
Tiến hành xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic
và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đối với chất chuẩn có diện tích hoặc chiều cao pic gần
nhất, hoặc sử dụng đường chuẩn. Khi sử dụng đường chuẩn, có thể chuẩn bị thêm các dung dịch bổ
sung với các nồng độ nằm trong dải tuyến tính.
Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn.
Nếu độ đáp ứng ochratoxin A của mẫu thử nằm ngoài dải hiệu chuẩn, thì điều chỉnh lượng mẫu bơm vào
bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử.
8. Tính kết quả
Đọc từ đường chuẩn khối lượng ochratoxin A trong phần dung dịch mẫu thử được bơm vào cột HPLC,
tính bằng nanogam.
Tính nồng độ khối lượng ochratoxin A,
OTA

=

2 mOTA V3
V1 V2

OTA

, bằng nanogram trên mililit, theo Công thức (2):

(2)

Trong đó:

x = 1,764 ng/ml

r = 0,420 ng/ml

có thêm chuẩn

x = 0,283 ng/ml

r = 0,084 ng/ml

nhiễm tự nhiên

r = 0,028 ng/ml

có thêm chuẩn

Các giá trị đối với rượu vang đỏ là:

x = 0,186 ng/ml


x = 0,813 ng/m

r = 0,224 ng/ml

có thêm chuẩn

x = 2,530 ng/ml

r = 0,616 ng/ml


nhiễm tự nhiên

Các giá trị đối với bia là:

9.3 Độ tái lập
Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau
được báo cáo từ hai phòng thử nghiệm, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn
tái lập R.
Các giá trị đối với rượu vang trắng là:

x = 0,105 ng/ml

R = 0,056 ng/ml

có thêm chuẩn

x = 0,998 ng/m

R = 0,364 ng/ml

có thêm chuẩn

x = 1,764 ng/ml

R = 0,644 ng/ml

có thêm chuẩn

x = 0,283 ng/ml


R = 0,112 ng/ml

có thêm chuẩn

x = 0,696 ng/m

R = 0,364 ng/ml

có thêm chuẩn

x = 1,403 ng/ml

R = 0,588 ng/ml

có thêm chuẩn

x = 0,070 ng/ml

R = 0,056 ng/ml

nhiễm tự nhiên

Các giá trị đối với rượu vang đỏ là:

Các giá trị đối với bia là:

10. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử (kiểu loại mẫu, nguồn gốc mẫu, tên gọi);


2,000

1999

1999

1999

1999

1999

Số lượng phòng thử nghiệm

16

16

16

16

16

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ
ngoại lệ

14a


0,105

0,998

1,764

0,283

Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, ng/ml

-

0,01

0,07

0,15

0,03

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %

-

7,9

6,6

8,4


15,9

13,3

13,1

14,6

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x sR), ng/ml

-

0,056

0,364

0,644

0,112

Độ thu hồi, %

-

105,4

90,7

88,2


3,000

1999

1999

1999

Mẫu
nhiễm tự
nhiênb
1999


Số lượng phòng thử nghiệm

15

15

15

15

15

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ
ngoại lệ

14a


0,186

0,813

2,530

1,690

Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, ng/ml

-

0,01

0,08

0,22

0,18

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr,%

-

6,5

9,9

8,9


11,9

12,5

13,6

13,6

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x sR), ng/ml

-

0,056

0,280

0,980

0,644

Độ thu hồi, %

-

93,1

90,3

84,3

1,500

1999

1999

1999

1999

1999

Số lượng phòng thử nghiệm

15

15

15

15

15

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ
ngoại lệ

14a

13a


0,696

1,403

0,070

Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, ng/ml

-

0,02

0,05

0,07

0,01

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr,%

-

10,6

7,2

4,7

16,5


18,3

15,2

26,1

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x sR), ng/ml

-

0,112

0,364

0,588

0,056

Độ thu hồi, %

-

95,0

87,0

93,6

-