Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019
Tác giả luận văn

Nguyễn Phương Nga


LỜI CẢM ƠN

Để luận văn này đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp
đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng
đồng nghiệp và bạn bè.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đào Việt Hà và TS.
Phạm Đức Thịnh đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi chân thành cảm ơn đề tài Nghiên cứu độc tố của một số loài cá rạn
và thân mềm có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam (mã số:
KHCBBI.02/18-20) của Viện Hải dương học đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực
hiện Luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa Học, Học viện
Khoa học và Công nghệ, Phòng Quản lý Tổng hợp đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.
Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của
Lãnh đạo Viện Hải dương học cũng như các anh chị em trong phòng Hóa
sinh trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân
và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học

CTX

: Ciguatoxin

CTXs

: Ciguatoxins

DW

: Distilled water

đvdt

: Đơn vị diện tích

ESI

: Electrospray ionization

EI

: Electron ionization

FAB

: Fast-atom bombardment

HR-FABMS



LC

: Liquid Chromatography

LOD

: Limit of Detection


LOQ

: Limit of Quantitation

MeOH

: Metanol

MeCN

: Acetonitrile

MRM

: Multi Reaction Monitoring

MS

: Mass spectrometry


: Temperature


Danh mục các bảng

Bảng 1.1. Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng phân tích bằng
sắc ký khối phổ………………………………………………...……………17
Bảng 2.1. Định danh và ký hiệu mẫu..............................................................25
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện chiết rút đối với dịch chiết........…..36
Bảng 3.2. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là
Agillent……………..………………………………………………….……41
Bảng 3.3. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là
Wakosil………………………………………………………………………43
Bảng 3.4. Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Agilent Poroshell 120 ECC18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi)……………………………...45
Bảng 3.5. Hàm lượng CTXs trong các mẫu Chình biển ở Việt Nam và Nhật
Bản………………………………………………………………………...…48
Bảng 3.6. Kết quả so sánh phương sai các mẫu cơ tại Việt Nam và Nhật
Bản…………………………………………………………………………...50
Bảng 3.7. Kết quả so sánh phương sai các mẫu gan tại Việt Nam và Nhật
Bản…………………………………………………………………………...50
Bảng 3.8. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu cơ tại Việt Nam và Nhật
Bản………………………………………………………………………….. 51
Bảng 3.9. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu gan tại Việt Nam và
Nhật Bản……………………………...………………………………. …….52


Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus…………...……….10
Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1) và Caribbean (C-CTX-1)

1.2.1. Bản chất, cấu trúc hoá học ......................................................... 9
1.2.2. Cơ chế hoạt động ...................................................................... 11
1.2.3. Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học ............................................ 11
1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ
..................................................................................................................... 12
1.3.1. Nguyên lý hoạt động ................................................................. 13
1.3.2. Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ ................................. 16
1.3.3. Ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố Ciguatoxins
..................................................................................................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 25
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .................. 25
2.2.1. Nguyên liệu, thiết bị .................................................................. 25
2.2.1.1. Dung môi, hóa chất........................................................... 25
2.2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích ............................................... 26


2
2.2.2. Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ cơ và gan của Chình
biển .............................................................................................................. 27
2.2.3. Xác định độc tố CTXs bằng phương pháp LC/MS-MS .......... 32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 36
3.1. KẾT QUẢ CHİẾT RÚT VÀ TİNH SẠCH ĐỘC TỐ CTXS TỪ MỘT
SỐ BỘ PHẬN CỦA CHÌNH BİỂN (CƠ, GAN) ....................................... 36
3.2. THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ CTXS TRONG CƠ,
GAN, CHÌNH BİỂN ................................................................................... 37
3.3. QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS.................................................................... 46
3.4. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI
CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN).................. 48

năm đều ghi nhận được rải rác các vụ ngộ độc nghi ngờ CFP, xảy ra chủ yếu
ở các vùng ven biển Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận,…
Năm 2012, hội thảo ATTP của EU đã báo cáo ghi nhận độc tố nghi ngờ
CTXs trong cá Hồng nguồn gốc Việt Nam. Đến tháng 5/2017, EU chính thức
cảnh báo về ATTP đối với mặt hàng cá Hồng xuất khẩu của Việt Nam.


4
Dù được rất nhiều sự quan tâm, hướng nghiên cứu về độc tố CTXs của
thế giới vấp phải trở ngại lớn về phương pháp cũng như nguồn chất chuẩn rất
quý hiếm. CTXs là những hợp chất polyete tan trong các dung môi hữu cơ,
bền nhiệt (nhiệt độ cao và đóng băng) và bền pH (axit hay kiềm), không nhạy
với ánh sáng tia cực tím, nên không thể phân biệt bằng trực quan. Gần đây,
nhóm nhà khoa học Nhật Bản đã công bố về kết quả phát triển phương pháp
mới phân tích độc tố CTXs trong mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏng
khối phổ kép (LC/MS-MS).
Tuy nhiên đến nay vẫn chưa có công bố về công trình nghiên cứu độc
tố này tại Đông Nam Á, gây khó khăn trong việc giám sát và cảnh báo vấn đề
ATTP. Hơn nữa, quá trình nghiên cứu CFP tại Việt Nam gặp nhiều khó khăn
như về đặc tính sinh học loài, nguồn gốc, cơ chế tích lũy và lan truyền độc tố
trong chuỗi thức ăn biển rất phức tạp, đặc biệt là chưa có phương pháp phân
tích phù hợp do thiếu trang thiết bị phân tích hiện đại chuyên sâu và chưa tiếp
cận, cập nhật phương pháp phân tích của thế giới.
Hiện nay, Viện Hải dương học đã xây dựng được quy trình phân tích
độc tố trong cá Hồng nhưng chưa có quy trình phân tích đối với loài Chình
biển, vì vậy, học viên chọn đề tài luận văn “Xây dựng quy trình thực nghiệm
phân tích độc tố Ciguatoxins trong Chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng
đầu dò khối phổ kép (LC/MS-MS)”. Nội dung phân tích độc tố CTXs trong
đề tài này sẽ sử dụng quy trình phân tích độc tố CTXs cập nhật mới nhất của
Nhật Bản. Tuy nhiên, quy trình thực nghiệm trên cần được hiệu chỉnh phù

LC/MS-MS.
- Đánh giá kết quả của quy trình thực nghiệm trên cơ sở so sánh, đối chiếu với
kết quả kiểm chứng tại PTN của Nhật Bản.
5. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu
Trên cơ sở vận dụng những tiến bộ khoa học - kỹ thuật và công nghệ
mới của thế giới, đây là hướng nghiên cứu mới, tiên phong tại Việt Nam. Mặt
khác, kết quả của đề tài là dẫn liệu khoa học tin cậy phục vụ an toàn thực
phẩm biển, và là tiền đề cần thiết để có những công trình công bố quốc tế về
độc tố CTX trong sinh vật biển tại Việt Nam.


6
7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu
Trước những năm 2010, kỹ thuật sắc ký lỏng đầu dò khối phổ đơn
(single LC/MS) sử dụng chế độ quét ion chọn lọc (SIM) được áp dụng để phát
hiện độc tố này. Sau đó, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, sắc ký
lỏng khối phổ sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (Electrospray
ionization – ESI) được ứng dụng để định lượng độc tố CTXs với nguyên lý
chọn lọc phân tử được proton hóa [M+NH4]+ hoặc [M+H]+ để cắt các phân tử
nước trong bộ lọc khối tứ cực thứ 2 (Q2) của chế độ ghi phổ nhiều ion chọn
lọc (Multi Reaction Monitoring, MRM). Tuy nhiên, các ion sau khi mất đi
phân tử nước lại không đủ độ nhạy để phát hiện được ở nồng độ tương đương
0,01 ppb CTX-1B (giới hạn ATTP của US FDA). Khắc phục nhược điểm này,
nhóm nghiên cứu của Yogi đã phát triển thành công phương pháp sử dụng
LC/MS-MS với chế độ SIM và MRM có độ nhạy cao hơn, sử dụng cách bắt
cặp phân tử CTX với một số ion dương hoặc âm (H+, Na+, K+, NH4-, SO42-,
OH-…). Phương pháp này được đánh giá có ưu thế về độ nhạy và tính ứng
dụng trong phân tích định lượng độc tố CTXs, mặc dù đầu dò khối phổ độ
phân giải cao (HRMS) ghép nối với hệ sắc ký đã được chứng minh được khả
năng phát hiện các đồng phân của độc tố CTXs trong điều kiện thiếu vắng

“Ciguatera” là một hội chứng lâm sàng với chuẩn đoán chủ yếu vẫn
dựa trên tiền sử tiêu thụ cá rạn san hô và biểu hiện lâm sàng được xác định
bởi cả triệu chứng tiêu hóa và thần kinh [2].
Sự khác biệt về địa lý cũng sẽ gây ra sự khác biệt về triệu chứng của
các bệnh nhân.
Khởi phát của triệu chứng CFP thường bắt đầu bằng các vấn đề của
đường tiêu hóa như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau bụng trong vòng 12 giờ
sau khi ăn phải cá có độc tố. Các triệu chứng thường thuyên giảm trong vòng
24 giờ [2]. Các vấn đề về tim mạch cũng có thể xuất hiện trong suốt giai đoạn
cấp tính này, thường là nhịp tim chậm và hạ huyết áp.
Từ vài giờ đến hai tuần sau khi ngộ độc cá ciguatera, những vấn đề về
thần kinh như đau đầu, đau cơ, dị cảm (tê và ngứa ran ở vùng ngoại vi và tứ
chi), rối loạn cảm giác nhiệt độ (sự đảo ngược cảm giác nhiệt độ với các vật


8
thể lạnh sẽ cảm thấy nóng và ngược lại),… có thể xuất hiện [2]. Các triệu
chứng thần kinh chủ quan khác được báo cáo như vị kim loại, ngứa, đau khớp
và đau cơ (đau cơ đặc biệt là ở chân) và cảm giác răng lung lay [2]. Có thể
xuất hiện triệu chứng chấn động não đến 10 ngày sau khi bị ngộ độc. Đau đầu
nhiều vị trí, đau dữ dội và kéo dài cũng là biểu hiện khi ngộ độc ciguatera.
Những triệu chứng liên quan đến hệ thần kinh trung ương (tê liệt, mất điều
hòa, choáng váng và nhầm lẫn) thường là dấu hiệu của các trường hợp
nghiêm trọng nhất. Một loạt các triệu chứng rối loạn thần kinh đã được báo
cáo sau khi ngộ độc ciguatera bao gồm mệt mỏi, lo lắng, trầm cảm, hysteria,
rối loạn trí nhớ, thiếu hiệu quả về tinh thần.
Vấn đề tiêu hóa cấp tính thường giải quyết trong vòng 1 hoặc 2 ngày
và các rối loạn tim mạch đảo ngược trong vòng 48 – 72 giờ. Sự phục hồi từ
các triệu chứng thần kinh là lâu hơn và ít dự đoán hơn, từ 1 tuần đến 6 tháng.
Ngứa, đau khớp và mệt mỏi có thể kéo dài trong nhiều tháng hoặc

phân lập từ vùng biển Pacific (P-CTX) được xác định các đặc trưng cấu trúc
trước các CTX phân lập từ Caribbean (C-CTX). 02 dạng này có sự khác biệt
tương đối cả về cấu trúc phân tử và độc tính [2]. P-CTX được Scheuer và cs.
phân lập đầu tiên từ cá Chình năm 1967. Một thập kỉ sau, Yasumoto và
cs.,1977 đã phát hiện ra nguồn gốc của CTX ở quần đảo Gambier và đặt tên
cho sinh vật sản sinh độc tố là Gambierdiscus toxicus [2].
Cấu trúc chính của P-CTX phân lập từ cá Chình được mô tả hoàn chỉnh
năm 1989 [2] và được gọi là Gambiertoxin 4B hoặc P-CTX-4B (Hình 1.1).


10
P-CTX 4B

P-CTX-3C

51-Hydroxy P-CTX-3C

Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus [2]


11
P-CTX-1: R1 = CH2OHCHOH; R2 = OH

C-CTX-1

Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1)
và Caribbean (C-CTX-1) ciguatoxin [2]
1.2.2. Cơ chế hoạt động
Do có thể hòa tan trong chất béo, nên khi hấp thu vào máu đến các tế
bào, CTXs sẽ tấn công vào màng tế bào, khử cực màng tế bào, mở cực màng

1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ
Hiện nay sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC-MS được sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, môi trường, thực phẩm, vật liệu công
nghiệp và một số mảng khác.


13
1.3.1. Nguyên lý hoạt động
Nhìn chung, sắc ký lỏng LC cho phép tách các thành phần khác nhau
trong cùng một mẫu dựa vào sự khác biệt về tính ái lực (lực lưu giữ chất) đối
với pha tĩnh của cột và với pha động, và tùy thuộc vào tính chất của từng
thành phần mà phát hiện chúng bởi đầu dò UV, huỳnh quang, độ dẫn điện...
Bằng cách sử dụng những đầu dò này, việc tiến hành phân tích định tính các
hợp chất chủ yếu dựa trên thời gian lưu, phân tích định lượng dựa vào chiều
cao và diện tích đỉnh. Phương pháp sắc ký có thể cho phép phân tách xuất sắc
các chất; tuy nhiên, việc định danh và định lượng một cách đáng tin cậy sẽ
gặp khó khăn trong trường hợp có nhiều thành phần rửa giải cùng lúc từ cột
sắc ký cũng như khi phải tiến hành phân tích đồng thời tất cả các chất có mặt
trong mẫu.
Mặt khác, khối phổ MS là phương pháp phát hiện có độ nhạy cao; đầu
tiên các loại chất phân tích được ion hóa bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, sau
đó trong chân không các ion phát sinh này được phân loại dựa trên cơ sở tỉ lệ
khối lượng trên điện tích của mỗi ion (tỉ lệ m/z) và sau cùng tiến hành đo
cường độ của chúng. Phổ khối lượng thu được cho thấy một mức độ xuất hiện
các ion sao cho mỗi ion đi kèm với một số khối, do đó, MS hỗ trợ rất lớn
trong việc phân tích định lượng. Số khối thu được trực tiếp từ khối phổ, là
một thông tin đặc trưng cho (từng) phân tử. Tuy nhiên, đó là khi các thành
phần trong mẫu được phân tích độc lập với nhau. Nếu nhiều chất phân tích
đồng thời được tiêm vào thì việc giải phổ trở nên cực kì khó khăn.
LC-MS là một hệ thống thiết bị tập hợp vừa khả năng phân tách chất


Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS


15
- Chế độ quét (SCAN)
Khi thao tác với chế độ scan (quét), đầu dò sẽ nhận được tất cả các
mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình
phân tích. Chế độ này thường dùng để định danh hay phân tích khi chất phân
tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN
thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.
- Chế độ khảo sát ion chọn lọc (Selected Ion Monitoring – SIM)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion
đặc trưng cho chất cần xác định. SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa
chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư
viện có sẵn. Chế độ SIM có thể được dùng để định lượng; ví dụ, trong khoảng
khối từ 50 - 300 như trên, mảnh ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ
chọn riêng m/z 150 ra để định lượng. Có thể chọn được nhiều ion một lần, và
càng nhiều ion thì càng tốt về độ nhạy và độ chính xác. Đối với đầu dò khối
phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng
phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
- Chế độ khảo sát ion cô lập (Selected Reaction Monitoring – SRM) và
khảo sát đa ion cô lập (Multiple Reaction Monitoring – MRM)
Đối với khối phổ ba tứ cực – máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MSMS); 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và
MRM.
SRM là cô lập ion cần chọn để phân mảnh và cô lập 01 mảnh ion con
cần quan tâm trong các mảnh ion sinh ra, đưa vào đầu dò để phát hiện. Thực
tế, do yêu cầu kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan
tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM.
Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô

cùng bộ phân tích khối hỗn hợp tứ cực đã được sử dụng để ghi phổ khối của
16 độc tố CTXs ở chế độ ion dương [M+Na]+ và đã xác định cấu trúc hoá học
của chúng (Bảng 1.1). Kết quả phân tích phổ khối lượng bắn phá nguyên tử
nhanh có độ phân giải cao (HR-FABMS), độc tố CTX-4A và -4B có khối
lượng phân tử là 1061,6 đ.v.c., cường độ hấp phụ cao nhất ở bước sóng 226
nm (trong dung môi MeOH) [8]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (HNMR) COSY (đo phổ giữa proton của các nguyên tử C kế cận nhau) có thể


17
phân biệt giữa CTX-4A và -4B bằng sự khác biệt của độ dời hoá học
(chemical shift, ) của proton H-48 [9], [10], [11].
Bảng 1.1. Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng
phân tích bằng sắc ký khối phổ
Tên quy
ước

Ion phân tử
[M+H]+

Tên khác

Nguồn tự
nhiên

Nguồn tài
liệu

Pacific ciguatoxins
P-CTX-1


49-epiCTX-3C

CTX-3B

1023,6

Gambierdicus
[15]
toxicus

M-secoCTX-3C

1041,6

G. toxicus

[15]

CTX-3C

1023,6

G. toxicus

[15], [16]

2,3dihydroxy CTX-2A1
CTX-3C

1057,6


18

52-epiciguatoxin CTX-4A; GT-4A
-4B

1061.6

G. toxicus

[16], [18]

1141,6

Cá ăn thịt

[19], [20],
[21]

1141,6

Cá ăn thịt

[19], [20],
[21]

C-CTX1127

1127,6


1141,6

Cá ăn thịt

[22], [23]

I-CTX-2

1141,6

Cá ăn thịt

[22], [23]

I-CTX-3

1157,6

Cá ăn thịt

[22], [23]

I-CTX-4

1157,6

Cá ăn thịt

[22], [23]


Ngoài các ion chính, mỗi đồng phân này lại cho các mảnh ion [M+NH4]+ và
[M+Na]+. Ở đây, cũng ghi nhận là hệ dung môi MeCN:H2O bổ sung 1 nM
ammonium acetate cho kết quả tốt hơn so với bổ sung 0,1% TFA, và sử dụng
bơm hỗ trợ hệ HPLC-MS sẽ giúp tín hiệu ghi nhận tăng gấp 20 lần so với
HPLC-MS truyền thống [13]. Thành công chứng minh được đặc tính phân
mảnh này vô cùng hữu hiệu để xác định các đồng phân mới của độc tố CTXs.
Trong một công bố khác, HPLC-MS được ứng dụng để xác định đặc
tính của 12 đồng phân C-CTXs trong dịch chiết tinh sạch của loài cá Vẩu
Caranx latus [25]. Trong trường hợp này, bơm cao áp HP 3300 được kết nối
với đầu dò tứ cực API Qstar Pulsar (PE-Sciex). Ion tương ứng với [M+NH4]+,
[M+H]+ và [M+H-H2O]+ và [M+H-2H2O]+ được ghi nhận với cường độ nhất
khi formic acid được bổ sung vào dung dịch đệm. Ngược lại, khi dùng TFA,
hầu như thiếu vắng có mặt của phân tử ion [M+NH4]+. Ngoài ra, formic acid
luôn cải thiện đường nền và khối phổ thu nhận được cao gấp 5 lần so với
TFA. Kỹ thuật phân tách pha đảo trở nên hiệu quả hơn trên cột sắc ký Zorbax
C3 (2,1 × 150 mm, Agilent) so với cột Aquapore C18 RP 300 (1 × 50 mm),
đặc biệt là có thể phân tách được các đồng phân gần nhau. Với chế độ sắc ký
thay đổi nồng độ pha động (gradient) là hệ dung môi MeCN:H2O khi có và
không có mặt formic acid 0,1%; đã xác định được 05 đồng phân CTXs mới ở