ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------***--------------

Nguyễn Thị Thơi

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC
(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011
1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------***--------------

Nguyễn Thị Thơi

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC
(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)

Chuyên ngành: Hóa Học Hữu Cơ
Mã số: 60 44 27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Phan Minh Giang

(EP) …......................................................................................................................19
3.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (EP2)………………………………….19
3.4.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (EP3)............................................... …...19
7


3.4.4 Phân tách phần chiết nƣớc (EP4) ....................................................... …...20
3.5. Xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập ................................. …...22
Chƣơng 4: THỰC NGHIỆM............................................................................. …...31
4.1. Thiết bị và hóa chất ................................................................................. …...31
4.2. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................. …...32
4.3. Điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực .................................................. …...32
4.4. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EA………………………………32
4.4.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1) ....................... …...32
4.4.2. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2) .................. …...34
4.4.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3) ................... …...34
4.4.4. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EA4) ............................ …...34
4.5. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EP ........................................ …...35
4.5.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2) .................. …...35
4.5.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3)..................... …...36
4.5.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EP4) ............................ …...36
4.6. Phân tách sắc ký các phần chiết EA ........................................................ …...37
4.6.1 Phần chiết n-hexan (EA1) .................................................................. …...37
4.6.2 Phần chiết điclometan (EA2) ............................................................. …...38
4.6.3 Phần chiết etyl axetat (EA3) ............................................................... …...38
4.6.4 Phần chiết nƣớc (EA4) ....................................................................... …...39
4.7. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EA .. …...39
4.8. Phân tách sắc ký các phần chiết EP ........................................................ …...40
4.8.1 Phần chiết điclometan (EP2) .............................................................. …...40
4.8.2 Phần chiết etyl axetat (EP3) ............................................................... …...41


MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ
Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)
Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực
Bảng 2: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1)
Bảng 3: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2)
Bảng 4: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3)
Bảng 5: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EA4)
Bảng 6: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2)
Bảng 7: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3)
Bảng 8: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EP4)
Sơ đồ 1: Chiết và phân tách sắc ký phần thân cây Cỏ mực (EA)
Sơ đồ 2: Chiết và phân tách sắc ký phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP)

5


MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của Metyl gallat (II)
Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR và DEPT của Metyl gallat (II)
Phụ lục 3: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin I (III)
Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin I (III)
Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin I (III)
Phụ lục 6: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin II (IV)
Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin II (IV)
Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin II (IV)
Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của Norwedelolacton (V)
Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR và DEPT của Norwedelolacton (V)
Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của Hesperidin (VI)
Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR và DEPT của Hesperidin (VI)


Chƣơng 1:
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.) (Asteraceae)
1.1.1. Đặc điểm thực vật [1]
Họ Cúc (danh pháp khoa học: Asteraceae hay Compositae), còn gọi là họ Hướng
dương, họ Cúc tây, là một họ thực vật có hoa hai lá mầm. Họ Asteraceae phân bố rộng
khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới. Các chi
trong họ này được chia thành 13 tông. Chỉ có một trong số 13 tông này là Lactuceae, có
thể là có đủ khác biệt để có thể coi là một phân họ (phân họ Cichorioideae), các tông còn
lại, phần lớn là chồng ghép lẫn nhau, được đưa vào phân họ Asteroideae.
Các loài thuộc về họ Cúc có các đặc trưng sau: cụm hoa dạng đầu, bao
phấn hữu tính, tức là với các nhị hoa kết hợp lại với nhau tại các gờ của chúng bởi
các bao phấn, tạo thành ống, bầu nhụy với sự phân bổ cơ bản của các noãn hoa,
các noãn hoa trên một bầu nhụy, mào lông (chùm lông trên quả), quả là loại quả
bế (tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín).
Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.), họ Cúc (Asteraceae), có tên thông dụng
ở Việt Nam là Cỏ mực, Cỏ nhọ nồi, Nhọ nồi, hạn liên thảo, mặc hạn liên, kim lăng thảo.

Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)
10


Cỏ mực thuộc loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có
khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa. Thân màu lục hay màu nâu nhạt
hay hơi đỏ tía. Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5  1,2 cm. Mép lá nguyên hay
có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông. Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay
đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa. Qủa bế
dẹt có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm. Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá
rộng vì nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát.


C)2

CH=CH2


C
S

C-CH=CH2

CH3- (C

S

C)5-CH=CH2

2

3

Sau đó năm 1966, N. R. Krishnaswamy và cộng sự (Đại học Delhi, Ấn Độ)
đã xác định được cấu trúc của một polythienyl, α-terthienyl methanol (4) từ Eclipta
alba [5].
CH2OH
S

S

S

O

HO
R2O

R1 O

10
11

O

O

HO

OR2

R1=Me, R2=H
R1=R2=H

12

12

OH


Năm 1992: P. Sihgh và S. Bhagrava (Đại học Rajasthan, Ấn Độ) đã phân lập
được một hợp chất từ phần rễ Eclipta erecta [9].

H
OH

HO

HO

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OR

OR

14
16



HO

N

N

HO

18

21
R2

R2
N

N

HO
R1

HO
R1

19
22
24

R1=R2=H

O
R2

O

26

27
28
14

R1=OH, R2=OCH3
R1=OCH3, R2=OH


Năm 2008: M. K. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã
phân lập từ dịch chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata năm oleanan
tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất glycozit của 29, eclalbasaponin I
(30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III (32) và eclalbasaponin V (33) [6].
H3C
H3C

CH3
CH3

CH3

CH3

CH3

R1O

29

30
31
32
33

R1=H, R2=GlC
R1=H, R2=H
R1=GlC, R2=GlC
R1=SO3, R2=H

Năm 2011: Sáu hợp chất đã được S. Tewtrakul và cộng sự (Đại học Prince of
Songkla, Thái Lan) phân lập từ Eclipta prostrata là 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl angelat (35), 5hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và
wedelolacton (39) [13].

O

O
S

S

S

S
O


S

S

CHO

CH3

36

37
O

HO

HO

O

O

OH
OH

HO

O

O
HO

tính đáng chú ý của nghiên cứu này.

16


1.3.2 Hoạt tính kháng viêm của các terthienyl, orobol và wedelolacton
Phần chiết toàn cây Eclipta prostrata và các hợp chất terthienyl, 5hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl tiglat (34), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)terthienyl angelat (35), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl acetat (36), ecliptal
(37) cùng với falvonoit orobol (38) và coumestan wedelolacton (39) được phân lập
từ cây này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trong nghiên cứu ức chế sự
sản sinh nitơ oxit (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và TNF-α trong các tế bào
RAW264.7 gây bởi lipopolisaccarit (LPS) [13]. Orobol (38) đã được phát hiện là có
hoạt tính mạnh nhất với NO ở IC50 = 4,6 µm, các hợp chất 34, 35 và 37 cho các giá
trị IC50 lần lượt là 12,7, 14,9 và 19,1 µm. Hợp chất 38 ức chế PGE2 với IC50 = 49,6
µm trong khi không có hoạt tính với TNF-α với IC50 > 100 µm. Cơ chế tác dụng của
orbol đã được xác định là ức chế enzym iNOs và sự biểu hiện của COX-2 mRNA.
1.3.3 Hoạt tính kháng nấm của các ancaloit khung steroit
Các hợp chất ancaloit khung steroit (18-25) được phân lập từ lá cây Eclipta
alba ở Suriname đã được thử nghiệm với bốn chủng vi nấm Saccharomyces
cerevisiae và một chủng vi nấm Candida albicans [2]. Các hợp chất 19-21 và 25 có
hoạt tính kháng nấm mạnh nhất. Hợp chất 25 có khả năng kháng nấm Candida
albicans và giá trị MIC của hợp chất này (< 3,1 g/ml) chỉ hơi yếu hơn các thuốc
kháng nấm đang được sử dụng lâm sàng là amphotericin B và ketoconazole. Các
chất còn lại có khả năng yếu chống tế bào độc hại M-109. Các hợp chất này được
xác định là có hoạt tính chủ yếu là kháng nấm do thử nghiệm hoạt tính gây độc
dòng tế bào M-109 của tất cả các hợp chất này đều cho giá trị IC50 > 10 g/ml.
1.3.4 Hoạt tính chống tăng sinh của các tritecpenoit
Phần chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata đã được phân lập
theo định hướng hoạt tính chống tăng sinh của các tế bào HS (Hepatic Stellate) in
vitro [5]. Các tế bào HS được biết đến là có vai trò chìa khóa trong sự phát sinh
bệnh xơ hóa. Năm oleanan tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất

mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae);

-

Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết để định tính các phần chiết và xác
định các hệ dung môi sắc ký điều chế thích hợp với chất hấp phụ silica gel;

-

Phân tách sắc ký và phân lập các hợp chất thành phần chính đặc biệt là các
hợp chất phân cực bằng các phương pháp sắc ký điều chế;

-

Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập bằng phương pháp
phổ.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp
chất
Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp
chất, định hướng phân tách sắc ký, kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập sắc
ký, đặc trưng các hợp chất (TLC so sánh và co-TLC) và kiểm tra độ tinh khiết của
các hợp chất được phân lập.
Sắc kí cột thường (CC)
19


Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi và được

20


chuyển dịch hóa học . Các giá trị của độ chuyển dịch hóa học H và C trên các phổ
1

H-NMR và 13C-NMR cho các thông tin về các phần cấu trúc và các nhóm chức có

trong các phân tử được nghiên cứu. Các hằng số tương tác giữa các proton cho phép
nhận biết các proton liên kết với nhau từ đó có thể xây dựng được các phần của
phân tử. Phổ DEPT cho tính bội của các nguyên tử cacbon.
Các kỹ thuật phổ được sử dụng trong Luận văn:
Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS);
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR);
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT.

21


Chƣơng 3:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nguyên liệu cho nghiên cứu hóa học của Luận văn này là phần trên mặt đất
của cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) dùng làm thuốc được thu mua ở
Gia Lâm, Hà Nội.
Mẫu được lấy làm hai lần:
Lần 1 vào tháng 4 năm 2009: nguyên liệu là phần thân được tách khỏi lá.
Lần 2 vào tháng 6 năm 2010: nguyên liệu là cả phần trên mặt đất.
Các kết quả nghiên cứu sơ bộ phần trên mặt đất mẫu cây Cỏ mực được thu
thập lần 1 cho thấy:

hợp chất phân cực trong phần chiết nước.
Qui trình điều chế các phần chiết từ thân (EA) và phần trên mặt đất (EP) cây
Cỏ mực đượctrình bày tóm tắt trong các Sơ đồ 1 và Sơ đồ 2.
Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân cây Cỏ mực
STT

Phần chiết

1

n-hexan

2

điclometan

3

etyl axetat

4

nước

Kí hiệu

Khối lƣợng (g)

Hiệu suất (%)

Phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60F254
(TLC, Merck) với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton cho các phần chiết ít
phân cực (n-hexan và điclometan) và hệ ba dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic
cho phần chiết phân cực hơn etyl axetat.
Sự phân giải trên sắc kí lớp mỏng cho thấy phân tách sắc kí cột các phần
chiết này cần được thực hiện với sự rửa giải gradient.
23


3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1)
Phần chiết n-hexan (EA1) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên
silica gel với các hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1.
Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA1 theo độ phân cực từ
EA1.1 đến EA1.4 (n-hexan-axeton 19:1), EA1.5 (n-hexan-axeton 9:1), EA1.6 (nhexan-axeton 6:1), EA1.7 và EA1.8 (n-hexan-axeton 3:1) và EA1.9 (n-hexanaxeton 1:1).
Các nhóm phân đoạn chính từ EA1.2 đến EA1.5 (n-hexan-axeton 19:19:1)
được rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (chất I) dưới dạng các tinh thể hình kim
màu trắng. Như vậy β-sitosterol đã được phân lập là thành phần chính của phần
chiết EA1.
3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2)
Phần chiết điclometan (EA2) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với các hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton 6:1, 3:1, 2:1 và 1:1.
Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA2 theo độ phân
cực, từ EA2.1 đến EA2.4 (n-hexan-axeton 6:1), EA2.5 và EA2.6 (n-hexan-axeton
3:1), EA2.7 và EA2.8 (n-hexan-axeton 2:1) và EA2.9 (n-hexan-axeton 1:1).
Nhóm phân đoạn EA2.1 và EA2.2 (n-hexan-axeton 6:1) được rửa bằng nhexan cho β-sitosterol (I) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
3.3.4 Phân tách phần chiết etyl axetat (EA3)
Phần chiết etyl axetat (EA3) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1 và 10:19:1.
Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA3 theo độ phân cực thành
2 nhóm phân đoạn từ EA3.1 đến EA3.6 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1) và từ


EA2

EA3

EA4

2,7 g

1,3 g

3,4 g

3,4 g

CC, silica gel, n-hexan-axeton
19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1

EA1.1
0,4 g

EA1.2
0,9g

Rửa, n-hexan

I
10 mg

Ngâm với MeOH ở nhiệt độ phòng


CC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH
20:19:1, 10:19:1

EA3.3
0,51 g

EAT3.4-3.10

EA4.1-4.3

1,44 g

1,79 g

1. Sephadex, MeOH
2. Rửa CH2Cl2

Rửa, n-hexan

I
0,27 g

II
0,3 g

Diaion HP-20, 20%, 40%, 60%
MeOH-H2O

EA4.4