1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***
Nguyễn Thị Thơi NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC
(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Phan Minh Giang
Hà Nội – 2011
7

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU …….1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN …….2
1.1 Khái quát về Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.) (Asteraceae) …….2
1.1.1 Đặc điểm thực vật …….2
1.1.2 Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam …….3
1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata …….3
1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần …….8
Chƣơng 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU … 11
2.1. Nhiệm vụ của Luận văn … 11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu … 11
2.2.1 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất.11
2.2.2 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc … 14
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN … 14
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu … 14
3.2. Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực … 14
3.3. Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực … 15
3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực … 15
3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1) … 16
3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2) … 16

4.7. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EA … 39
4.8. Phân tách sắc ký các phần chiết EP … 40
4.8.1 Phần chiết điclometan (EP2) … 40
4.8.2 Phần chiết etyl axetat (EP3) … 41
4.8.3 Phần chiết nƣớc (EP4) … 41
4.9. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EP…… 42
KẾT LUẬN … 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO … 46

4

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng
CC (Column Chromatography): Sắc kí cột thường
FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh
Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế
1
H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton
13
C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon 13
DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Transfer): Phổ DEPT
ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi
điện tử



6

MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ
1
H-NMR của Metyl gallat (II)
Phụ lục 2: Phổ
13
C-NMR và DEPT của Metyl gallat (II)
Phụ lục 3: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin I (III)
Phụ lục 4: Phổ
1
H-NMR của Eclalbasaponin I (III)
Phụ lục 5: Phổ
13
C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin I (III)
9

LỜI MỞ ĐẦU
Trong các nghiên cứu y dược hiện đại các hợp chất thiên nhiên từ các cây
thuốc bao gồm các flavonoit, tecpenoit và ancoloit tiếp tục là nguồn cung cấp các
hợp chất có tiềm năng cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học. Eclipta prostrata L.,
syn. Eclipta alba L. (Asteraceae) là cây thuốc dùng phổ biến trong Y học cổ truyền
Việt Nam và một số nước trên thế giới. Các nghiên cứu hóa học các loài Eclipta
prostrata của Trung Quốc, Nhật Bản và Ấn Độ đã xác định được các nhóm hợp
chất tritecpen (oleanan và taraxastan) glycozit, các flavonoit, các coumarin, các
ancaloit-steroit và các thiophen polyacetylen trong các bộ phận của cây Eclipta
prostrata. Dựa trên các kiến thức dược lý học dân tộc và các hoạt tính sinh học của
các phần chiết nhiều hoạt chất có tác dụng chống ung thư, kháng viêm và chống
HIV của các chất được phân lập từ Eclipta prostrata đã được phát hiện.
Sự đa dạng về các nhóm cấu trúc lý thú của Eclipta prostrata, sự tương quan
của các cấu trúc này với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng và ý nghĩa khoa học và
thực tiễn của việc đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc Cỏ mực (Eclipta
prostrata L., Asteraceae) của Việt Nam đã thúc đẩy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu
một cách hệ thống về hóa thực vật của cây Cỏ mực. Luận văn này đặt mục tiêu
nghiên cứu phân lập sắc ký và xác định cấu trúc các thành phần hóa học đặc biệt là
các hợp chất phân cực từ phần trên mặt đất của cây Cỏ mực của Việt Nam. Các kết
quả nghiên cứu theo hướng này sẽ là các bước đầu tiên trong các chương trình hiện
đại hóa Y học cổ truyền Việt Nam. Các hợp chất phân cực chưa được xác định
trong một số nghiên cứu trước đã được phân lập trong nghiên cứu này sử dụng các
phương pháp sắc ký hiện đại.


Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)
11

Cỏ mực thuộc loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có
khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa. Thân màu lục hay màu nâu nhạt
hay hơi đỏ tía. Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5  1,2 cm. Mép lá nguyên hay
có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông. Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay
đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa. Qủa bế
dẹt có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm. Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá
rộng vì nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát.
1.1.2. Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam [1]
Cỏ mực được dùng để điều trị các bệnh như: nôn ra máu từ dạ dày, chảy máu
cam, đái ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột, lỵ, trẻ em suy
dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết
loét, bị thương, chảy máu, viêm da. Ngoài ra Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát
trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau
dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc.
Cách dùng: dùng tươi hay giã lấy nước uống, hoặc sao cháy đen với liều 15-
30 g sắc uống. Dùng riêng hoặc phối hợp với ngó sen, lá trắc bá. Trong trường hợp
sát trùng cũng dùng sắc uống hoặc giã tươi lấy nước uống, bã đắp. Có thể dùng tươi
xoa tay chữa rát do vôi, chữa nấm ngoài da và nhuộm tóc có màu tím đen.
Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc
tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt, mỗi ngày 1-3 ống (2 ml). Có nơi đã sản xuất thành
công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu.
1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata
Năm 1966: F. Bolhman và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức)
đã phân lập từ lá khô Eclipta alba 2 dẫn xuất thiophen 1 và 2 và polyacetylen 3 [5].
Năm 1985: T. R. Govindachari và M. S. Premila đã phân lập từ Eclipta alba
wedelolacton (10), norwedelolacton (11) và axit norwedelic (axit 5,6-dihydroxy-
2(2,4,6-trihydroxyphenyl)-benzofuran-3-carboxylic) (12) [4]. 10 R
1
=Me, R
2
=H 12
11 R
1
=R
2
=H

S S
C C-CH=CH
2
(C C)
5
-CH=CH
2
CH
3
-
S S S

13

Năm 1992: P. Sihgh và S. Bhagrava (Đại học Rajasthan, Ấn Độ) đã phân lập
được một hợp chất từ phần rễ Eclipta erecta [9].
13
Năm 1997: S. Yahara và cộng sự (Đại học Kumamoto, Nhật Bản) đã phân
lập từ cây khô Eclipta alba ở Trung Quốc bốn taraxastan triterpen glycozit, các
eclalbasaponin VII-IX (14-17) cùng với các eclalbasaponin I-VI. Cấu trúc của các
eclalbasaponin đã xác định được là 3β,20β,16β- và 3β,20β,28-trihydroxytaraxastan
glycozit và các saponin sulfat của chúng [15].

14 R=H 15 R=H
16 R=SO
3
H 17 R=SO
3

Năm 1998: M. S. Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã

2
-O
O-CH
2
O
O
14
18 21

19 R
1
=R
2
=H 20 R
1 26 27 R
1
=OH, R
2
=OCH
3

28 R
1
=OCH
3
, R
2
=OH
N
N
HO
HO
N
HO
R
1
R
2
N
HO

=H, R
2
=GlC
31 R
1
=H, R
2
=H
32 R
1
=GlC, R
2
=GlC
33 R
1
=SO
3
, R
2
=H

Năm 2011: Sáu hợp chất đã được S. Tewtrakul và cộng sự (Đại học Prince of
Songkla, Thái Lan) phân lập từ Eclipta prostrata là 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-
terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl angelat (35), 5-
hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và
wedelolacton (39) [13]. 34 35


2
H
3
C
CH
3
CH
3
OH
CH
3
HO
HO
HO
R
1
O
S
S S
O
CH
3
CH
3
O
S
S S
O
O CH
3

tính chống lại HIV-1 PR với IC
50
= 58,3 ± 0.8 µm, hợp chất 37 (IC
50
= 83,3 ± 1.6
µm) và hợp chất 36 (IC
50
= 93,7 ± 0,8 µm) trong khi các hợp chất 33, 38 và 39
không thể hiện hoạt tính (IC
50
> 100 µm). Các tác dụng ức chế HIV-1 IN của
wedelolacton, một dẫn xuất coumarin và orobol, một dẫn xuất isoflavon là các hoạt
tính đáng chú ý của nghiên cứu này. S S S
O CH
3
O
S
S S
CHO
OHO
OH O
OH
OH
O
O
HO
HO

orbol đã được xác định là ức chế enzym iNOs và sự biểu hiện của COX-2 mRNA.
1.3.3 Hoạt tính kháng nấm của các ancaloit khung steroit
Các hợp chất ancaloit khung steroit (18-25) được phân lập từ lá cây Eclipta
alba ở Suriname đã được thử nghiệm với bốn chủng vi nấm Saccharomyces
cerevisiae và một chủng vi nấm Candida albicans [2]. Các hợp chất 19-21 và 25 có
hoạt tính kháng nấm mạnh nhất. Hợp chất 25 có khả năng kháng nấm Candida
albicans và giá trị MIC của hợp chất này (< 3,1 g/ml) chỉ hơi yếu hơn các thuốc
kháng nấm đang được sử dụng lâm sàng là amphotericin B và ketoconazole. Các
chất còn lại có khả năng yếu chống tế bào độc hại M-109. Các hợp chất này được
xác định là có hoạt tính chủ yếu là kháng nấm do thử nghiệm hoạt tính gây độc
dòng tế bào M-109 của tất cả các hợp chất này đều cho giá trị IC
50
> 10 g/ml.
1.3.4 Hoạt tính chống tăng sinh của các tritecpenoit
Phần chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata đã được phân lập
theo định hướng hoạt tính chống tăng sinh của các tế bào HS (Hepatic Stellate) in
vitro [5]. Các tế bào HS được biết đến là có vai trò chìa khóa trong sự phát sinh
bệnh xơ hóa. Năm oleanan tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất
glycozit của 29, eclalbasaponin I (30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III
(32) và eclalbasaponin V (33) đã được phân lập. Axit echinocystic và
18

eclalbasaponin II đã được phát hiện là có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh của
các tế bào HS. Nghiên cứu đã cho thấy nhóm axit cacboxylic tự do ở vị trí C-28 của
các dẫn xuất glycozit của axit echinocystic đối với hoạt tính chống u xơ. Trên cơ sở
nghiên cứu này hoạt tính chống u xơ của Eclipta prostrata và các tritecpenoit thành
phần có thể cho giả thiết về triển vọng điều trị sự u xơ gan.

các nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học cây thuốc này của Việt Nam, đặc
biệt là về các hợp chất phân cực. Tiếp tục các hướng nghiên cứu hóa thực vật của
thế giới về E. prostrata, Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu các qui trình phân
tách sắc ký đặc biệt là đối với các hợp chất phân cực, phân lập các hợp chất thành
phần và xác định cấu trúc của chúng bằng các phương pháp phổ.
Các nhiệm vụ được đưa ra trong Luận văn này là:
- Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Cỏ
mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae);
- Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết để định tính các phần chiết và xác
định các hệ dung môi sắc ký điều chế thích hợp với chất hấp phụ silica gel;
- Phân tách sắc ký và phân lập các hợp chất thành phần chính đặc biệt là các
hợp chất phân cực bằng các phương pháp sắc ký điều chế;
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập bằng phương pháp
phổ.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp
chất
Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp
chất, định hướng phân tách sắc ký, kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập sắc
ký, đặc trưng các hợp chất (TLC so sánh và co-TLC) và kiểm tra độ tinh khiết của
các hợp chất được phân lập.
Sắc kí cột thường (CC)
20

Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi và được
sử dụng để phân tách các phần chiết phân lập các hợp chất thiên nhiên. Sắc ký cột
CC được thực hiện trên silica gel theo cơ chế sắc kí hấp phụ.
Sắc kí cột (CC) gradient trên nhựa polyme pha đảo có kích thước lỗ cao
Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals, Nhật Bản) theo cơ chế sắc ký phân bố được

21

chuyển dịch hóa học

. Các giá trị của độ chuyển dịch hóa học

H
và

C
trên các phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR cho các thông tin về các phần cấu trúc và các nhóm chức có
trong các phân tử được nghiên cứu. Các hằng số tương tác giữa các proton cho phép
nhận biết các proton liên kết với nhau từ đó có thể xây dựng được các phần của
phân tử. Phổ DEPT cho tính bội của các nguyên tử cacbon.
Các kỹ thuật phổ được sử dụng trong Luận văn:
Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS);
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (
1
H-NMR);
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (
13
C-NMR) với chương trình DEPT.


giống nhau qua phân tích TLC;
2) Các phần ít phân cực chứa chủ yếu là các sterol;
3) Có khả năng phân tách tiếp các hợp chất phân cực hơn từ phần trên mặt đất.
Phần trên mặt đất có thể là bộ phận chứa nhiều hoạt chất của cây thuốc này
do đó phần trên mặt đất cây Cỏ mực đã được thu thập lần 2 cho một nghiên cứu hệ
thống về các hợp chất phân cực trong cây Cỏ mực.
3.2. Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực
Phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợp
chất hữu cơ thuộc các lớp chất hữu cơ mong muốn. Trong Luận văn này nhằm đạt
được sự làm giàu sơ bộ các hợp chất theo độ phân cực trong các phân chiết riêng
biệt, nguyên liệu cây Cỏ mực được xử lý theo một qui trình chiết và phân tách hai
pha lỏng chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần.
Chiết hai pha rắn-lỏng: Bột nguyên liệu cây Cỏ mực (lần 1: phần thân
(phần trên mặt đất được tách lá); lần 2: phần trên mặt đất) được ngâm chiết với
metanol ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần trong 4 ngày). Các dịch chiết metanol
được lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở 50
o
C thu được phần chiết
metanol.
23

Phân tách hai pha lỏng: Để phân tách các hợp chất có trong phần chiết
metanol phần chiết này được hòa với nước cất cho một dịch nước của phần chiết
metanol. Chiết dịch nước này với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan,
điclometan và etyl axetat cho các dịch chiết trong n-hexan, điclometan và etyl
axetat. Cất loại kiệt dung môi các dịch chiết, thu được các phần chiết hữu cơ tương
ứng. Dịch chiết nước còn lại được cô kiệt dưới áp suất giảm cho phần chiết nước.
Qui trình này phân tách các hợp chất trong phần trên mặt đất cây Cỏ mực
thành nhóm các hợp chất ít phân cực trong các phần chiết n-hexan và điclometan,
nhóm các hợp chất phân cực trung bình trong phần chiết etyl axetat và nhóm các

0,57
EP3
4,90
0,14
4
nước
EA4
3,40
0,57
EP4
12,09
0,36

3.3. Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực
3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực
Phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60F
254

(TLC, Merck) với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton cho các phần chiết ít
phân cực (n-hexan và điclometan) và hệ ba dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic
cho phần chiết phân cực hơn etyl axetat.
Sự phân giải trên sắc kí lớp mỏng cho thấy phân tách sắc kí cột các phần
chiết này cần được thực hiện với sự rửa giải gradient.
24

3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1)
Phần chiết n-hexan (EA1) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên
silica gel với các hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1.
Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA1 theo độ phân cực từ
EA1.1 đến EA1.4 (n-hexan-axeton 19:1), EA1.5 (n-hexan-axeton 9:1), EA1.6 (n-

O thành 5 phân đoạn EA4.1
(H
2
O), EA4.2 (20% MeOH), EA4.3 (40% MeOH), EA4.4 (60% MeOH) và EA4.5
(MeOH).
Phân đoạn 60% MeOH-H
2
O (EA4.4) được phân tách sắc kí cột Sephadex
LH-20 với dung MeOH, sau đó bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel với các hệ dung
môi CH
2
Cl
2
-MeOH 9:1, 7:1 và 4:1 cho saponin tritecpenoit eclalbasaponin I (chất
III). Chất này còn được phân lập từ phân đoạn MeOH (EA4.5) qua phân tách sắc kí
cột (CC) trên silica gel với các hệ dung môi CH
2
Cl
2
-MeOH 9:1, 7:1 và 4:1.
Quy trình chiết và phân tách phần thân cây Eclipta prostrata (EA) được trình
bày trên Sơ đồ 1. 26
0,89 g
III
0,1 g
1. Ngâm với MeOH ở nhiệt độ phòng
2. Chiết với n-hexan, điclometan, etyl axetat
nước
CC, silica gel, n-hexan-axeton
19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1
CC, silica gel, n-hexan-axeton
6:1, 3:1, 2:1, 1:1
CC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH
20:19:1, 10:19:1

Diaion HP-20, 20%, 40%, 60%
MeOH-H
2
O
Rửa, n-hexan
1. Sephadex, MeOH
2. CC, silica gel CH
2
Cl
2
-MeOH 9:1, 7:1, 4:1
3. Rửa CH
2
Cl
2

1,2,3

0,5g
EA2.1-2.2
0,28 g
EA2.3-2.9
1 g
EA3.1-3.2
64 mg
EA3.3
0,51 g
EAT3.4-3.10
1,44 g
EA4.1-4.3
1,79 g

Trích đoạn Xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập

---