1

MỞ ĐẦ U
Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó
có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng.
Để hạ n chế sự lây lan củ a virus thự c vậ t , nhữ ng biệ n phá p truyề n thố ng đang đượ c
áp dng hi ện nay như loạ i bỏ nhữ ng cây bị bệ nh ngay khi mớ i phá t hiệ n , phun
thuố c diệ t môi giớ i truyề n bệ nh…t ỏ ra kém hiệ u quả l ại đò i hỏ i nhiề u thờ i gian ,
công sứ c và ả nh hưở ng xấ u tớ i môi trườ ng. Việ c tì m ra cá c biệ n pháp đ ngăn chn
sự phá t triể n và lây lan củ a virus gây b ệnh trên thự c vậ t đang là mộ t vấ n đề đượ c
quan tâm nghiên cứu. Sự phát trin mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong thời
gian gần đây thúc đẩy nhiều nghiên cứu theo hướng tạo giống cây trồng có khả
năng kháng virus gây hại bằng công nghệ gen, góp phần phát trin một xu thế mới
trong công cuộc phòng chống bệnh hại thực vật.
Cng với sự phát trin của công nghệ sinh học, đã có nhiề u ứ ng dụ ng sinh họ c
phân tử trong chọ n tạ o giố ng cây trồ ng khá ng virus , trong đó , công nghệ RNA
interference (RNAi) tỏ ra là một giải pháp hu hiệu nhất thông qua việc s dng
các vật liệu di truyền t virus gây bệnh chuyn vào cây trồng tạo cây chuyn gen
kháng chnh virus đó với hiệu quả có th lên tới 80-95%.
Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dng kỹ thuật RNAi
trong tạo giống cây trồng chuyn gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng
Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên
ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dng kỹ thuật RNAi trên mô hình cây
thuố c lá chuyn gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc
lá (TMV) hoc kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Nhằm tiếp tc phân tích các
đc tính di truyền của gen chuyn ở thế hệ sau, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Nghiên cứ u cá c phương phá p phân tí ch cây thuố c lá chuyể n gen khá ng
bệ nh khả m lá thế hệ T1” 2

 Virus không th phòng chống, tiêu diệt bằng x lí các chất hóa học như nhng
bệnh vi khuẩn, nấm và sâu bọ. Cách duy nhất đ loại bỏ virus là phải loại bỏ
nhng cây trồng bị bệnh.
1.1.2. Những thiệt hại của bệnh virus ở thực vật
Do virus có cấu trúc di truyền đơn giản, nên khả năng nhân lên và lây lan
trong tế bào vật chủ rất nhanh chóng và gây ra biu hiện bệnh trong thời gian ngắn.
Tác hại lớn nhất của virus là làm cho cây bị thoái hoá, giảm sức sống, dần tàn li.
Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản
phẩm nông nghiệp. Sản phẩm t cây bị nhim virus thường có chất lượng kém xa
so với cây trồng bình thường. Hạt lúa bị bệnh vàng li thường bị lép không cho thu
hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt thường rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi
ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn ci, lá khảm loang lổ, củ
khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng đều thấp. Citrus tristeza
virus hại cam quít rất nng tại vng bờ bin Địa Trung Hải, Trung Mỹ và Đông
Nam Á... Bệnh làm cho quả cam chn ép và rng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ,
nước cam nhạt không mi vị.
Việt Nam có chiều dài gần 2.000 km, kh hậu nhiệt đới gió ma do vậy cây
trồng, thảm thực vật Việt Nam và hệ sinh vật ở nước ta rất phong phú. Đây là điều
kiện đ bệnh virus ở Việt Nam đa dạng về chủng loại lại d lây lan, gây thiệt hại
nghiêm trọng tới sản xuất. Gây hại nghiêm trọng nhất có th k tới các virus gây
bệnh trên cây lúa (bảng 1.1). Trong lịch s trồng lúa ở nước ta đã xảy ra rất
nhiều trận dịch lớn vào các năm 1910, 1920, 1940 -1945, 1964 -1969, 2006-2010
đã tiêu huỷ mấy chc vạn ha lúa, tốc độ lây lan rất nhanh. Cây lúa bị bệnh lúc
đầu lá sẫm màu, sau đó cây lùn thấp lá xoè ngang, thâm lâu r đen, cây chết li
nhanh chóng. Bệnh có th xuất hiện t một vài m
2
sau đó lây lan ra hàng trăm,
hàng nghìn ha. Làm cánh đồng lúa t màu xanh biến thành màu nâu và chết li
trong vòng 10 -15 ngày sau khi phát hiện bệnh. Gạo thu được t lúa bị bệnh
thường có màu sẫm, đắng không ăn được. Do đó, thiệt hại của bệnh có th tính là

Bệ nh khả m Aucuba Potato Aucuba Mosaic Virus- PAMV
Dưa
chuộ t
Bệ nh khả m dưa chuộ t Cucumber Mosaic Virus- CMV
5

2.1.3 Biệ n phá p phò ng chố ng
Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng tr bệnh virus hại thực vật đã được áp
dng như loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng trung gian, diệt cỏ dại, luân canh
cây trồng, dng giống sạch bệnh hoc giống chống bệnh, chịu bệnh. Dựa vào đc
đim của tng loại virus gây hại và đc tnh cây trồng, người ta đã đề ra nhng
biện pháp phòng tr cho tng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại
của nguồn bệnh.
2.1.3.1 Sử dụng giống cây trồ ng có khả năng kháng bệnh virus
Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhim môi trường và tạo
được cây sạch bệnh. Tuy nhiên biệ n phá p g p nhiều hạn chế về số lượng giống
kháng bệnh cũng như nguồn vật liệu di truyền kháng virus phc v cho cho công
tác lai tạo giống. Hơn na, năng suất và chất lượng của giống kháng cũng là điều
đáng lưu tâm vì rất khó tích hợp được nhiều phẩm chất trong một giống cây trồng.
2.1.3.2 Sử dụng hạ t, giống cây trồ ng sạch bệnh
S dng nguồn vật liệu giống sạch bệnh được xem là biện pháp quan trọng
nhất đ hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng. Có th tạo nguồn hạt giống, củ,
cây giống sạch bệnh bằng nhng biện pháp như x lý củ/hạt bằng nhiệt hoc hóa
chất hoc nhân giống in vitro tạo củ hoc cây con sạch bệnh. Nhược đim của biện
pháp này là cá c loạ i cây trồ ng có thể bị nhiễ m virus trong quá trì nh canh tá c trên
đồ ng ruộ ng.
2.1.3.3 Biệ n phá p canh tá c

pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phương pháp này đã được áp dng tạo nhng
dòng cây chuyn gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và
sau đó là thực vật một lá mầm (xem tổng quan của Hull và Davies, 1992). Tuy vậy,
các cây chuyn gen này chỉ kháng được duy nhất một chủng virus mang gen mã
hóa protein vỏ mà nó chuyn vào. Điều này gây trở ngại trong việc phát trin các
giống cây trồng kháng virus dựa trên phương pháp CP do độ đa dạng của virus
thường khá cao (Scholthof et al., 1993). Tương tự như phương pháp CP, biu hiện
gen mã hóa cho enzyme liên quan tới quá trình tự sao chép hoc sao mã (các
replicase) cũng có th tạo các cây chuyn gen kháng virus. Cũng nghiên cứu trên
7

đối tượng TMV, Carr và cộng sự nhận thấy nhng dòng thuốc lá mang gen mã hóa
cho replicase có khối lượng phân t là 183kDa hoc 54kDa có khả năng kháng
TMV tốt hơn nhng dòng cây chuyn gen CP. Biu hiện replicase của virus khoai
tây X (potato virus X: PVX) hay virus khảm dưa chuột (cucumber mosaic virus:
CMV) chứng minh hiệu quả bảo vệ thực vật của phương pháp này (Braun và
Hemenway, 1992; Anderson và cộng sự, 1992). Tuy vậy, tương tự như phương
pháp CP, phương pháp bảo vệ qua trung gian gen replicase cũng chỉ có tác dng
trên tng chủng virus. Hơn na, gen mã hóa cho các replicase thường rất lớn, gây
trở ngại khi biu hiện trên thực vật. Nhằm khắc phc nhng hạn chế của cấu trúc
“dạng sense”, các cấu trúc dạng antisense mang một đoạn DNA có trình tự bổ sung
với RNA của virus có th ức chế sự phiên mã với nhng trình tự RNA tương đồng
đã được nghiên cứu và phát trin. Nhiều dòng thuốc lá, khoai tây, cà chua,…
kháng virus đã được tạo ra dựa trên kỹ thuật này.Việc s dng nhng đoạn DNA
thay vì cả đoạn gen mã hóa đã làm nhng dòng cây chuyn gen có khả năng kháng
với nhiều dòng virus thay vì chỉ một vài dòng nhất định (Boogart et al, 1998).
Cho tới nhng năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật
RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hu hiệu nhất trong việc chống lại các
bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt
động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở

Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyn gen kháng bệnh virus được
công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyn gen kháng bệnh đốm vòng
(papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc,
Philippine; B đao chuyn gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus,
Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận và
trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyn gen kháng Cucumber mosaic virus, được công
nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyn gen
kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm đ được công nhận là
giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyn gen kháng African cassava mosaic
virus (Begomovirus); Ngô chuyn gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus);
Khoai tây chuyn gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus),
Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyn gen
kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyn gen kháng Sweet
9

potato feathery mottle virus (Potyvirus)…. (Reddy et al, 2009).
2.1.4. RNAi v cơ ch kháng bệnh bng phƣơng pháp chuyn gen virus
RNAi là một cơ chế căn bản đ kim soát chui thông tin di truyền hay cách
vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và
Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998
RNAi (RNA interference) được coi như một phương thức min dịch tự nhiên
giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình
tự nucleotide tương đồng của chúng. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic
ngoại bào và nội bào, cũng nhờ điều khin sự biu hiện gen mã hóa protein. Nó
được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân t RNA mạch kép trong cơ th sinh
vật gây nên ức chế sự biu hiện gen của một loại trình tự đc hiệu.

Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi
Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân t RNA chui kép
(dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong nhng enzyme thuộc họ RNase III, tạo

RNAi trong tạo giống cây trồng chuyn gen chống lại các bệnh do virus gây ra.
Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS. Lê Trần Bình
và TS. Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành
công trong việc ứng dng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyn gen kháng virus .
Một trong nhng kết quả của đề tài cấp Viện KH &CN Việ t Nam đượ c tiế n hà nh
11

trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứ u ứ ng dụ ng kỹ thuậ t RNAi trong tạ o giố ng cây
trồ ng chuyể n gen khá ng bệ nh virus” là đã tạo được các cây thuốc lá chuyn gen
kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng
đồng thời cả 2 loại virus trên.

Hnh 1.2: Dng thuốc l T-CMV-49 biể u hiệ n khá ng bệ nh hoà n toà n và cây đố i
chứ ng WT2-1 sau 3 lầ n lây nhiễ m

Tiế p đó , đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả khá ng bệ nh
virus phổ rộ ng bằ ng chuyể n gen đa đoạ n” (KC.04.03/06-10) đã thiế t kế thà nh công
2 đoạ n gen nhân tạ o mang đa đoạ n gen CP , Nib và HC -pro củ a PRSV gây bệnh
đốm vòng trên cây đu đủ và 2 đoạ n gen đa đoạ n RdRp -CP-p20-p23 của virus tàn
li (Citrus tristeza virus, CTV) và thiết kế thành công nhng cấu trúc RNAi mang
các gen đa đoạn này . Thử nghiệ m tí nh khá ng vớ i cá c dò ng đu đủ và cam chuyể n
gen mang cấ u trúc RNAi trên cho thấy sự có mt của vir us gây bệ nh trên cá c dò ng
cây chuyể n gen nhưng không thấ y cây có biể u hiệ n bệ nh (Chu Hoà ng Hà , 2010).
12 Hnh 1.3: Dng đu đủ biể u hiệ n khá ng bệ nh hoà n toà n(hình A) v cây đối
chứ ng (hình B) sau 2 tháng lây nhiễm
Đây là cơ sở quan trọng chứng tỏ khả năng làm chủ công nghệ RNAi của các nhà
khoa họ c Việ t Nam và mở ra khả năng ứ ng dụ ng công nghệ RNAi đố i vớ i cá c đố i

virus gây ra ở cây thuố c lá lên đế n hà ng chụ c tỷ đồ ng (Nguyễ n Văn Chí n và
Nguyễ n Ngọ c Bí ch, 2008)
Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm lá do hai virus TMV và CMV
gây ra nó i riêng hiệ n vẫ n chưa có loại thuốc hóa học nào khả d có th phòng trị
đượ c mộ t cá ch hữ u hiệ u , do đó cá c biệ n phá p phò ng bệ nh tố t nhấ t là sử dụ ng cá c
hạt giống sạch bệnh đ trồng , không sử dụ ng cá c hạ t giố ng từ cá c ruộ ng trướ c đó
đã bị bệnh nói trên đ làm giống cho v sau . Thườ ng xuyên kiể m tra đồ ng ruộ ng
đ phát hiện và phun thuốc diệt tr các loại côn trng chch hút như bọ cách tơ, bọ
phấ n, rệ p muộ i…bằ ng cá c loạ i thuố c trừ sâu để trá nh lây lan . Khi phá t hiệ n cá c
triệ u chứ ng bệ nh trên đồ ng ruộ ng cầ n tậ p trung nhổ cây , đem ra khỏ i ruộ ng tiêu
hủy đ tránh lây lan.
2.2.3. Virus gây bệ nh khả m thuố c lá (Tobacco mosaic virus, TMV)
TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong nhng virus gây hại trên thực vật
được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886), Iwanowski (1892), Allard (1914) và
Stanley (1935) (Kung and Yang, 1998).
14

TMV là virus hình que có chiều dài 300 A
0
, đường kính t 150-170 A
0

có cấu tạohình ống rng và protein sắp xếp cuộn xoắn xung quanh lõi trung tâm.
TMV là virus đơn dương (ssRNA) có hình cuộn xoắn. Dạng que hoàn chỉnh của
TMV có 2130 đơn vị hợp thành capsid (capsomeres), cứ 6 capsomer tạo thành
một vòng xoắn. (Stryer Lubert, 1988). Genome của TMV gồm 6400 nucleotide
được chia thành 4 khung đọc mở (open reading frames- ORFs). RNA của TMV
có cấu trúc mũ 7-methylguanosine ở cuối đầu 5‟ (Zamore et al., 2000), nối tiếp
68 nucleotide không mã hóa trợ giúp quá trình dịch mã (Gallie et al., 1987). Tiếp
theo vùng này là hai vùng mã hóa cho các protein với kch thước tương ứng là

streak). Bệnh nng làm đầu lá bị khô và ngọn cà chua bị chết (Gibbs, 1999).
16

Chƣơng 2. VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U
2.1 Vậ t liệ u
2.1.1. Vậ t liệ u thƣ̣ c vậ t:
Hạt thuố c lá Nicotiana tabacum L. (giống K326) thế hệ T1 chuyể n gen mang cấ u
trúc TMV_RNAi do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học
cung cấp
2.1.2. Ha cht, máy mc, thiế t bị
- Hóa chất: Yeast extract, Agarose, K
2