Đề tài

"Nghiên cứu các
phương pháp phân
tích cây thuốc lá
chuyển gen kháng
bệnh khảm lá thế
hệ T1"
1

MỞ ĐẦ U
Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó
có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng.
Để hạ n chế sự lây lan củ a virus thự c vậ t , nhữ ng biệ n phá p truyề n thố ng đang đượ c
áp dng hi ện nay như loạ i bỏ nhữ ng cây bị bệ nh ngay khi mớ i phá t hiệ n , phun
thuố c diệ t môi giớ i truyề n bệ nh…t ỏ ra kém hiệ u quả l ại đò i hỏ i nhiề u thờ i gian ,
công sứ c và ả nh hưở ng xấ u tớ i môi trườ ng. Việ c tì m ra cá c biệ n pháp đ ngăn chn
sự phá t triể n và lây lan củ a virus gây b ệnh trên thự c vậ t đang là mộ t vấ n đề đượ c
quan tâm nghiên cứu. Sự phát trin mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong thời
gian gần đây thúc đẩy nhiều nghiên cứu theo hướng tạo giống cây trồng có khả
năng kháng virus gây hại bằng công nghệ gen, góp phần phát trin một xu thế mới
trong công cuộc phòng chống bệnh hại thực vật.
Cng với sự phát trin của công nghệ sinh học, đã có nhiề u ứ ng dụ ng sinh họ c

(PGS.TS Vũ Triệ u Mẫ n và PGS.TS Lê Lương Tề , 2002)
 Virus có cấ u tạ o rấ t đơn giả n : có hai phần chnh là li axit nucleic và vỏ protein
 Thông thườ ng virus thự c vậ t có vậ t chấ t di truyề n là RNA , mộ t số í t cò n lạ i c ó
vậ t chấ t di truyề n là DNA
 Virus là vi sinh vậ t kí sinh ở mứ c độ tế bà o . Virus thự c vậ t có thể nhiễ m bệ nh
cho mộ t hay nhiề u loà i cây , và mi loài cây có th nhim một hay nhiều loài
virus
 Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhim vào tế bào chủ
chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus s dng vật chất
của tế bào đ tạo thành một số virus con mới. Do vậy cơ th thực vật bị kiệt quệ
dần dần, thoái hóa và suy tàn có khi bị chết. Khoảng thời gian t lúc virus bắt
đầu xâm nhim đến khi cây thoái hóa và chết ph thuộc vào đc đim gây bệnh
của các loài khác nhau và ph thuộc vào tng loại cây cũng như sức chống chịu
của tng cây.
3

 Virus không th phòng chống, tiêu diệt bằng x lí các chất hóa học như nhng
bệnh vi khuẩn, nấm và sâu bọ. Cách duy nhất đ loại bỏ virus là phải loại bỏ
nhng cây trồng bị bệnh.
1.1.2. Những thiệt hại của bệnh virus ở thực vật
Do virus có cấu trúc di truyền đơn giản, nên khả năng nhân lên và lây lan
trong tế bào vật chủ rất nhanh chóng và gây ra biu hiện bệnh trong thời gian ngắn.
Tác hại lớn nhất của virus là làm cho cây bị thoái hoá, giảm sức sống, dần tàn li.
Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản
phẩm nông nghiệp. Sản phẩm t cây bị nhim virus thường có chất lượng kém xa
so với cây trồng bình thường. Hạt lúa bị bệnh vàng li thường bị lép không cho thu
hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt thường rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi
ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn ci, lá khảm loang lổ, củ
khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng đều thấp. Citrus tristeza
virus hại cam quít rất nng tại vng bờ bin Địa Trung Hải, Trung Mỹ và Đông


Bệ nh và ng lá tungro
Rice Tungro Sperical virus-RTSV
Bệ nh lú a cỏ
Rice Grassy Stunt Virus- RGSV
Bệ nh lù n xoăn lá
Rice Ragged Stunt Virus- RRSV
Bệ nh sọ c đen lù n
Rice Black Streaked Drap Virus- RBSDV
Ngô
Bệ nh khả m lá ngô
Maize Mosaic Virus- MMV
Bệ nh khả m lù n ngô
Maize Dawrf Mosaic Virus- MDMV
Cà chua
Bệ nh xoăn và ng lá cà chua
Tomato Yellow Leafcurl Virus- TYLV
Bệ nh đố m hé o cà chua
Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV
Bệ nh khả m lá cà chua
Tomato Mosaic Virus- ToMV
Khoai
tây
Bệ nh virus Y khoai tây
Potato Virus Y- PVY
Bệ nh virus A khoai tây
Potato Virus A- PVA
Bệ nh virus X khoai tây
Potato Virus X- PVX
Bệ nh virus S khoai tây

S dng nguồn vật liệu giống sạch bệnh được xem là biện pháp quan trọng
nhất đ hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng. Có th tạo nguồn hạt giống, củ,
cây giống sạch bệnh bằng nhng biện pháp như x lý củ/hạt bằng nhiệt hoc hóa
chất hoc nhân giống in vitro tạo củ hoc cây con sạch bệnh. Nhược đim của biện
pháp này là cá c loạ i cây trồ ng có thể bị nhiễ m virus trong quá trì nh canh tá c trên
đồ ng ruộ ng.
2.1.3.3 Biệ n phá p canh tá c
Luân canh và xen canh có th giảm bớt thiệt hại do sâu bệnh gây ra so với
trồng thuần một loại cây trồng . Mặ t hạ n chế củ a biệ n phá p nà y là rấ t khó chọ n
đượ c hệ thố ng luân canh và xen canh vừ a có hiệ u quả đố i vớ i mộ t số bệ nh quan
trọng mà vẫn đem lại lợi ch cao về mt kinh tế . Ma v thch hợp giúp giảm thiệt
hại do sâu bệnh gây ra mà còn giúp gia tăng năng suất rất đáng k . Gieo trồng
tránh mùa phát trin của côn trùng trung gian truyền bệnh (còn gọi là né bệnh) có
th hạn chế được một phần thiệt hại do virus gây ra.
6

2.1.3.4 Kim soát côn trng trung gian truyn bệnh v loại b các loại k
chủ trung gian nhƣ c dại ,… Hiện nay phổ biến nhất là dung các loại thuốc tr
sâu và diệt cỏ đ hạn chế các trung gian này. Tuy nhiên, nhiề u loạ i virus như TMV
lây truyề n qua đườ ng cơ giớ i, virus lây lan trự c tiế p qua khí khổ ng hoặ c vế t thương
trên vậ t chủ . Hơn nữ a, việ c lạ m dụ ng thuố c trừ sâu có thể gây ô nhiễ m môi trườ ng,
gây nguy hiể m cho nông dân và ngườ i tiêu dù ng . Bên cạ nh đó , virus có thể đượ c
lây nhiễ m vớ i số lượ ng rấ t í t môi giớ i truyề n bệ nh , v d: chỉ cần 1 con rầ y nâu /
cây lú a đã có thể truyề n virus lù n lú a cỏ (RGSV).
2.1.3.5 Biện pháp công nghệ sinh học: Trong 15 năm qua một số virus đã
có th kim soát được thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyn gen mang các gen
hoc đoạn gen có nguồn gốc t chính các virus gây bệnh (Reddy el al., 2009). Các
cấu trúc gen có nguồn gốc t virus gây bệnh được s dng chuyn vào cây trồng
đ tạo tính kháng có th là các loại khác nhau như: các cấu trúc của vius theo chiều
xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense) (Boogaart et al., 1998), các cấu trúc dạng

kháng virus đã được tạo ra dựa trên kỹ thuật này.Việc s dng nhng đoạn DNA
thay vì cả đoạn gen mã hóa đã làm nhng dòng cây chuyn gen có khả năng kháng
với nhiều dòng virus thay vì chỉ một vài dòng nhất định (Boogart et al, 1998).
Cho tới nhng năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật
RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hu hiệu nhất trong việc chống lại các
bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt
động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở
thực vật. Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector
chuyn gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyn mang cấu trúc RNAi
vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA
của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyn gen mang cấu trúc RNAi và kim
tra tính kháng virus của các cây chuyn gen (Tenllado et al., 2004). Tính hiệu quả
của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyn gen mã hoá protein của virus
(gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại
chnh virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong nhng nghiên cứu tạo cây
trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY (Waterhouse et al.,
1998; Smith et al., 2000), cucumber mosaic virus CMV (Kalantidis et al., 2002),
Plum pox potyvirus PPV (di Nicola-Negri et al., 2005), Tobacco mosaic virus
8

TMV và Potato virus Y PVY (Sun et al., 2005), , Tomato yellow leaf curl virus
TYLCV (Zrachya et al., 2007)Rice tungro bacilliform virus RTBV (Tyagi et al.,
2008) African cassava mosaic virus ACMV (Vanderschuren et al., 2009 )… Trong
nhng nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lp lại đảo
chiều thường được s dng đ chuyn vào cây và sẽ được biu hiện thành RNA sợi
đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyn gen t đó kch thch cơ
chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Người ta đã nhận thấy
rằng khi vng đệm của hpRNA được lp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì
kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất (Smith et al., 2000; Wesley et
al., 2001). Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyn

ngoại bào và nội bào, cũng nhờ điều khin sự biu hiện gen mã hóa protein. Nó
được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân t RNA mạch kép trong cơ th sinh
vật gây nên ức chế sự biu hiện gen của một loại trình tự đc hiệu.

Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi
Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân t RNA chui kép
(dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong nhng enzyme thuộc họ RNase III, tạo
thành các phân t RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26
nucleotide. Các siRNA này được giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp
protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC –
RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có
10

chứa RNase-H hoạt động nhờ một endonuclease sẽ tách siRNA thành nhng chui
RNA đơn, trong đó chỉ có một chui đơn RNA có đầu 5‟ có lực bắt cp base (base
pairing) nhỏ nhất được chọn đ tiếp tc đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu
nhận các phân t phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tương đồng với
trình tự của chui siRNA đang có mt trong phức hệ bằng cách bắt cp với các
base theo nguyên tắc bổ sung. Khi đã được nhận diện các mRNA nhanh chóng bị
cắt đứt ở khoảng gia của chui xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các
RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tc hình thành
các siRNA. Quá trình tiếp din liên tc nhờ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình
thành, kết quả là ức chế biu hiện của gen mong muốn.
2.1.5. Mộ t số thnh tựu của cây trng chuyn gen kháng virus ở Việt Nam
Virus là nguyên nhân gây hạ i tớ i nhiề u loạ i cây trồ ng trên thế giớ i cũ ng như ở
Việ t Nam. Hầ u hế t cá c bệ nh thự c vậ t do virus gây ra cho tớ i nay chưa có thuố c đặ c
trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mc tiêu nhiều nghiên cứu tại
nướ c ta. Từ năm 1999, phòng Công nghệ tế bào thực vật, việ n Công nghệ sinh họ c
phố i hợ p vớ i 5 nướ c trong khu vự c ASEAN tham gia và o chương trì nh nghiên cứ u
phát trin cây đu đủ chuyn gen kháng virus đốm vòng (Papaya ringspot virus :

12 Hnh 1.3: Dng đu đủ biể u hiệ n khá ng bệ nh hoà n toà n(hình A) v cây đối
chứ ng (hình B) sau 2 tháng lây nhiễm
Đây là cơ sở quan trọng chứng tỏ khả năng làm chủ công nghệ RNAi của các nhà
khoa họ c Việ t Nam và mở ra khả năng ứ ng dụ ng công nghệ RNAi đố i vớ i cá c đố i
tượ ng cây trồ ng khá c.
2.2. Cây thuố c lá - mô hì nh nghiên cƣ́ u tạ o cây trồ ng chuyể n gen khá ng virus
2.2.1 Giớ i thiệ u chung về cây thuố c lá
Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana sp; thuộc họ (Family) : Solanaceae
(họ cà), chi (Genus): Nicotiana, loài (Species): Nicotiana tabacum L.
Các nhà khoa học đã phân chia Nicotiana thành 3 chi phụ , 14 phân chi và 65
loài. Trong số 65 loài là cây bản địa Bắc và Nam Mỹ , 15 loài bản địa Australia
trong đó loài N. tabacum thuộ c phân chi Genuinae là đượ c gieo trồ ng thương mạ i
trên khắ p thế giớ i. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông
dân và thu nhập quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam
(Vinataba) trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu đạt 47.656 tỷ đồng, nộp ngân
sách nhà nước được 9.653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD,
việc làm của người lao động được đảm bảo, đời sống tng bước được nâng cao với
thu nhập bình quân đầu người tăng 15,59%/ năm. Thuốc lá có giá trị kinh tế cao,
ngoài việc tiêu dng trong nước nó còn là mt hàng xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra,
13

cây thuố c lá cò n đượ c coi là mô hì nh để tiế n hà nh nhiề u nghiên cứ u sinh họ c cơ
bản về chức năng , vai trò cũ ng như cơ chế hoạ t độ ng củ a cá c gen cũ ng như đượ c
sử dụ ng là m mô hì nh thử nghiệ m và phá t triể n nhữ ng nghiên cứ u ứng dng như
biể u hiệ n cá c protein tá i tổ hợ p có giá trị.
2.2.2. Tnh hnh bệnh virus hại thuốc lá
Hiệ n nay, bệ nh virus là mộ t trong nhữ ng nguyên nhân làm gi ảm năng suấ t và

TMV là virus đơn dương (ssRNA) có hình cuộn xoắn. Dạng que hoàn chỉnh của
TMV có 2130 đơn vị hợp thành capsid (capsomeres), cứ 6 capsomer tạo thành
một vòng xoắn. (Stryer Lubert, 1988). Genome của TMV gồm 6400 nucleotide
được chia thành 4 khung đọc mở (open reading frames- ORFs). RNA của TMV
có cấu trúc mũ 7-methylguanosine ở cuối đầu 5‟ (Zamore et al., 2000), nối tiếp
68 nucleotide không mã hóa trợ giúp quá trình dịch mã (Gallie et al., 1987). Tiếp
theo vùng này là hai vùng mã hóa cho các protein với kch thước tương ứng là
183kDa và 126 kDa (Goelet et al., 1982). Đây là protein có vai trò quan trọng
trong quá trình sao chép của virus. Vùng mã hóa thứ 3 mã hoá cho protein cần
thiết cho sự di chuyn qua gian bào của virus (Meishi et al., 1987) có khối lượng
phân t khoảng 30 kDa. Protein vỏ (CP) có khối lượng phân t 17,5kDa nằm
trong vùng mã hóa thứ 4.

Hình 1.4. Cấu trúc TMV và tổ chức hệ gen (Chapman, 1998)
Vị trí của các ORF của hệ gen RNA được biểu thị bởi các hình chữ nhật. Kích thước
của protein (kDa) tương ứng với các ORF trên được chỉ ra trong ngoặc. Vỏ protein với
kích thước 17,5 kDa được mã hoá bởi ORF thứ 4. Các đặc điểm của hệ gen và các
subgenomic được chú thích ở phía trên và bên dưới.
Gen CP của TMV theo sau vùng không dịch mã có chứa vài trình tự pseudoknot,
trình tự này liên quan đến sự tăng cường dịch mã (Leather et al., 1993). Tại đầu 3‟
của hệ gen RNA mang cấu trúc giống RNA vận chuyn (tRNA) có th được
aminoacyl hóa. CP là protein cần thiết cho quá trình hình thành virion và có th
điều khin sự lan truyền t tế bào này sang tế bào khác của virus (Saito et al.,
15

1990; Kawakami et al., 2004). Vai trò của gen CP cũng cho phép s dng gen CP
làm nguyên liệu cho tạo cây trồng chuyn gen kháng virus TMV bằng cơ chế bất
hoạt RNA (RNA interference) (Yan et al., 2007)
TMV có th gây bệnh ít nhất 199 loài trong 35 họ (Shew and Lucas,
1991) thực vật khác nhau nhưng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. Khi cây bị bệ nh

2.1.1. Vậ t liệ u thƣ̣ c vậ t:
Hạt thuố c lá Nicotiana tabacum L. (giống K326) thế hệ T1 chuyể n gen mang cấ u
trúc TMV_RNAi do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học
cung cấp
2.1.2. Ha cht, máy mc, thiế t bị
- Hóa chất: Yeast extract, Agarose, K
2
PO
4
, KH
2
PO
4
, SiC, HCl, NaOH, MgCl
2,
Etanol 70%, nướ c Javen, nướ c khử ion, kháng sinh kanamycin, Taq DNA
polymerase và cá c hó a chấ t thông dụ ng khá c
- Máy móc, thiế t bị : Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di
Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad,
Mỹ), máy chp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thy Đin), máy Vortex
(Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ),
máy ly tâm , cng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực
vậ t, Việ n Công nghệ Sinh họ c
2.2. Phƣơng phá p nghiên cứu
2.2.1. Khử trùng hạt thuốc lá
2.2.1.1. Khử trùng hạt bằng dung dịch Javel
Ngâm hạt trong cồn 70% khoảng 20‟‟, lắc nhẹ sau đó loại bỏ cồn bằng
pippet kh trùng. Ngâm hạt trong dung dịch tẩy (Javel thương phẩm 10-30% có bổ
sung Tween20 0,05-0,1%) khoảng 20‟ có lắc nhẹ. Sau khi loại bỏ dung dịch tẩy
bằng pippet, ra hạt 4-5 lần bằng nước cất kh trùng.

18

2.2.3.2. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với cp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri với trình tự như sau:
TMV-Fi: 5‟- CACCATGAAACCTTCACCACA-3‟
TMV-Ri: 5‟- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3‟
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước cất khử ion, khử trùng 10,1
2 Buffer PCR (NH
+
4
) 2
3 MgCl
2
2
4 dNTPs 1,6
5 Primer – Fi 0,8
6 Primer – Ri 0,8
7 Taq polymerase 0,2
8 Template 2,5
Tổng 20

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (
O
C) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Gắn mồi 50 1 phút 25

(Sigma).
- Dịch nghiền được ly tâm ở 5000 v/p, 4
o
C, 10 phút.
- Thu dịch nổi (gọi là kháng nguyên). T đa 96 giếng, bổ sung 200 l kháng
nguyên vào mi giếng và ủ 37
o
C khoảng 1 h.
- Sau khi, ra 3 lần với đệm PBST, kháng th (IgG) kháng CMV, TMV và
PVY được hòa tan vào đệm PBST theo tỷ lệ thch hợp, sẽ được bổ sung vào
nhng giếng có kháng nguyên và ủ 37
o
C trong 1 h.
- Đa được ra lại 3 lần trước khi thêm 200 l alkaline phosphatse-kết hợp
đoạn F(ab‟)
2
đã tinh sạch t IgG thỏ hòa tan 1:2000 trong bệm PBST chứa
0,1 % albumin bò.
20

- Đa được ủ một lần na ở 37
o
C trong 1 h. Sau khi ra, đệm nền (10 %
diethaolamine, 3 mM NaN
3
, pH 9,6) chứa 0,1 % disodium p-nitrophenyl
phosphate, được bổ sung vào các giếng và ủ ở nhiệt độ phòng 30-40 phút.
- Giá trị OD được đo ở 405 nm bởi một microplate reader. Phản ứng màu
được tạo ra bằng việc các mẫu kim tra được so sánh với giếng đối chứng
âm đã biết.

- Phân tí ch khả năng khá ng virus củ a cá c dò ng thuố c lá chuyể n gen ở thế hệ T1
bằ ng phương phá p lây nhiễ m nhân tạ o
- Đá nh giá sự tồ n tạ i củ a TMV trong dò ng thuố c lá chuyể n gen bằ ng phương
pháp ELISA
3.1. Phƣơng pháp khử trùng hạt thuốc lá
17 dòng T0 có tnh kháng virus cao được gi lại trồng trong nhà lưới sau khoảng 4
tháng tiến hành thu hoạch hạt t các dòng cây này và cho nảy mầm trong điều kiện
in vitro phc v cho nhng phân tích tiếp theo. Kh trùng hạt thuốc lá trước khi
đưa vào nuôi cấy in vitro gp một số khó khăn sau:
- Hạt thu trong điều kiện nhà lưới mang nhiều nấm mốc
- Kch thước hạt nhỏ nên khó thao tác, rất d mất một lượng lớn hạt trong quá
trình kh trùng
Do vậy lựa chọn phương pháp kh trùng thích hợp cho hạt không bi nhim nấm
mốc trở lại nhưng tỉ lệ nảy mầm cao là yêu cầu đầu tiên trong thí nghiệm của đề
tài. Dung dịch Javel thương phẩm và kh clo được s dng như 2 loại chất tẩy ra
22

khác nhau nhằm tìm kiếm phương pháp kh trùng cho tỉ lệ nhim thấp, tỉ lệ hạt
nảy mầm cao đồng thời không tốn thời gian thao tác thí nghiệm.
Bảng 3.1 Hiệu quả khử trùng hạt thuốc lá
Phƣơng pháp
Tỉ lệ nảy
mầm (%)
Tỉ lệ nhiễm
(%)
Tổng thời gian
khử trùng (h)
Thời gian
thao tác (h)
10%Javel /20ph

10%, 20% và 30% trong 20 phút cho thấy dung dịch 10% và 20% Javel thương
phẩm không th kh trùng hạt thuốc lá, tỉ lệ nhim lại đạt tới hơn 90%. Dung dịch
Javel 30% tỉ lệ nảy mầm hạt cao nhưng tỉ lệ mẫu bị nhim lại cũng giảm đáng k
(bảng 3.1). Thí nghiệm kh trùng bằng kh clo được tiến hành tương tự, 100 hạt
thuốc lá mi lô được đem vào kh trùng bằng luồng khí clo trong 3h, 6h và 9h. Đối
với thời gian kh trùng khí Clo 3h hạt vẫn nảy mầm nhưng không diệt được nấm
mốc, còn ở thời gian 9h nấm mốc không còn mọc trên môi trường nảy mầm na
nhưng hiệu quả nảy mầm khá thấp, chỉ còn t hơn 10%. X lí hạt bằng luồng khí
clo trong 6h cho hiệu suất nảy mầm cao nhất với 88%, tỉ lệ hạt nhim lại thấp nhất
(bảng 3.1). Cây con phát trin tốt sau khi kh trùng (hình 3.1). Như vậy, hạt thuốc
lá có th kh trùng hoàn toàn bằng dung dịch Javel 30% trong 15 phút hoc luồng
khí clo trong 6h. Tuy nhiên, x lí hat bằng kh clo có ưu thế về thời gian thao tác
khi chỉ mất khoảng na tiếng (bảng 3.1) mà vẫn đảm bảo lượng hạt còn lại sau kh
trùng tốt hơn.
23
A B
Hình 3.1: Hình ảnh hạt thuốc l (A) v cây con (B) trên môi trường nảy mầm theo phương
pháp khử trùng khí clo trong 6h.
3.2. Phân tích khả năng phân ly của gen chuyn
Trong qúa trình tái sinh cây chuyn gen, việc s dng các gen có khả năng chọn
lọc đi kèm với gen đch là hết sức cần thiết nhằm tách ra được số lượng ít ỏi các tế
bào chuyn gen trong vô số các tế bào không mang gen chuyn. Các gen kháng các
loại kháng sinh như kanamycine, hygromycine; kháng thuốc tr sâu, thuốc diệt cỏ
hoc mã hóa cho khả năng s dng một số loại đường như manose thường đươc s
dng làm gen chọn lọc trong quá trình chuyn gen ở thực vật. Trong nhng nghiên
cứu trước đây, vector RNAi TMV-CPi có bộ khung chứa gen nptII mã hóa cho gen
kháng kanamycin đã được chuyn vào giống thuốc lá K326 và thu được nhng

trường có bổ sung 50mg/l kanamycine và đánh giá tỷ lệ cây kháng/cây mẫn cảm
sau 4 tuần. Hai lô thí nghiệm đối chứng cũng được tiến hành song song. Lô thứ
nhất (WT-1) hạt thuốc lá K326 không chuyn gen được gieo trên môi trường MS
có bổ sung 50mg/l kanamycine và lô thứ 2 (WT-2) hạt được gieo trên môi trường
MS không có kháng sinh. Lô WT-1 vàng dần và chết sau 4 tuần ngược lại lô WT-2
cây con sinh trưởng và phát trin tốt. Nhng cây chuyn gen cũng có kiu hình
WT-2
WT-1
TMV2.6