BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ
MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS SH1

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1051110139

:TRẦN LÂM TÚ QUYÊN

Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


Đồ án tốt nghiệp


đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện.
TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện


Đồ án tốt nghiệp

Mở Đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật
có xương sống và không xương sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất
hoạt tính sinh học. Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành
y từ các sản phẩm tự nhiên (Amador và cộng sự. 2003). Kể từ khi phát hiện và
thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như
một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. các ứng
dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát
hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy
ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain và mevastatin) và tác nhân
chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin).
Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên được chiết
xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ cũng như từ vi sinh vật đã được sử dụng trong việc làm
thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm ,... Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên
đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng
phương pháp hóa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên
quy mô lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trường và
ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu
được quan tâm.
So với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh
vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự
nhiên và an toàn để sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý


Ý nghĩa khoa học

Tìm ra được môi trường nuôi cấy tốt nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất.
Thiết lập được điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều
nhất.
4.

Ý nhĩa thực tiễn

Prodigiosin là hợp chất thứ cấp vi sinh vật được nghiên cứu phát triển dược
phẩm nên được bán trên thị trường với giá rất cao. Thành công của đề tài sẽ góp
phần vào việc tìm được môi trường tốt nhất và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất
và ứng dụng hợp chất prodigiosin.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

1.1.1. Hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân tử
nhỏ, thường được gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ
sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trường xung quanh.
Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ quá

Đồ án tốt nghiệp

chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây
chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, được một số vi sinh vật (fungi,
actmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc
sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của
mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật.
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật
Vi sinh vật
Penicillium notatum,
Penicillium
chrysogenum

Streptomyces griceus

Steptomyces
venezuelae

4


Đồ án tốt nghiệp

Streptomyces
aureomycin

Streptomyces
erythraeus

Streptomyces fradiae

Hình 1.1. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin
Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin được tổng hợp
bởi Serrattia marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến
bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo, mà
cấu trúc của prodigiosin dần được nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000).

6


Đồ án tốt nghiệp

Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng
lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;
Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo
thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với
nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams,
1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được miêu tả là
tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).
Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước. Prodigiosin
có thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong
chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari
và cộng sự, 2006).
Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Loài

Serratia marcescens


tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009).
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng
một số vi khuẩn như: Staphylococcus
Bacillus subtilis, Enterococcus avium,
Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae, Bacillus cereus,... Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn của prodigiosin

8


Đồ án tốt nghiệp

đối với các vi khuẩn Gram dương lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram âm (Ramina
và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012).
1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư
Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng tế
bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng
sự,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này,
prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư.
Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu
tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7
hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mô hình khối u ác
tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách
nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này đã
cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thông qua
nhiều cơ chế.
Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin chủ
yếu là do ảnh hưởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính. Nhiều
nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của các tế bào
(Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin được mô

Đồ án tốt nghiệp

cả survivin và XIAP đều được giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong
tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007).
Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thư,
prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thư bằng cách gây ra quá trình ngừng
chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào. Để làm điều này,
undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế
CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tương tự như vậy, prodigiosin gây ra
ngừng tăng trưởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách
giảm phosphoryl hóa Rb thông qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2
và cyclin A-CDK2, cũng như bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và p27KIP1
(Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của Soto-Cerrato và
cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào cách
prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1.
Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu
dẫn đến sự tử vong do bệnh ung thư và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di căn.
Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã được chứng minh trong một mô hình
khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005). Cơ
chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế của nó trên
các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình down-regulation của
RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự, 2005).

Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng tế
bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng
trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế bào
cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng tế bào
(Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

11

Helvia và cộng sự (2010), đã tối ưu hóa quá trình sản xuất proodigiosin bởi
Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nước thải từ công nghiệp chế
o

biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28 C và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy
Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l.
Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất
prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của
prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu cho việc sản xuất prodigiosin trong
o

môi trường Nutrient broth là ở nhiệt độ 28 C, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và
quá trình chiết xuất prodigiosin được thực hiện bằng ethanol: hydrochloric acid
(9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận được có
tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.
Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng
khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như
Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa, prodigiosin
có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng
với việc không bị ảnh hưởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà có thể ứng dụng rộng
rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu.
Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất
prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trường
dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có
thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp.
San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản như một nguồn
carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011. Hơn nữa,
nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin có khả năng diệt côn
trùng.
Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ

14


Đồ án tốt nghiệp

một hệ thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi
khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là
một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di
truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã
hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống
nhân bản vector ở Escherichia coli cosmid đã được báo cáo (Dauenhauer và cộng
sự, 1984).
Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện trong
Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm),
mặc dù nó đã không được biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc
Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và cộng sự, 2000).
Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định bởi nhiều yếu tố,
bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR
(Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất
prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc
vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora, mặc dù sau này, việc
sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã được thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson
và cộng sự, 2000).
Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và
Streptomyces coelicolor và được bố trí trong pigA đến pigN, trong đó có năm gene
tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mô tả ở hình
1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại
(PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ
tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích
thước và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno và cộng sự, 2001).


16


Đồ án tốt nghiệp

sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành
phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều
prodigiosin hơn. Trên môi trường peanut broth thì prodigiosin có thể tổng hợp ở
o

nhiệt độ 37 C trong khi trên các môi trường như nutrient broth, peptone glycerol
broth có hoặc không có bổ sung đường cũng không thể làm được điều này
(Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các
loại đường metabolizable khác do sự giảm pH trong canh trường nuôi cấy Khanafari
và cộng sự, 2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá
trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là môi trường
này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose làm tăng cường
việc sản xuất sắc tố, trong trường hợp sử dụng môi trường sesame broth thì nguồn
carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose được thêm vào nutrient broth làm
tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trường nutrient broth hoặc peptone
glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố được tăng cường trong môi trường
o

o

peptone glycerol broth ở 30 C và trong nutrient broth ở 28 C, điều này có thể là do
sự hiện diện của glycerol như là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn
carbon giúp hỗ trợ tăng trưởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và

14
Prodigiosin được phân lập từ Serratia marcescens. Hiển thị kháng khuẩn, chống
ung thư, gây độc tế bào, ức chế miễn dịch, và chống các hoạt động đào thải trong
quá trình cấy ghép . Prodigiosin gây ra ức chế trong tế bào ung thư máu và các tế
bào có nguồn gốc từ các loại ung thư khác của con người, bao gồm cả dạ dày và đại

18


Đồ án tốt nghiệp

tràng không có độc tính đáng kể trong các dòng tế bào ác tính. Vì vậy, prodigiosin
được sản xuất mang tính thương mại trên toàn thế giới, điều đó được thể hiện trong
bảng 1.5.
Bảng 1.5. Giá trị thương mại prodigiosin trên thế giới (Santa Cruz Biotechnology,
Merck Millipore, Biovision incorporated)
ST
T

1

2

3


19


Đồ án tốt nghiệp