BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN
TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ

CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN
TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN NGUYỄN NGỌC THANH THẢO
BSTY. HOÀNG THANH HẢI
BSTY. LÊ HỒNG PHONG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007
iii

Nội dung:
Thực hiện 2 quy trình trypsin để tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi
và xác định tuổi phôi, quy trình tách tế bào thích hợp nhất.
Nuôi cấy, cấy chuyển và theo dõi sự phát triển của tế bào sơ cấp, tế bào thứ
cấp.
Thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà trong Nitơ lỏng.
Hồi phục và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản.

Các kết quả thu đƣợc:
Số lƣợng tế bào tách đƣợc từ phôi 9 và 10 ngày tuổi tƣơng đƣơng nhau và
cao hơn số tế bào tách đƣợc từ phôi 8 ngày tuổi.
Số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin lạnh (49,73 x 10
6
) cao hơn số tế
bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin ấm (25,51 x 10
6
).
Độ tuổi phôi và quy trình tách tế bào không ảnh hƣởng đến sự phát triển của
tế bào in vitro.
Tế bào xơ phôi gà thứ cấp có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro cao
hơn tế bào sơ cấp.
Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi bảo quản trong Nitơ lỏng 5 ngày có khả
năng bám và phát triển trên bề mặt bình nuôi cấy. v
SUMMARY

Graduating thesis topic: “IMPROVE THE PROCEDURE OF
HARVESTING AND FREEZING CEF CELLS”. The thesis was carried out at

more than those by warm trypsin process (25,51 x 10
6
).
The age of embryo and the trypsin process don’t affect the growth of in vitro
cells.
The secondary CEF cells can grow better than the primary CEF cells in in
vitro.
5
th
day after cryoprotection, the secondary CEF cells can attach to the
substrate and grow.

vi
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang bìa 1 ........................................................................................................... i
Trang bìa 2 .......................................................................................................... ii
Lời cảm ơn ......................................................................................................... iii
Tóm tắt tiếng Việt .............................................................................................. iv
Tóm tắt tiếng Anh ............................................................................................... v
Mục lục ............................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. ix
Danh sách các hình .............................................................................................. x
Danh sách các bảng ............................................................................................ xi
Danh sách các biểu đồ ........................................................................................ xi
Danh sách các sơ đồ ........................................................................................... xi
1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1
1.2. Mục đích ................................................................................................. 2

2.4.2. Tiến trình bảo quản lạnh tế bào .................................................... 21
2.4.3. Một số vấn đề có thể ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản ............... 22
2.5. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật ................................................ 22
2.5.1. Thiết lập hệ thống mô hình .......................................................... 23
2.5.2. Xét nghiệm độc tế bào ................................................................. 23
2.5.3. Nghiên cứu ung thƣ ...................................................................... 23
2.5.4. Virus học ...................................................................................... 23
2.5.5. Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào .............................................. 23
2.5.6. Chẩn đoán di truyền ..................................................................... 24
2.5.7. Kỹ thuật di truyền ........................................................................ 24
2.5.8. Liệu pháp gene ............................................................................. 25
2.5.9. Phát triển và chọn lọc thuốc ......................................................... 25
3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 26
viii
3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................ 26
3.1.1. Thời gian ...................................................................................... 26
3.1.2. Địa điểm ....................................................................................... 26
3.2. Vật liệu và hóa chất ............................................................................... 26
3.2.1. Đối tƣợng ..................................................................................... 26
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .................................................... 26
3.2.3. Các hóa chất và môi trƣờng ......................................................... 27
3.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 27
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 28
3.4.1. Kỹ thuật lấy phôi và tách mô ở phôi gà ....................................... 28
3.4.2. Phƣơng pháp tạo tế bào sơ cấp..................................................... 28
3.4.3. Phƣơng pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer ................. 29
3.4.4. Phƣơng pháp cấy chuyền tế bào................................................... 30
3.4.5. Phƣơng pháp bảo quản tế bào ...................................................... 31
3.4.6. Phƣơng pháp hồi phục tế bào ....................................................... 31
3.5. Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................... 31

Hình 2.4: Ống bảo quản tế bào.......................................................................... 21
Hình 2.5: Bình Nitơ lỏng bảo quản tế bào ........................................................ 22
Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer........................................................................ 29
Hình 3.2: Tế bào CEF trong buồng đếm ........................................................... 30
Hình 4.1: Tế bào sơ cấp sau 15 giờ nuôi cấy .................................................... 36
Hình 4.2: Tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp ................................................ 36
Hình 4.3: Tế bào thứ cấp phát triển đầy một lớp .............................................. 38
Hình 4.4: Tế bào xơ phôi gà sơ cấp sau khi hồi phục ....................................... 40
Hình 4.5: Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi hồi phục ..................................... 40

xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 4.1: Số tế bào sống trung bình thu đƣợc từ các tuổi phôi và các
phƣơng pháp tách tế bào ................................................................... 34
Bảng 4.2: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp
(giờ) .................................................................................................. 35
Bảng 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp
(giờ) .................................................................................................. 37
Bảng 4.4: Tỷ lệ tế bào sống sau khi phục hồi ................................................... 37 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1: Số lƣợng tế bào thu đƣợc từ các độ tuổi phôi và các
phƣơng pháp tách tế bào ............................................................. 33
Biểu đồ 4.2: Thời gian trung bình làm đầy một lớp của tế bào sơ cấp ............. 35
Biểu đồ 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào

dàng bám vào bề mặt bình nuôi cấy và môi trƣờng nuôi không cần nồng độ huyết
thanh cao nhƣ các dòng tế bào khác (ví dụ các tế bào tách từ phôi chuột, các dòng tế
bào ung thƣ…) (Phan Kim Ngọc, 2002). Do đó, việc sản xuất tế bào xơ phôi gà
trong điều kiện ở Việt Nam là hoàn toàn có khả năng thực hiện đƣợc nhằm phục vụ
cho chẩn đoán, sản xuất vaccine gia cầm trong tình hình hiện nay, cũng nhƣ làm
nền tảng cho những nghiên cứu sau này.
2
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đƣợc sự phân công của bộ môn Vi sinh-
Truyền nhiễm, khoa Chăn nuôi - Thú y, dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Trần Thị Bích
Liên, BSTY Hoàng Thanh Hải, BSTY Lê Hồng Phong, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài:
“Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà”.
1.2. Mục đích
Xây dựng quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà phù hợp với điều kiện tại Việt
Nam, từ đó mở rộng khả năng ứng dụng tế bào xơ phôi gà trong nghiên cứu, chẩn
đoán bệnh, sản xuất vaccine cho gia cầm.
1.3. Yêu cầu
- Tiến hành tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi bằng cách sử dụng hai quy
trình trypsin ấm và trypsin lạnh. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
- Khảo sát số lƣợng tế bào thu đƣợc, thời gian tạo một lớp tế bào và khả năng sống
của tế bào sau thời gian bảo quản tronng Nitơ lỏng. 3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


trypsin để tách tế bào từ bình nuôi cấy. Kỹ thuật này rất quan trọng khi cần thu
hoạch các dòng tế bào đang phát triển liên tục. Thứ ba là thông qua việc nuôi cấy tế
bào với các loại môi trƣờng khác nhau để tìm ra thành phần môi trƣờng thích hợp
nhất cho dòng tế bào đó.
Một đột phá có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động
vật thuộc về những nghiên cứu của Carrel (1913). Ông đã làm rất nhiều thí nghiệm
và cuối cùng ông đã đƣa ra một kết luận có tính chất mở đƣờng cho những thí
nghiệm tiếp theo của rất nhiều tác giả đƣơng thời: tế bào động vật hoàn toàn có thể
sống trong một khoảng thời gian dài trong điều kiện in vitro nếu ta thƣờng xuyên
cung cấp các chất dinh dƣỡng vô trùng cần thiết.
Đến năm 1948, bằng những kỹ thuật mới, Earle đã tiến hành phân lập các tế
bào và nuôi chúng trong những điều kiện môi trƣờng đặc biệt, tác giả đã thu nhận
đƣợc những dòng tế bào biệt lập. Kỹ thuật này mở ra khả năng tách tế bào của từng
loại mô và phát triển chúng trong những môi trƣờng nhân tạo.
Năm 1952, Gey đã tách tế bào ung thƣ ở ngƣời và nuôi chúng thành công.
Sau đó hai năm (1954), Levi – Moutalcini đã đi xa hơn trong nghiên cứu bằng cách
tìm hiểu ảnh hƣởng của những chất điều hòa sinh trƣởng lên sự phát triển của tế bào
trong nuôi cấy in vitro. Ông dùng yếu tố tăng trƣởng thần kinh (NGE – Nerve
Growth Factor) để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào thần kinh khi nuôi chúng in
vitro.
Những nghiên cứu sau này của Eagle (1955), Puck (1956), Temin và Rubin
(1958), Hayflick (1961), Littlefield (1964), Ham (1965), Kohler (1975), Sato
(1976), Wigler (1977) rất thành công trong những lĩnh vực cơ bản sau: 5
- Tìm ra đƣợc nhiều loại môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển in vitro của
nhiều loại mô khác nhau của ngƣời và động vật.
- Hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô động vật.
- Tạo ra đƣợc một số đột biến có ích.

Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme, hệ dịch quanh tế bào nhƣ ở
thực vật, chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận
những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài
hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế
bào có liên quan rất chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh. Do đó, việc điều
khiển trao đổi chất của tế bào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp.
Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dƣỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác
quá trình dinh dƣỡng tế bào trong cơ thể. Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình
trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập,
không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động
vật đƣợc thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt
động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào,
khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng nhƣ khả năng phân
chia tế bào.
Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hƣởng quyết định
đến kết quả:
- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào.
- Những yếu tố môi trƣờng quyết định đặc trƣng riêng biệt của tế bào.
Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hƣớng sản phẩm cuối, còn sự
hiểu biết về đặc trƣng riêng biệt giúp ta điều chỉnh (hay điều khiển) để tính trạng
đó đƣợc biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy.
Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát
triển của chính tế bào đó trong cơ thể. Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in 7
vitro là những tác động trực tiếp. Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này
không chỉ chịu tác động trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp. Do đó, mọi
tác động của môi trƣờng đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần
tạo ra sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào đƣợc nuôi cấy.

Đây là cơ chế kiềm hãm ngƣợc bởi sản phẩm cuối (negative feed – back).
Bất kỳ tế bào sinh vật nào cũng biểu hiện cơ chế này, điểm khác biệt của tế bào
động vật là ở chỗ quá trình tổng hợp sản phẩm thừa ít xảy ra và thƣờng thì các sản
phẩm trao đổi chất thoát ra khỏi tế bào rất chậm.
2.2.6. Khả năng tiếp nhận gene lạ
Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật đƣợc xem nhƣ một loại tế bào trần tự
nhiên. Chúng đƣợc bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trƣờng hợp chúng
tồn tại ở trạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (từ
virus…) hoặc khi cho những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần
nhau, sẽ xảy ra hiện tƣợng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai.
2.2.7. Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo
Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải đƣợc
bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ đƣợc những đặc tính
riêng của nó.
Bằng cách sử dụng Nitrogen lỏng (-196
0
C), tế bào động vật vẫn duy trì đƣợc
đặc tính của chúng trong thời gian rất dài. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng nhiều ở
các ngân hàng giống động vật trên thế giới.
Khi sử dụng, tế bào động vật đƣợc tiến hành giải đông và đƣợc hoạt hóa để
phục hồi khả năng tăng trƣởng và phân chia nhƣ trƣớc khi đem bảo quản.
Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trƣờng, rất
nhạy cảm với kim loại. Trong quá trình phát triển trong môi trƣờng nhân tạo, chúng
rất cần huyết thanh, hormone.
2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật
2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp
Định nghĩa: nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa
đƣợc tách ra từ mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002). 10
2.3.3. Hệ thống nuôi cấy tế bào
2.3.3.1. Nuôi cấy lớp đơn
Thƣờng sử dụng các dụng cụ nhƣ đĩa, bình T – flask, hệ thống trục xoay hay
vĩ nhiều giếng đƣợc xử lý cho nuôi cấy mô. Các dụng cụ này đƣợc chọn tùy vào số
lƣợng tế bào, bản chất môi trƣờng nuôi cấy, giá thành và thói quen của ngƣời sử
dụng.

Đĩa Bình T - flask

Trục xoay Vĩ nhiều giếng
Hình 2.2. Các dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn
(Nguồn:
www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_
culture.pdf)

2.3.3.2. Nuôi cấy huyền phù
Thƣờng đƣợc tiến hành trong:
- Bình có cánh quạt xoay từ hoặc bình lắc Erlenmeyer. Trong đó, tế bào đƣợc
giữ ở trạng thái huyền phù trong môi trƣờng. 11

Bình Erlenmeyer Bình có cánh quạt xoay
Hình 2.3. Các dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào
(Nguồn:
www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_

cách kết hợp những tế bào từ bố mẹ khác nhau, cho biểu hiện đặc điểm của cha
hoặc mẹ hoặc cả cha và mẹ. Kỹ thuật này đƣợc sử dụng để sản xuất kháng thể đơn
dòng theo mong muốn. Những tế bào lai này gọi là Hybridomas đƣợc kết hợp từ hai
tế bào khác nhau. Thứ nhất là một lympho bào lách (có khả năng sản xuất kháng thể
mong muốn). Thứ hai là một tế bào myeloma đang phân chia nhanh (một loại tế bào
ung thƣ). Kết quả, thể lai có thể sản xuất số lƣợng lớn kháng thể mong muốn.
Những kháng thể này gọi là kháng thể đơn dòng bởi sự tinh sạch của nó, ứng dụng
nhiều trong điều trị, chẩn đoán bệnh, và công nghiệp với giá trị hằng năm trên một
tỉ đô la.
2.3.5. Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy
Đặc điểm của những tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào nguồn gốc (gan, tim…)
và khả năng thích nghi của chúng với điều kiện môi trƣờng. Những marker hóa sinh
đƣợc sử dụng để kiểm tra xem tế bào có mang những đặc điểm chức năng mà chúng
có trong cơ thể sống hay không (ví dụ: tế bào gan tiết albumin). Những dấu hiệu
hình thái học hay siêu cấu trúc cũng có thể đƣợc xác định (chẳng hạn sự đập của tế
bào tim). Thông thƣờng, những đặc điểm này có thể thay đổi hoặc mất đi khi đặt tế
bào trong điều kiện nhân tạo.
Sau một số lần cấy chuyền nhất định, vài dòng tế bào sẽ ngừng phân chia và
biểu hiện sự hóa già. Những dòng tế bào này đƣợc gọi là “có hạn” (Finite); tế bào
CEF là một dòng tế bào có hạn và số lần phân chia của tế bào CEF là từ 16 – 18 lần
(Christman và ctv, 2006). Những dòng tế bào khác có thể phân chia không giới hạn
(hoặc trở thành bất tử) và đƣợc gọi là dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Line). 13
Khi một dòng tế bào “có hạn” bình thƣờng trở thành bất tử, nó trải qua một sự thay
đổi không thể đảo ngƣợc (Transformation). Nó có thể xảy ra tự phát hay do sử dụng
thuốc, bức xạ hay virus có chủ định. Những tế bào biến đổi thƣờng phát triển dễ
hơn và nhanh hơn, thƣờng có Chromosome lớn hoặc không bình thƣờng và có thể
phát triển trong dịch huyền phù.

14
 Môi trƣờng nuôi cấy là yếu tố phức tạp và quan trọng nhất để kiểm soát khả
năng làm tế bào phát triển tốt. Bên cạnh những đòi hỏi dinh dƣỡng cơ bản của tế
bào, môi trƣờng nuôi cấy phải có nhiều yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH và
áp suất, cung cấp các khí thiết yếu (O
2
và CO
2
). Thành phần dinh dƣỡng của môi
trƣờng nuôi cấy gồm amino acid, vitamine, khoáng và carbohydrate. Chúng cho
phép tế bào tạo ra những protein mới và các thành phần thiết yếu khác cho sự phát
triển và các hoạt động chức năng – tƣơng tự nhƣ sự cung cấp năng lƣợng cho trao
đổi chất.
Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không đƣợc tổng
hợp trong cơ thể nên cần phải đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Nhu cầu về
cysteine và tyrosine thay đổi khác nhau tùy theo dòng tế bào. Các amino acid không
cần thiết khác cũng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng để bù đắp cho những dòng tế bào
không có khả năng tổng hợp. Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào, hiện
nay, một số bằng chứng cho thấy glutamine đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi
cấy tế bào nhƣ nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon (trích dẫn bởi Nguyễn Đức
Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Vitamine: môi trƣờng MEM của Eagle (EMEM) chỉ có các vitamine
thuộc nhóm B, các vitamine từ nhóm khác sẽ đƣợc bổ sung từ huyết thanh. Khi tăng
thành phần môi trƣờng lên (mục đích để giảm lƣợng huyết thanh xuống) thì danh
sách các vitamine trong môi trƣờng cũng phải tăng theo. Khi giảm lƣợng huyết
thanh trong môi trƣờng thì việc bổ sung các vitamine khác ngoài những vitamine đã
có sẳn trong môi trƣờng là rất cần thiết. Khi mật độ tế bào trong môi trƣờng nuôi
cấy thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lƣợng vitamine cho dù
trong môi trƣờng đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chế về vitamine có ảnh
hƣởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trƣởng của tế bào hơn là trên mật độ tế