i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT THỬ NHANH
TRONG PHÂN TÍCH UREA
SVTH : TRỊNH THỊ THANH TÂM
MSSV : 60302440
CBHD : TS. TRẦN BÍCH LAM
BỘ MÔN KỸ THUẬT THỰC PHẨM
TP Hồ Chí Minh, 01/2008
N
N
H
H
A
A
Ä
Ä
N
N
X
X
E
E
Ù
Ù
T
T
C

Ö
Ô
Ô
Ù
Ù
N
N
G
G
D
D
A
A
Ã
Ã
N
N
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
N
N

Ù
Ù
O
O
V
V
I
I
E
E
Â
Â
N
N
P
P
H
H
A
A
Û
Û
N
N
B
B
I
I
E
E

Û
M
M
Ơ
Ơ
N
N

Trước hết, em xin gởi lời cám ơn đến thầy cô trường Đại học Bách Khoa, đặc biệt là
các thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu cho chúng em trong suốt gần năm năm ngồi trên ghế giảng đường đại học.
Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cô Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
em rất nhiều để em có thể hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn lớp HCTP03 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian
làm luận văn. Chúc các bạn luôn vui vẻ và thành công trong cuộc sống.
S
S
i
i
n
n
h
h
v
v
i
i
e
e
â

T
a
a
â
â
m
m
MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam
iii
M
M
U
U
Ï
Ï
C
C
L
L
U
U
Ï
Ï
C
C
Đ
Đ
E
E
À

G
B
B
Ì
Ì
A
A ................................................................................................................ i
L
L
Ơ
Ơ
Ø
Ø
I
I
C
C
A
A
Û
Û
M
M
Ơ
Ơ
N
N ................................................................................................................................ ii
M
M
U

H
H
H
Ì
Ì
N
N
H
H
V
V
E
E
Õ
Õ ........................................................................................................... vii
D
D
A
A
N
N
H
H
S
S
A
A
Ù
Ù
C

I
M
M
Ơ
Ơ
Û
Û
Đ
Đ
A
A
À
À
U
U ................................................................................................................................ 1
C
C
H
H
Ư
Ư
Ơ
Ơ
N
N
G
G
1
1 ................................................................................................................................... 2
1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5)................................................................................................ 3

1.5.5. Các nguồn phát sinh urea........................................................................................... 35
1.5.6. Các phương pháp xác đònh urea................................................................................. 39
1.6. Kit thử nhanh trong phân tích urea.................................................................................... 46
1.6.1. Tình hình các loại kit thử nhanh ở Việt Nam [52]..................................................... 46
1.6.2. Các loại kit phân tích urea ......................................................................................... 47
C
C
H
H
Ư
Ư
Ơ
Ơ
N
N
G
G
2
2 ................................................................................................................................. 50
2.1. Nguyên liệu........................................................................................................................ 51
2.1.1. Hóa chất...................................................................................................................... 51
2.1.2. Dụng cụ....................................................................................................................... 51
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 52
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................................ 52
2.2.2. Phương pháp tìm chất chỉ thò màu tối ưu ................................................................... 52
2.2.3. Phương pháp xác đònh lượng chất chỉ thò thích hợp cho lên kit................................. 54
2.2.4. Phương pháp chọn dung môi thích hợp dùng để pha urease..................................... 54
MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam
v
2.2.5. Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp................................................... 58

chuẩn

pH.............................................................................................................................. 76
3.5.1. Xác đònh khả năng phát hiện của kit ......................................................................... 76
3.5.2. Xây dựng thang màu bán đònh lượng urea................................................................. 77
3.5.3. Xây dựng đường chuẩn pH để đònh lượng urea .................................................... 78
3.6. Khảo sát thời gian hiện màu của kit ................................................................................. 83
3.7. Khảo sát thời gian sử dụng của kit.................................................................................... 85
3.8. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực...................................................... 87
3.8.1. Sữa............................................................................................................................... 87
MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam
vi
3.8.2. Nước mắm................................................................................................................... 89
3.8.3. Thủy sản...................................................................................................................... 90
C
C
H
H
Ư
Ư
Ơ
Ơ
N
N
G
G
4
4 ................................................................................................................................. 95
4.1. Kết luận.............................................................................................................................. 96
4.2. Kiến nghò:........................................................................................................................... 97

A
A
Û
Û
O
O............................................................................................................ 98
DANH SÁCH HÌNH VẼ GVHD: TS. Trần Bích Lam
vii
D
D
A
A
N
N
H
H
S
S
A
A
Ù
Ù
C
C
H
H
H
H
Ì
Ì

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Hình 3.1: Màu sắc của chỉ thò trong nước cất (pH = 6.5) ........................................................... 64
Hình 3.2: Màu sắc của chỉ thò trong nước máy (pH = 6.8) ......................................................... 64
Hình 3.3: Vò trí chất chỉ thò và enzyme urease trên kit ................................................................ 66
DANH SÁCH HÌNH VẼ GVHD: TS. Trần Bích Lam
viii
Hình 3.4: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau trước khi nhúng dung dòch urea........ 66
Hình 3.5: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò PR trên kit sau khi nhúng urea................................. 66
Hình 3.6: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau sau khi nhúng dung dòch urea 2% .... 67
Hình 3.7: Kit thử sau khi dung dòch urea chạy hết kit ................................................................. 67
Hình 3.8: Kit thử trắng sau khi dung dòch urea chạy hết kit........................................................ 68
Hình 3.9: Đồ thò NH
3
chuẩn dùng để xác đònh hoạt tính urease ................................................. 69
Hình 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt tính urease trong các loại dung môi....................................... 71
Hình 3.11: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 30µl urease 4% trong dung dòch urea ở
các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm................................................ 74
Hình 3.12: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 60µl urease 4% trong dung dòch urea ở
các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm, 5 – 400ppm, 6 – 200ppm, 7 –
100ppm, 8 – 50ppm....................................................................................................................... 75
Hình 3.13: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea ở các nồng
độ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 40ppm, 4 – 30ppm, 5 – 20ppm, 6 – 10ppm, 7 – 5ppm................ 76
Hình 3.14: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea ở các nồng
độ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 100ppm, 4 – 200ppm, 5 – 400ppm, 6 – 600ppm, 7 – 800ppm, 8 –
1000ppm ........................................................................................................................................ 77
Hình 3.15: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea 0.5% và 1%78
Hình 3.16: Các bước đònh tính sự có mặt urea trong mẫu thử .................................................... 78
Hình 3.17: Đồ thò đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong nước... 80
Hình 3.18: Đồ thò đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong nước
mắm ............................................................................................................................................... 81

Û
Û
N
N
G
G
B
B
I
I
E
E
Å
Å
U
U
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Bảng 1.1: Thành phần amino acid của urease đậu nành và đậu rựa ........................................... 5
Bảng 1.2: K
m
và v
max
của enzyme urease...................................................................................... 13
Bảng 1.3: Giá trò pH
opt
ở các loại đệm ........................................................................................ 14
Bảng 1.4: Ảnh hưởng của các ion lên hoạt tính urease............................................................... 18
Bảng 1.6: Hàm lượng urease trong các loại đậu......................................................................... 25
Bảng 1.7: Các phương pháp để xác đònh hoạt tính enzyme......................................................... 28
Bảng 1.8: Tính chất hóa lý của urea............................................................................................ 33

khi tăng số lần chấm urease lên kit.............................................................................................. 74
Bảng 3.8: Khảo sát khả năng phát hiện của kit khi thay đổi lượng urease/kit ........................... 75
Bảng 3.9: Các thông số chế tạo của kit ....................................................................................... 76
Bảng 3.10: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong các dung dòch urea có nồng độ thấp ... 77
Bảng 3.11: Khảo sát sự thay đổi pH của dung dòch urea trước và sau khi cho urease .............. 79
Bảng 3.12: Khảo sát sự thay đổi pH của nước mắm chứa urea trước và sau khi cho urease .... 80
Bảng 3.14: Khảo sát sự thay đổi pH của sữa chứa urea trước và sau khi cho urease ............... 82
Bảng 3.15: Khảo sát thời gian hiện màu của kit.......................................................................... 84
Bảng 3.16: Khảo sát hoạt tính của urease trên kit theo thời gian .............................................. 86
Bảng 3.17: Khảo sát sự có mặt của urea trong sữa..................................................................... 88
Bảng 3.18: Khảo sát sự thay đổi pH của các mẫu nước mắm .................................................... 90
Bảng 3.19: Khảo sát khả năng phát hiện urea của kit trong thủy sản ....................................... 93
LỜI MỞ ĐẦU GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 1
L
L
Ơ
Ơ
Ø
Ø
I
I
M
M
Ơ
Ơ
Û
Û
Đ
Đ

Nội dung nghiên cứu gồm 2 phần chính:
 Chế tạo kit thử nhanh dùng để phân tích urea dựa trên nguyên tắc sử dụng enzyme
urease để thủy phân đặc hiệu urea.
 Ứng dụng kit thử để phân tích urea trong các mẫu thực.
CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam
Trang 2
C
C
H
H
Ö
Ö
Ô
Ô
N
N
G
G
1
1
TOÅNG QUAN
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 3
1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5)
1.1.1. Danh pháp quốc tế và phân loại [2]
 Danh pháp:
Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase tức là enzyme xúc tác cho quá trình
thủy phân urea thành ammonia và khí cacbonic theo phương trình phản ứng sau:
 Phân loại:
Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5 trong

như đã nói ở trên.
Bảng 1.1: Thành phần amino acid của urease đậu nành và đậu rựa [17]
a – Dữ liệu do Joseph và Evelyn khảo sát
b – Dữ liệu để so sánh (do Staples và Reithel khảo sát).
Enzyme urease có cấu trúc bậc 4. Theo nghiên cứu của Kunio TAKISHIMA, Tatsuko
SUGA, Gunji MAMIYA (1988), enzyme urease đậu rựa có 840 acid amine. Khối lượng phân
tử tương đối của 1 tiểu đơn vò protein là 90770 Da, từ đó suy ra phân tử urease gồm có 6 tiểu
đơn vò. Có 13 trong số 25 histidine nằm tập trung trong vùng acid amine 479 đến 607 do đó
vùng này có thể chứa nikel. Cys-592, acid amine cần thiết cho hoạt tính của enzyme cũng
nằm trong vùng giàu histidine này. [23]
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 6
Hình 1.3: Cấu trúc của enzyme urease
1.1.3. Tính chất hóa lý của enzyme urease
Theo Sumner, các tinh thể urease hòa tan dễ dàng trong dung dòch ammonia loãng và
dung dòch kiềm loãng, có thể hòa tan hoặc đông tụ trong dung dòch muối loãng và acid hữu cơ
tùy thuộc nồng độ acid. [37]
Sumner và Hand đã xác đònh được điểm đẳng điện của urease nằm trong khoảng pH =
5.0 – 5.1. Tại điểm đẳng điện, độ hòa tan của urease là cực nhỏ.
Urease cũng mang những đặc tính của protein như:
 Tan trong nước và dung dòch muối loãng.
 Không đi qua được màng thẩm tích vì có kích thước phân tử lớn.
 Tan khi có lớp áo nước và tích điện, tủa khi mất lớp áo nước và trung tính.
 Bò biến tính dưới tác dụng của các yếu tố như acid, kiềm đặc, các ion kim loại nặng và
nhiệt độ cao…Khi đó, urease mất tính xúc tác sinh học, mất khả năng hòa tan trong
nước, mất khả năng kết tinh và các tính chất hóa lý khác nhau (độ nhớt, sức căng bề
mặt…), biến đổi hình dạng và kích thước, dễ bò phân hủy bởi protease.
 Dễ bò tủa thuận nghòch trong các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone…hoặc muối
ammonium sulfate, sodium chloride.
 Tính chất hóa lý của enzyme có thể thay đổi khi kết hợp với một số chất như cơ chất,

Tuy nhiên urease có các nguồn gốc khác nhau như urease từ vi khuẩn Bacillus pasteurii
trong trung tâm hoạt động chứa ion kim loại Zn
2+
[31], còn ở Klebsiella aerogenes có cofactor
là Cu
2+
[36] như hình bên dưới:
Hình 1.5: Urease từ K.aerogenes và từ Bacillus pasterrii
Ở pH trung tính, EDTA có thể được sử dụng để bảo vệ enzyme khỏi các kim loại tạp trong
quá trình tinh sạch. Tuy nhiên, ở pH thấp (3.6 – 4.0), EDTA có thể không những thúc đẩy sự
mất Ni mà còn ức chế không thuận nghòch hoạt tính của enzyme. [11]
Ngoài ra, trong trung tâm hoạt động của urease còn chứa nhóm –SH, bằng chứng là hoạt
tính urease bò ức chế khi các nhóm –SH bò khóa.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 9
1.1.5. Cơ chế xúc tác
Năm 1913, hai nhà khoa học Leonom Michaelis và Maud Menten đưa ra mô hình động
học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme. Theo mô hình này, enzyme và cơ chất sẽ
kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất (ES). Phức hợp ES sẽ lại được chuyển
hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E). Enzyme được giải phóng lại
thực hiện những phản ứng mới. [2]
Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động (TTHĐ) của enzyme có liên quan đến cơ chất
và quan điểm được nhiều nhà khoa học chấp nhận là thuyết trung tâm hoạt động của
Koshland. Theo thuyết này, trung tâm hoạt động của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác
động cảm ứng của cơ chất, đònh hướng thích hợp để cơ chất gắn chính xác vào và thực hiện
quá trình xúc tác.
Hình 1.6: Cơ chế xúc tác của enzyme
Đối với enzyme urease, cơ chế của quá trình xúc tác phản ứng theo phương trình:
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 10

 Dihydroxyurea
 N – Benzoylphosphoric triamide
 Phosphoramidate (hình 1.a)
 Diamidophosphate (hình 1.b)
 Phosphoric triamide (hình 1.c)
 Phenyl phosphorodiamidate (Ar = Ph, PPD) (hình 1.d)
 N-(3-methyl-2-butenyl)phosphoric triamide (Alk = (H
3
C)2C=CH, MBPT) (hình 1.e)
Trong đó urea là cơ chất đặc hiệu của urease với năng lượng hoạt hóa là 8700 hoặc
11700 calories/g.mol ở 25
o
C còn đối với các cơ chất như hydroxyurea hoặc dihydroxyurea thì
vận tốc nhỏ hơn 120 lần. Phân tử urea rất bền. Trong khoảng pH = 2 – 12, sự phân hủy urea
không enzyme trong dung dòch không phụ thuộc pH và có chu kỳ bán hủy là 3.6 năm ở 38
o
C.
Người ta chứng minh rằng phản ứng này là phản ứng khử mà sản phẩm duy nhất là ammonia
và acid cyanic. Tốc độ khử tăng khi pH > 12 và giảm khi pH < 2. Nếu có sự tham gia của
enzyme, enzyme sẽ chuyển phản ứng khử thành phản ứng thủy phân và điều này nói lên vai
trò quan trọng của Ni
2+
như 1 acid Lewis trong tính chất hóa học của urease. Hay nói cách
khác enzyme đã chống lại sự phân hủy và tạo điều kiện cho urea bò nước hay ion OH
–
tấn
công để tạo ra carbamate.
Hình 1.8: Công thức cấu tạo của một số cơ chất chứa phospho của urease
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 12

max
K
]S[v
v

 . Như vậy, ở nồng độ cơ chất thấp, v phụ thuộc tuyến
tính vào [S].
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 13
 Nếu [S] >> K
m
thì: v = v
max
: tức vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc [S].
Như vậy [S] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], v cũng không tăng theo.
 Nếu [S] = K
m
thì v = v
max
/2: vận tốc phản ứng bằng nửa vận tốc cực đại. Hoặc ta cũng
có thể xác đònh K
m
và V
max
theo phương trình được viết lại từ phương trình trên như
sau:
]S[
1
v
K

(mol/l) v
max
Đậu nành
7.0 25 Phosphate 19×10
-3
10.5×10
-6
(mol/l/s)
Đậu nành
7.0 25 Sulfite 476×10
-3
37×10
-6
(mol/l/s)
Đậu nành
7.0 25 Thiosulfate 56×10
-3
17.2×10
-6
(mol/l/s)
1.1.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Giống như phản ứng hóa học, khi nhiệt độ tăng, vận tốc chuyển động của các phân tử
tăng, sự tiếp xúc giữa các phân tử cũng tăng nên vận tốc phản ứng tăng. Tuy nhiên do bản
chất enzyme là protein nên nhiệt độ cao sẽ làm biến tính protein, enzyme mất hoạt tính [1].
Do đó, mỗi enzyme sẽ tồn tại một nhiệt độ mà ở đó hoạt tính cao nhất, gọi là nhiệt độ tối thích
t
opt
. Theo các nghiên cứu từ đậu rựa (jack bean) thì nhiệt độ t
opt
vào khoảng 45-50